Bu makalenin amacı, monomerik Alfa-synuclein, sonraki kalite kontrol ve önceden biçimlendirilmiş liflerinde in vivo kullanımı liflerinde nesil için gerekli adımları özetlemesidir.
Synucleinopati in vivo Alfa-synuclein önceden biçimlendirilmiş Fibril (α-SYN PFF) modeli kullanımı Parkinson hastalığı synucleinopati ve nigrostriyatal dejenerasyon modeli amaçlayan araştırmacılar arasında popülerlik kazanıyor. Tutarlı ve güçlü α-SYN patolojisini sağlamak için α-SYN PFF Generation ve in vivo uygulamasının standardizasyonu önemlidir. Burada, monomerik α-SYN, fibrilasyon sonrası kalite kontrol adımlarından liflerin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz ve α-SYN PFFs ‘larının fare veya fareler içine başarılı Nöroşirürji enjeksiyonu için önerilen parametreler. Monomerik α-SYN ile başlayarak, en iyi tampon koşullarında, konsantrasyon ve sıcaklığa sıkışırken 7 günlük kuluçken döneminde fibrilasyon meydana gelir. Fibrilasyon sonrası kalite kontrolü, sedimentasyon tahlili ile peletlenebilir fibrlerin varlığı, bir Tiyoflavin T tahlil ile fibrlerin amiloid konformasyonunun oluşumu ve liflerin elektron mikroskobik görselleştirmesi ile değerlendirilir. Bu testler kullanarak başarılı doğrulama başarı için gerekli olduğu halde, onlar pffs her pff toplu gibi toplama aktivitesi hücre kültürü veya pilot hayvan kohorts test edilmelidir gibi, nöronlar içinde α-SYN kapanımlar tohum olacağını garanti etmek için yeterli değildir. Kullanmadan önce, PFFs hassas standartlaştırılmış koşullar altında sonicated, elektron mikroskobu veya dinamik ışık saçılma kullanarak muayene tarafından takip fibril uzunlukları en iyi boyut aralığında olduğunu onaylamak için, ortalama uzunluğu ile 50 Nm. PFFs daha sonra hücre kültürü ortamına eklenebilir veya hayvanlarda kullanılabilir. Fosforile α-SYN (psyn; serin 129) için immünostasyon tarafından algılanabilen patoloji sırasıyla hücre kültürü ve kemirgen modellerinde belirgin günler veya haftalar sonra görülür.
Parkinson hastalığı (PD), öncelikle iki büyük patolojik özellik ile postmortem karakterizedir: yaygın ve Progressive Alfa-synuclein (α-SYN) patolojisini ve nigrostriyatal dejenerasyonu. Wildtype fareler veya fareler içine enjeksiyon aşağıdaki, α-SYN önceden biçimlendirilmiş liflerinde (pffs) patolojik α-SYN Progressive birikimine neden, hangi kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta uzun süren dejenerasyon neden olabilir (snpc) birçok ders üzerinde dopamin nöronlar ay, sensorimotor açıkları1,2,3,4,5,6yanı sıra. Nöronlar α-SYN fibrine maruz kalmaktadır, ya doğrudan intrakerebral enjeksiyon yoluyla ya da kültürlü nöronların medyasını ekledi. Pffs nöronların içine alındığında, pffs “Seed” templating ile kapanımlar oluşumu, ve fosforilated kapanımlar içine endojen α-SYN birikimi1,7,8, 9‘ a kadar. İnclusions Lewy gövdelere benzer özellikleri paylaşır: serin 129 (psyn), Ubiquitin ve P62 ‘de α-SYN fosforile içeren; pozitif Tiyoflavin boyama ile gösterilen amiloid dörernary yapıları sahip; ve proteinaz K sindirim dirençli1,3,5,7,8,9,10,11, 12‘ ye kadar. Pff pozlama birincil olarak α-SYN dahil oluşumu ve kültürde bazı ölümsüzleşmiş nöronlar, yanı sıra fareler, fareler, ve insan olmayan primatlar vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. PFFs tüm hücre kültürü modellerinde α-SYN dahil oluşumu yol açmaz ve bazı kültürlü nöronlar diğerlerinden daha iyi tohum olacaktır dikkat etmek önemlidir.
İn vivo α-SYN PFF modelinin bir diğer önemli özelliği de birkaç ay içinde ortaya çıkan farklı sıralı patolojik fazlar. Kemirgenler, intrastriatal enjeksiyon aşağıdaki, α-SYN dahil oluşumu genellikle SNpc içinde doruklarına ve birçok kortikal bölgelerde 1-2 ay içinde. Bu toplama zirvesinde nigrostriyatal dejenerasyonu tarafından izlenen ≈ 2-4 ay sonra1,3,5. Bu farklı patolojik aşamalar, araştırmacıların, 1) α-SYN toplamasını azaltan, 2) zaten oluşan α-SYN inclusions ve/veya 3) sonraki nörodejenerasyonunu önlemeleri için hangi stratejilerle çalışma ve geliştirme platformunu sağlar. Pff modeli, önceden gözden geçirilmiş olarak nörotoksisant, transgenik ve viral vektör aracılı α-SYN ekspresyonu modelleri ile karşılaştırıldığında farklı avantajlar ve dezavantajları sunar6. Hangi model veya yaklaşım almak için seçim hangi model en iyi dedektifler soran soru uygun olarak belirlenmelidir.
PFF modeli birçok laboratuar tarafından başarıyla kullanılsa da, fibrler üreten ve tutarlı α-SYN patolojisi14üreten tutarsızlıklara sahip olan gruplar hala vardır. Küçük veya hiçbir α-SYN patolojisini üreten PFFs ‘dan tutarsızlık örnekleri, toplu tohumlama verimliliği için toplu iş ve hatta fibrlerin bile başarısızlığı şeklinde değişir. Böylece, yeni terapötik müdahalelerin etkisi ile ilgili doğru yorumlara izin vermek için α-SYN PFF Generation ve in vivo uygulamasının standardizasyonu önemlidir. Aşağıdaki protokol α-SYN monomers gelen PFFs üretimi için gerekli adımları özetliyor, PFFs in vitro kalite kontrolü bir kez oluşturulan, sonication ve PFFs ölçüm önce kullanımı, ve öneriler başarılı in vivo enjeksiyon kolaylaştırmak için Rats veya fareler içine PFFs.
Nöronlar tohumlama ve Lewy vücut gibi kapanımlar lider yeteneğine α-SYN pffs üretimi birden fazla faktör ve adımlara bağlıdır. Kritik bir faktör, fibriller oluşturmak için kullanılan monomerlerin özel olarak fibrilization4,9,14,15için formüle edilmesi gerekir. Monomerlerin fibrilasyon için formüle edilmesi durumunda, fibrler form olmayabilir veya form yapan fibriller α-SYN patolojisini üretemebilir. Aynı şekilde, monomerlerin de etkisi fibrilization olan tampon. Bu nedenle, en iyi sonuçlar için, tuz konsantrasyonu yaklaşık 100 mM NaCl ve pH 7,0 ile 7,3 arasında olmalıdır. Değişkenlik sunan bir ilk adım, ilk protein içeriğinin belirlendiği yöntemdir, A280 adresinde ölçüm ile daha doğru sonuçlar elde etmek muhtemeldir ve bu nedenle tercih edilen yöntemdir. Protein konsantrasyonunda tutarsızlık fibrilasyon sürecinin etkinliğini azaltabilir, hem de deneyler kullanılan kabul PFF konsantrasyonu değiştirebilirsiniz. Her ikisi de deneyler arasında tohumlama verimliliği ve toplu varyasyon bir azalma neden olabilir.
İlk kalite kontrol adımları pffs kritik özellikleri teyit edecektir, özellikle onlar bir fibriler konformasyon var (elektron mikroskobu), amiloid yapıları içeren (thioflavin T tahlil), ve pelletable (sedimantasyon assay). Bu Tiyoflavin t tahlil sonuçları zaman ile dalgalanma olacak ve amiloid yapıların miktarı doğrudan bir ölçü değildir dikkat etmek önemlidir, yerine, Tiyoflavin t tahlil sadece içinde amiloid yapıları varlığı bir göstergesi olarak kullanılmalıdır örnek. Thioflavin T tipik olarak kullanılan in vitro asder, gibi yukarıda bahsedilen tahlil liflerinde göstermek için amiloid yapıları içerir. Alternatif olarak, Tiyoflavin S, Şekil 7‘ de gösterildiği gibi amiloid yapıları tespit etmek için dokuda kullanılır. Sedimentasyon tahlil açısından, sonuçlar sadece PFFs ağırlıklı olarak peletlenebilir fraksiyonda bulunan gösterir. Numuneler denatüre koşullarda çalıştırılıyor gibi, yaklaşık 14 kDa, α-SYN monomerlerin boyutu, tek bir önemli Band, jeller üzerinde mevcut. Bu, bir yerli veya non-denaturing jel kullanıldığında PFFs ile beklenecek yüksek moleküler ağırlıkları mevcut birden fazla bant aksine. Son olarak, bu ilk kalite kontrol adımlarının başarılı bir şekilde geçirilmesi α-SYN dahil olmak üzere tohumlama etkinliğini garanti etmemektedir. Bu nedenle, hücre kültürü deneyleri veya cerrahi olarak enjekte edilen hayvanların küçük bir kohort daha büyük deneyler kullanmadan önce PFFs etkinliğini test etmek için kullanılmalıdır.
Sonication sürecinde önemli bir adımdır ve parametreler kullanılan sonicator modeline bağlı olarak farklılık gösterecektir. Sonication parametreleri uygulanan ve kısa PFF parçaları üretilen göstermek için doğrulanmalıdır. Fibril boyutu, daha kısa liflerinde daha verimli tohumlama ile tohumlama üzerinde taşıyan vardır. Daha kısa fibriller tohum daha verimli olmasına rağmen, bu etkisi yaylaları ve optimum pff uzunluğu yaklaşık 50 nm4,18. Ayrıca, numunelerin aşırı sıcaklığa düşmesine ve PFFs ‘ı aşırı ısıya maruz bırakmayın, bu da tohumlama verimliliğini azaltabilir. Bu sonicated PFFs daha büyük ölçekli deneyler kullanmak için önce küçük hücre kültürü veya in vivo deneyler etkinliği için test edilmelidir. Farklı sonication oturumları değişkenlik tanıtmak potansiyeline sahip olarak, deneysel tedavi grupları buna göre planlanmalıdır.
Pffs in vivo teslim ederken, enjeksiyon site (ler) ve kullanılan toplam miktar pffs lokalizasyonu kapanımlar yanı sıra nörodejenerasyon7,14ölçüde geliştirecek nöronların sayısını etkileyebilir. Protokoldeki koordinatlar başlamak için bir yer sağlar, ancak istenen hedef bölgenin büyük ölçekli deneylerde kullanımından önce α-SYN patolojisini geliştirmesini sağlamak için laboratuar içinde test edilmelidir. İstenirse, PFFs kullanmadan önce bölgesel hedefleme sınamak için bir yol olarak boya veya floresan boncuklar izleme kullanılabilir. İçinde vivo kullanılan pffs miktarı gruplar arasında değişir, çoğu grup ile 5 ila 20 μg pffs arasında bir toplam kullanarak veya iki enjeksiyon siteleri arasında bölünmüş1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14. enjeksiyon siteleri sayısı, enjeksiyon sitelerin konumu, ve pffs miktarı enjekte sonuçları ve synucleinopati ilerlemesini etkisi olabilir, kullanılan parametrelerin aşağı çıkış sonuçları modeli kullanmadan önce karakterize edilmelidir potansiyel müdahaleleri test edin veya modelin geçici özelliklerini inceleyerek.
Terapiyi test etmek veya hastalık ilerlemesini incelemek için kullanılacak bir model seçerken, kullanılan model sorulan soruya en uygun şekilde cevap vermek için seçilmelidir. Tüm modellerde PD ‘nin belirli hastalık özelliklerine sahip olmayacaktır veya potansiyel müdahaleleri test etmek için gereken zaman dilimini sunacaksınız. PFF modeli, PD ‘nin α-SYN patolojisi ve Nörodejenerasyon gibi temel özelliklerini yeniden oluşturmaktadır ve mütevazı motor bozukluklara yol açabilir. Model, kapanımlar neurodegeneration önce ay formu öngörülebilir ve uzun süren zaman kursu sunar. Bu, araştırmacıların synucleinopati ‘nin uzun süren ilerlemesi boyunca farklı aşamaları incelemesine ve yararlanmasına olanak tanır. Modelin geçerli ve gelecekteki kullanımı, hastalığın ilerlemesi ve yeni tedavilerin geliştirilmesi konusunda faydalı olması bekleniyor.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Michael J. Fox Vakfı, Ulusal Enstitüsü nörolojik bozukluklar ve Inme (NS099416) ve Weston beyin Enstitüsü gelen hibe tarafından desteklenmektedir.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |