Målet med denne artikel er at skitsere de nødvendige skridt til generering af fibriller fra monomerisk Alpha-synuclein, efterfølgende kvalitetskontrol, og brug af de præformerede fibriller in vivo.
Brug af in vivo Alpha-synuclein præformeret atrieflimren (α-syn PFF) model af synucleinopati er stigende popularitet blandt forskere med henblik på at modellere Parkinsons sygdom synucleinopati og nigrostriatal degeneration. Standardisering af α-syn PFF generation og in vivo ansøgning er afgørende for at sikre en konsekvent, robust α-syn patologi. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for generering af fibriller fra monomere α-syn, post-fibrilization kvalitetskontrol trin, og foreslåede parametre for vellykket Neurokirurgisk injektion af α-syn pffs i rotter eller mus. Begyndende med monomere α-syn, fibrilization forekommer over en 7-dages inkubationsperiode, mens ryste på optimale buffer betingelser, koncentration, og temperatur. Post-fibrilization kvalitetskontrol vurderes ved tilstedeværelsen af pelletabel fibriller via bundfældning assay, dannelsen af amyloid kropsbygning i fibriller med en thioflavin T-assay, og elektron mikroskopisk visualisering af fibriller. En vellykket validering ved hjælp af disse analyser er nødvendig for at opnå succes, men de er ikke tilstrækkelige til at garantere, at PFFs vil frø α-syn-indeslutninger i neuroner, da en sådan aggregerings aktivitet for hver PFF-batch bør testes i cellekultur eller i pilot dyre kohorter. Før brug skal pffs sonikeres under nøje standardiserede forhold, efterfulgt af undersøgelse ved hjælp af elektronmikroskopi eller dynamisk lysspredning for at bekræfte, at atrieflimren længder er inden for det optimale størrelsesinterval med en gennemsnitlig længde på 50 nm. PFFs kan derefter tilsættes til cellekultur medier eller anvendes i dyr. Patologi detekterbart ved immunofarvning for phosphoryleret α-syn (psyn; Serin 129) er tilsyneladende dage eller uger senere i cellekultur og gnaver modeller.
Parkinsons sygdom (PD) er primært karakteriseret post mortem af to store patologiske egenskaber: udbredt og progressiv Alpha-synuclein (α-syn) patologi, og nigrostriatal degeneration. Efter injektion i dværg-mus eller-rotter inducerer α-syn-præformerede fibriller (pffs) progressiv akkumulering af patologisk α-syn, hvilket kan resultere i langvarig degeneration af substantia nigra pars Compacta (snpc) dopamin neuroner i løbet af mange måneder, samt sensorimotoriske underskud1,2,3,4,5,6. Neuroner er udsat for α-syn fibrils, enten via direkte intracerebralt injektion eller tilsættes til medierne af kulturperler neuroner. Når pffs er taget ind i neuroner, pffs handle til “frø” dannelsen af indeslutninger gennem templating, og ophobning af endogene α-syn i fosforylerede indeslutninger1,7,8, 9. det er Inklusioner deler lignende egenskaber med Lewy kroppe: indeholdende α-syn fosforyleret ved Serin 129 (pSyn), ubiquitin og p62; besidder amyloid kvaternære strukturer som vist med positiv thioflavin farvning; og er modstandsdygtige over for proteinase K fordøjelse1,3,5,7,8,9,10,11, 12. i. PFF eksponering fører til α-syn inklusion dannelse i primær og nogle udødeliggjort neuroner i kultur, samt mus, rotter, og ikke-menneskelige primater in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det er vigtigt at bemærke, at PFFs ikke vil føre til α-syn inklusion dannelse i alle cellekultur modeller og nogle kultiverede neuroner vil frø bedre end andre.
Et andet vigtigt træk ved in vivo α-syn PFF model er de forskellige sekventielle patologiske faser, der opstår over flere måneder. I gnavere, efter intrastriatal injektion, α-syn inklusion dannelse generelt toppe inden for SNpc og mange kortikale regioner inden for 1-2 måneder. Denne aggregerings peak efterfølges af nigrostriatal degeneration ≈ 2-4 måneder senere1,3,5. Disse forskellige patologiske stadier giver forskerne den platform, hvormed man kan studere og udvikle strategier, der 1) mindske α-syn aggregering, 2) klar allerede dannet α-syn indeslutninger, og/eller 3) forhindre efterfølgende neurodegeneration. PFF-modellen giver klare fordele og ulemper i forhold til neurotoksisk, transgene og viral vektor medierede α-syn overekspression modeller som tidligere anmeldt6. Valget af, hvilken model eller tilgang til at tage bør afgøres af, hvilken model passer bedst til det spørgsmål, som efterforskerne spørger.
Selv om PFF-modellen er blevet udnyttet med succes af mange laboratorier, er der stadig grupper, der har oplevet uoverensstemmelser med at generere fibriller og producerer konsekvent α-syn patologi14. Eksempler på uoverensstemmelser spænder fra pffs, der producerer lidt eller ingen α-syn patologi, batch til batch såning effektivitet, og selv svigt af fibriller at danne. Således er standardiseringen af α-syn PFF generation og in vivo ansøgning kritisk for at give mulighed for præcise fortolkninger af virkningen af nye terapeutiske interventioner. Følgende protokol skitserer de trin, der kræves for generering af PFFs fra α-syn monomerer, in vitro kvalitetskontrol af PFFs en gang dannet, sonikering og måling af PFFs før brug, og forslag til at lette en vellykket in vivo injektion af PFFs til rotter eller mus.
Produktion af α-syn PFFs i stand til såning neuroner og fører til Lewy Body-lignende inklusioner er afhængig af flere faktorer og trin. En afgørende faktor er, at de monomerer, der anvendes til at generere fibriller, skal være specifikt formuleret til fibrilization4,9,14,15. Hvis monomererne ikke er formuleret til fibrilization, kan fibriller ikke dannes, eller de fibrider, der gør form, må ikke producere α-syn patologi. Ligeledes, bufferen, at monomererne er i også indflydelse fibrilization. For at få de bedste resultater bør saltkoncentrationen derfor være ca. 100 mM NaCl og pH mellem 7,0 og 7,3. Et første skridt, der introducerer variabilitet, er den metode, hvorved det oprindelige proteinindhold bestemmes, idet målingen på A280 sandsynligvis vil give mere nøjagtige resultater og derfor er den foretrukne metode. Uoverensstemmelsen i proteinkoncentrationen kan mindske effekten af fibrilization processen, samt ændre den formodede PFF koncentration, der anvendes i eksperimenter. Begge kunne føre til et fald i såning effektivitet og batch variation mellem eksperimenter.
Indledende kvalitetskontrol trin vil bekræfte kritiske egenskaber af PFFs, specifikt at de har en fibrillær konformation (elektronmikroskopi), indeholder amyloid strukturer (thioflavin T assay), og er pelletabel (sedimentation assay). Det er vigtigt at bemærke, at resultaterne af thioflavin T-analysen vil svinge med tiden og ikke er en direkte målestok for mængden af amyloid strukturer til stede, snarere, thioflavin T assay bør kun anvendes som en indikator for amyloid strukturer tilstedeværelse inden for prøven. Thioflavin T anvendes typisk i in vitro-assays, såsom førnævnte analyse for at vise fibriller indeholder amyloid strukturer. Alternativt, thioflavin S anvendes i væv til at detektere amyloid strukturer, som vist i figur 7. Med hensyn til sedimentations analysen viser resultaterne kun, at PFFs overvejende findes i pelleterings fraktionen. Da prøverne udføres under Denaturerings betingelser, findes der et enkelt fremtrædende bånd på ca. 14 kDa, størrelsen af α-syn monomerer, på gelene. Dette er i modsætning til de mange bånd til stede ved højere molekylære vægte, der ville være forventet med PFFs, hvis en indfødt eller ikke-Denaturerings gel blev brugt. Endelig er en vellykket gennemgang af alle disse første kvalitetskontrol trin ikke en garanti for, at der er en sådan aktivitet. Af denne grund bør forsøg med cellekulturer eller en lille kohorte af kirurgisk indskudte dyr anvendes til at teste effekten af PFFs, før de anvendes i større forsøg.
Sonikering er et afgørende skridt i processen, og parametrene vil variere afhængigt af den model af sonicator, der anvendes. Sonikering parametre skal anvendes og verificeres for at vise, at korte PFF fragmenter er blevet produceret. Fibril størrelse har indflydelse på såning, med kortere fibriller såning mere effektivt. Selvom kortere fibriller frø mere effektivt, denne effekt plateauer og den optimale PFF længde er ca 50 nm4,18. Det er også vigtigt ikke at over-sonikatere prøverne og udsætte PFFs for overdreven varme, da dette kan mindske såning effektivitet. Disse sonierede PFFs skal testes for effekt i små cellekulturer eller in vivo-eksperimenter før brug i større eksperimenter. Da forskellige sonikering sessioner har potentiale til at indføre variation, bør eksperimentelle behandlingsgrupper planlægges i overensstemmelse hermed.
Ved levering af pffs in vivo kan lokaliseringen af injektionsstedet (-erne) og den samlede mængde pffs, der anvendes, påvirke antallet af neuroner, der vil udvikle inklusioner samt omfanget af neurodegeneration7,14. Koordinaterne i protokollen giver et sted at starte, men bør testes i laboratoriet for at sikre, at den ønskede målregion udvikler α-syn patologi før brug i store eksperimenter. Hvis det ønskes, kan sporing farvestof eller fluorescerende perler bruges som en måde at teste regional målretning før du bruger PFFs. Mængden af pffs, der anvendes in vivo, varierer mellem grupperne, idet de fleste grupper anvender en total på mellem 5 og 20 μg pffs ved en eller delt mellem to injektionssteder1,2,3,4,5 , 6 af , 7 af , 14. da antallet af injektionssteder, placering af injektionssteder og mængden af injicerede pffs kan påvirke resultaterne og progressionen af synukleinopati, bør downstream-resultaterne af de anvendte parametre karakteriseres, før modellen anvendes til at afprøve potentielle interventioner eller undersøge modellens tidsmæssige karakteristika.
Når du vælger en model til at bruge til afprøvning af terapeutisk eller studere sygdomsprogression, bør den anvendte model vælges for bedst at besvare det stillede spørgsmål. Ikke alle modeller vil besidde visse sygdoms funktioner i PD, eller tilbyde den tidsramme, der er nødvendig for at afprøve potentielle interventioner. PFF-modellen genberegner de vigtigste egenskaber ved PD, såsom α-syn patologi og neurodegeneration, og kan føre til beskedne motoriske funktionsnedsættelser. Modellen tilbyder et forudsigeligt og langvarigt tidsforløb, hvor inklusioner danner måneder før neurodegeneration. Dette giver forskerne mulighed for at undersøge og udnytte de forskellige faser i hele den langvarige progression af synukleinopati. Den nuværende og fremtidige anvendelse af modellen generelt forventes at være gavnlig i studiet af sygdomsprogression og udvikling af nye terapier.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Michael J. Fox Foundation, National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde (NS099416) og Weston Brain Institute.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |