Målet med denne artikkelen er å skissere trinnene som kreves for generering av fibrils fra monomere Alpha-synuclein, påfølgende kvalitetskontroll, og bruk av preformed fibrils in vivo.
Bruk av in vivo Alpha-synuclein preformed fibril (α-syn PFF) modell av synucleinopathy blir stadig mer populært blant forskere som mål å modellere Parkinsons sykdom synucleinopathy og nigrostriatal degenerasjon. Standardisering av α-syn PFF generasjon og in vivo-programmet er avgjørende for å sikre konsistent, robust α-syn patologi. Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av fibrils fra monomere α-syn, post-fibrilization kvalitetskontroll trinn, og foreslåtte parametre for vellykket nevrokirurgisk injeksjon av α-syn PFFs til rotter eller mus. Fra og med monomere α-syn oppstår fibrilization over en 7-dagers inkubasjonsperiode mens risting ved optimale buffer forhold, konsentrasjon og temperatur. Post-fibrilization kvalitetskontroll er vurdert av tilstedeværelsen av pelletable fibrils via sedimentering analysen, dannelsen av amyloid konformasjon i fibrils med en thioflavin T-analysen, og elektron mikroskopisk visualisering av fibrils. Mens vellykket validering ved hjelp av disse analysene er nødvendig for å lykkes, er de ikke tilstrekkelig til å garantere PFFs vil frø α-syn inkluderinger i neurons, slik aggregering aktivitet av hver PFF batch bør testes i cellekultur eller pilot dyr kohorter. Før bruk, PFFs må sonikert under nøyaktig standardiserte forhold, etterfulgt av undersøkelse ved hjelp av elektron mikroskopi eller dynamisk lysspredning for å bekrefte fibril lengder er innenfor optimal størrelse rekkevidde, med en gjennomsnittlig lengde på 50 NM. PFFs kan deretter legges til cellekultur medier eller brukes i dyr. Patologi oppdages av immunostaining for fosforylert α-syn (psyn; Serine 129) er åpenbare dager eller uker senere i cellekultur og gnager modeller.
Parkinsons sykdom (PD) er primært preget postmortem av to store patologiske funksjoner: utbredt og progressiv Alpha-synuclein (α-syn) patologi, og nigrostriatal degenerasjon. Etter injeksjon i wildtype mus eller rotter, α-syn preformed fibrils (PFFs) induserer progressiv akkumulering av patologisk α-syn, noe som kan resultere i langvarige degenerasjon av substantia Nigra Pars compacta (SNpc) dopamin neurons i løpet av mange måneder, samt Sensorimotor underskudd1,2,3,4,5,6. Neurons er eksponert for α-syn fibrils, enten via direkte intracerebrale injeksjon eller lagt til Media av kulturperler neurons. Når PFFs er tatt inn i neurons, den PFFs handle for å “Seed” dannelsen av inkluderinger gjennom templating, og akkumulering av endogene α-syn i fosforylert inkluderinger1,7,8, 9i. Inkluderinger dele lignende egenskaper til Lewy organer: inneholder α-syn fosforylert på Serine 129 (pSyn), ubiquitin, og p62; besitter amyloid kvartær strukturer som vist med positiv thioflavin farging; og er motstandsdyktig mot proteinase K fordøyelse1,3,5,7,8,9,10,11, det er 12. PFF eksponering fører til α-syn inkludering formasjon i primær og noen udødeliggjort neurons i kultur, så vel som mus, rotter, og ikke-menneskelige primater i vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det er viktig å merke seg at PFFs ikke vil føre til α-syn inkludering formasjon i alle cellekultur modeller og noen kultivert neurons vil frø bedre enn andre.
En annen viktig funksjon i in vivo α-syn PFF modellen er den distinkte sekvensielle patologiske faser som dukker opp over flere måneder. I gnagere, etter intrastriatal injeksjon, α-syn inkludering formasjon generelt topper i SNpc og mange kortikale regioner innen 1-2 måneder. Denne aggregering peak etterfølges av nigrostriatal degenerasjon ≈ 2-4 måneder senere1,3,5. Disse distinkte patologiske stadier gir forskere plattformen som å studere og utvikle strategier som 1) redusere α-syn aggregering, 2) klart allerede dannet α-syn inkluderinger, og/eller 3) hindre påfølgende neurodegeneration. PFF modellen tilbyr distinkte fordeler og ulemper i forhold til neurotoxicant, transgene, og viral vektor mediert α-syn overuttrykte modeller som tidligere gjennomgått6. Valget av hvilken modell eller tilnærming til å ta bør bestemmes av hvilken modell som passer best til spørsmålet etterforskerne spør.
Selv om PFF modellen har blitt utnyttet av mange laboratorier, er det fortsatt grupper som har opplevd uoverensstemmelser med å generere fibrils og produsere konsistent α-syn patologi14. Eksempler på inkonsekvenser spenner fra PFFs som produserer lite eller ingen α-syn patologi, batch til batch seeding effektivitet, og selv svikt i fibrils å danne. Dermed er standardisering av α-syn PFF generasjon og in vivo søknad avgjørende for å muliggjøre nøyaktige tolkninger om virkningen av romanen terapeutiske intervensjoner. Følgende protokoll skisserer trinnene som kreves for generering av PFFs fra α-syn-monomerer, kvalitetskontroll av PFFs-en gang dannet, sonikering og måling av PFFs før bruk, og forslag for å muliggjøre vellykket in vivo-injeksjon av PFFs til rotter eller mus.
Produksjon av α-syn PFFs i stand til seeding neurons og fører til Lewy kropp-lignende inkluderinger er avhengig av flere faktorer og trinn. En kritisk faktor er at monomerer som brukes til å generere fibrils må være spesielt formulert for fibrilization4,9,14,15. Hvis monomerer ikke er formulert for fibrilization, fibrils kan ikke danne eller fibrils som gjør skjemaet kan ikke produsere α-syn patologi. Likeledes, buffer som monomerer er i også påvirke fibrilization. Som sådan, for de beste resultatene, bør salt konsentrasjonen være ca 100 mM NaCl og pH mellom 7,0 og 7,3. Et første skritt som introduserer variasjon er metoden der første proteininnhold bestemmes, med måling på A280 sannsynlig å produsere mer nøyaktige resultater, og derfor er den foretrukne metoden. Avviket i proteinkonsentrasjon kan redusere effekten av fibrilization prosessen, samt endre antatt PFF konsentrasjon som brukes i eksperimenter. Begge kan føre til en nedgang i seeding effektivitet og batch variasjon mellom eksperimenter.
Initial kvalitetskontroll trinn vil bekrefte kritiske funksjoner i PFFs, spesielt at de har en fibrillary konformasjon (elektron mikroskopi), inneholder amyloid strukturer (thioflavin T-analysen), og er pelletable (sedimentering analysen). Det er viktig å merke seg at resultatene av thioflavin T-analysen vil svinge med tiden og er ikke et direkte mål på mengden av amyloid strukturer stede, heller, thioflavin T-analysen bør bare brukes som en indikator på amyloid strukturer tilstedeværelse innen prøven. Thioflavin T brukes vanligvis i in vitro-analyser, slik som den nevnte analysen for å vise fibrils inneholde amyloid strukturer. Alternativt er thioflavin S brukt i vev for å detektere amyloid strukturer, som vist i figur 7. I forhold til sedimentering analysen, resultatene viser bare at PFFs er funnet hovedsakelig i pelletable brøkdel. Som prøvene er kjørt i denaturering forhold, en enkelt fremtredende band på ca 14 kDa, størrelsen på α-syn monomerer, er til stede på gels. Dette er ulikt flere band til stede ved høyere molekyl vekter som ville bli forventet med PFFs hvis en innfødt eller ikke-denaturering gel ble brukt. Til slutt, vellykket bestått av alle disse første kvalitetskontroll trinnene garanterer ikke α-syn inkludering seeding aktivitet. Av denne grunn, cellekultur eksperimenter eller en liten kohort av kirurgisk-injisert dyr bør brukes til å teste effekten av PFFs før bruk i større eksperimenter.
Sonikering er et avgjørende skritt i prosessen og parametrene vil variere avhengig av modell av sonicator som brukes. Sonikering parametere må brukes og verifiseres for å vise at korte PFF fragmenter har blitt produsert. Fibril størrelse har peiling på seeding, med kortere fibrils seeding mer effektivt. Selv om kortere fibrils frø mer effektivt, denne effekten vidder og den optimale PFF lengden er ca 50 NM4,18. Det er også viktig å ikke sonikere prøvene og utsette PFFs for overdreven varme, da dette kan redusere seeding effektivitet. Disse sonikert PFFs skal testes for effekt i små cellekultur eller in vivo eksperimenter før bruk i større skala eksperimenter. Som ulike sonikering økter har potensial til å innføre variasjon, eksperimentell behandling grupper bør planlegges tilsvarende.
Når du leverer PFFs in vivo, kan lokaliseringen av injeksjonsstedet (e) og den totale mengden PFFs som brukes, påvirke antallet neurons som vil utvikle inkluderinger, samt omfanget av neurodegeneration7,14. Koordinatene i protokollen gir et sted å starte, men bør testes i laboratoriet for å sikre den ønskede målregionen utvikler α-syn patologi før bruk i stor skala eksperimenter. Hvis ønskelig, kan spore fargestoff eller fluorescerende perler brukes som en måte å teste regional målretting før du bruker PFFs. Mengden PFFs som brukes i vivo varierer mellom grupper, og de fleste grupper bruker totalt mellom 5 og 20 mikrogram PFFs på ett eller delt mellom to injeksjonssteder1,2,3,4,5 , 6 andre priser , 7 andre er , 14. ettersom antall injeksjonssteder, plassering av injeksjonssteder, og mengden av PFFs injisert kan påvirke resultater og progresjon av synucleinopathy, bør nedstrøms utfall av parametrene karakteriseres før du bruker modellen til å teste potensielle intervensjoner eller undersøke timelige trekk ved modellen.
Når du velger en modell som skal brukes til testing legemiddel selskap eller studere sykdomsprogresjon, bør modellen velges for å best svare på spørsmålet spurt. Ikke alle modeller vil ha visse sykdoms funksjoner av PD, eller tilby den tidsrammen som trengs for å teste potensielle intervensjoner. PFF modellen viser viktige funksjoner i PD, som α-syn patologi og neurodegeneration, og kan føre til beskjedne motoriske hemninger. Modellen tilbyr en forutsigbar og langvarig tid-kurs, der inkluderinger skjema måneder før neurodegeneration. Dette gjør at forskerne kan undersøke og utnytte de ulike fasene gjennom den langvarige utviklingen av synucleinopathy. Den nåværende og fremtidig bruk av modellen generelt er forventet å være fordelaktig i studiet av sykdomsprogresjon og utvikling av romanen terapier.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra Michael J. Fox Foundation, National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke (NS099416) og Weston Brain Institute.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |