이 기사의 목표는 단량체 성 알파-sy뉴 클레 인, 후속 품질 관리 및 생체 내에서 미리 형성 된 섬유 소의 사용 으로부터 피 브 릴의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하는 것입니다.
생체 내 알파-시 뉴 핀 (α-syn PFF) 모델의 시 뉴 트리 트의 사용은 파 킨 슨 병 질환 및 근 병 변성을 모델링 하는 것을 목표로 연구자 들 사이에서 인기를 얻고 있다. Α-syn PFF 생성 및 생체 내 적용의 표준화는 일관 되 고 강력한 α-syn 병리학을 보장 하기 위해 매우 중요 합니다. 여기서, 우리는 단량체 성 α-syn, 후 섬유 화 품질 관리 단계 및 쥐 또는 마우스에 α-syn PFFs의 성공적인 신경 외과 주입을 위한 제안 된 매개 변수 로부터 피 브 릴의 생성을 위한 상세한 프로토콜을 제시 한다. 단량체 성 α-syn을 시작으로, 섬유 화는 최적의 완충 조건, 농도 및 온도에서 흔들리는 동안 7 일간의 인큐베이션 기간 동안 발생 합니다. 후 섬유 화 품질 관리는 침전 분석을 통해 펠 렛 테이블 섬유 소의 존재에 의해 평가 되며, thioflavin T 검정 법으로 피 브 릴에서 아 밀 로이드 입체 형성을 형성 하 고, 섬유 소의 전자 현미경을 시각화 합니다. 이러한 분석 법을 이용한 성공적인 검증이 성공에 필요한 반면, 각 PFFS 배치의 응집 활성이 세포 배양 또는 파일럿 동물 집단에서 시험 되어야 하므로 PFFs가 뉴런에 α-syn 개재 물을 종자 할 것을 보장 하기에 충분 하지 않다. 사용 하기 전에 PFFs는 정밀 하 게 표준화 된 조건 하에서 초음파 처리 되어야 하며, 그 다음에는 전자 현미경 또는 동적 광산 산란을 사용 하 여 피 브 릴 길이가 최적의 크기 범위 내에 있는지 확인 하 고 평균 길이는 50 nm입니다. PFFs는 세포 배양 배지에 첨가 되거나 동물에서 사용 될 수 있다. 인 산화 된에 대 한 면역 염색에 의해 검출 가능한 병리학은 α-syn (psyn; 세 린 129)은 세포 배양 및 설치류 모델 각각에서 며칠 또는 몇 주 후에 명백 하다.
파 킨 슨 병 (PD)은 주로 두 가지 주요 병리학 적 특징에 의해 사후 치료를 특징으로 합니다: 광범위 하 고 진보적인 알파 시 뉴 신 (α-syn) 병리학 및 니로 트리 아 변성. 야생 형 쥐 또는 쥐에 주입 다음, α-syn 미리 형성 된 섬유 소 (pffs)는 병리학 적 α-syn의 진보적 인 축적을 유도 하 여 많은 과정을 거쳐 입증 된 니 그 라 파르스 compacta (snpc) 도파민 뉴런의 프로톤 화 변성을 유발할 수 있습니다. 뿐만 아니라, 센 소리 모터 적자의1,2,5,6. 뉴런은 직접 뇌 내 주입을 통해 또는 배양 된 뉴런의 매체에 첨가 된 α-syn 섬유 소에 노출 됩니다. Pffs가 뉴런으로 촬영 될 때, pffs는 템플릿 화를 통해 개재 물의 형성을 “종자” 하 고, 내 인 성 α-syn을 인 산화 된 개재물에 축적 하는 작용을 하 고,7,8 9. 포함은 Lewy 바디에 유사한 속성을 공유 합니다: 세 린 129 (pSyn), 유비퀴틴 및 p62에서 α-syn 인 산화 된을 함유 하 고; 긍정적인 thioflavin 염색과 같이 아 밀 로이드 4 급 구조물을 소유 하십시오; 그리고 프로 테이 지 K 소화에 대 한 내성이 있고, 제1,제5,8,10,11 12. Pff 노 광은 마우스, 랫 트 및 비 인간 영장류에서의1차 및 일부 불멸 화 뉴런에서의 α-syn 포 접 형성에 이르게 한다. 6,8,9,13. PFFs는 모든 세포 배양 모형에 있는 α-syn 포용 형성으로 이끌어 내지 않으며 몇몇 배양 한 신경은 다른 사람 보다는 더 나은 종자 것을 주의 하는 것이 중요 합니다.
생체 내 α-syn PFF 모델의 또 다른 중요 한 특징은 몇 달에 걸쳐 출현 하는 뚜렷한 순차적 병리학 적 단계 이다. 설치류에서, 흉 골 내 주사 다음, α-syn 포함 형성은 일반적으로 SNpc 및 많은 대뇌 피 질의 영역 내에서 1-2 개월 이내에 피크. 이 응집 피크는 ≈ 2-4 개월 후에 니로 터의 변성에따른다. 이러한 뚜렷한 병리학 적 단계는 연구원에 게 1) α-syn 응집을 감소 시키는 전략을 연구 하 고 개발할 수 있는 플랫폼을 제공 하며, 2) 이미 형성 된 α-syn 개재 물 및/또는 3) 후속 신경 변성을 방지 합니다. PFF 모델은 이전에 검토 된 바와 같이 신경 독성, 형질 전환 및 바이러스 벡터 매개 α-syn과 발현 모델과 비교 하 여 뚜렷한 장점과 단점을 제공 한다6. 어떤 모델이 나 접근법을 선택 하는 것은 구도 자가 묻는 질문에 가장 적합 한 모델에 의해 결정 되어야 합니다.
PFF 모델은 많은 실험실에서 성공적으로 활용 되었지만, 섬유 소 생성 및 일관 된 α-syn 병리학의 생성과 불일치를 경험한 여전히 그룹이 있습니다. 불일치의 예로는 α-syn 병리학을 거의 또는 전혀 생성 하지 않는 PFFs의 범위, 회분 식 시 딩 시 효율성, 심지어 피 브 릴의 형성 실패 등이 있습니다. 따라서, α-syn PFF 생성 및 생체 내 적용의 표준화는 신규 한 치료 적 개입의 영향에 관한 정확한 해석을 허용 하기 위해 중요 하다. 다음의 프로토콜은 α-syn 단량체 로부터 PFFs의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하 고, PFFs의 시험관 내 품질 관리는 일단 형성 되 고, 사용 전에 PFFs의 초음파 처리 및 측정 하 고, 성공적인 생체 내 주입을 용이 하 게 하기 위한 제안 쥐 또는 마우스에 PFFs.
뉴런을 시드 할 수 있는 α-syn PFFs의 생산과 Lewy 바디와 같은 개재 물로 이어지는 것은 여러 요인 및 단계에 따라 달라 집니다. 중요 한 요인은 섬유 소를 생성 하는 데 사용 되는 단량체가4,9,14,15에 대 한 구체적으로 공식화 될 필요가 있다는 것 이다. 모노 머가 섬유 화를 위해 공식화 되지 않는 경우에, 피 브 릴은 형성 되지 않거나 형태를 이루는 섬유 소는 α-syn 병리학을 생성 하지 않을 수 있습니다. 마찬가지로, 단량체가 있는 완충 액도 섬유 화에 영향을 미친다. 이와 같이, 최상의 결과를 위해, 염 농도는 7.0 및 7.3 사이의 약 100 mM 염화 나트륨 및 pH 이어야 한다. 변동성을 소개 하는 초기 단계는 초기 단백질 함량이 결정 되는 방법 이며, A280에서의 측정은 보다 정확한 결과를 생성 할 가능성이 있으므로 선호 되는 방법입니다. 단백질 농도의 불일치는 피 섬유 화 공정의 효능을 저하 시킬 수 있을 뿐만 아니라 실험에 사용 되는 가정 된 PFF 농도를 변경할 수도 있다. 둘 다 실험 간의 시드 효율성과 배치 변이의 감소로 이어질 수 있습니다.
초기 품질 관리 단계는 PFFs의 중요 한 특징을 확인 하 고 (전자 현미경) 아 밀 로이드 구조 (thioflavin T 분석)를 포함 하 고 펠 렛 테이블 (침전 분석)입니다. Thioflavin T 검정의 결과는 시간에 따라 변동 하 고 존재 하는 아 밀 로이드 구조물의 양의 직접적인 측정이 아니라는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다, 오히려, thioflavin T 분석은 내에서 아 밀 로이드 구조 존재의 지표로 서만 사용 되어야 합니다 샘플입니다. Thioflavin T는 통상적으로 상기 피 브리 스가 아 밀 로이드 구조를 함유 하는 것을 보여주기 위해 전술한 검정 법과 같은 시험관 내 분석에 사용 된다. 대안적으로, thioflavin S는 도 7에 도시 된 바와 같이 아 밀 로이드 구조를 검출 하기 위해 조직에서 사용 된다. 침 강 분석에 관해서, 결과는 PFFs가 펠 렛 테이블 분 획에서 주로 발견 되는 것만을 보여준다. 샘플이 변성 조건에서 실행 되기 때문에 α-syn 단량체의 크기 인 약 14 kDa의 단일 눈에 띄는 밴드가 젤에 존재 합니다. 이것은 기본 또는 비 변성 젤을 사용 하는 경우 PFFs에 예상 되는 더 높은 분자량에 존재 하는 다중 밴드와는 달리입니다. 마지막으로, 이러한 모든 초기 품질 관리 단계를 성공적으로 통과 하는 것은 α-syn 포함 시드 작업을 보장 하지 않습니다. 이러한 이유로, 세포 배양 실험 또는 외과 적 주사 동물의 작은 집단은 큰 실험에서 사용 하기 전에 PFFs의 효능을 시험 하기 위해 사용 되어야 한다.
초음파 처리는 공정에서 중요 한 단계 이며 매개 변수는 사용 되는 초음파 분쇄기의 모델에 따라 다를 것입니다. 초음파 매개 변수를 적용 하 고 짧은 PFF 조각이 생성 되었음을 보여주기 위해 확인 해야 합니다. 피 브 릴 크기는 파 종에 베어링이 있으며, 짧은 섬유 소를 더 효율적으로 시 딩 합니다. 짧은 섬유 소는 더 효율적으로 종자 이지만,이 효과 고원 및 최적의 pff 길이는 약 50nm 이다. 샘플을 지나치게 초음파 처리 하 고 PFFs에 과도 한 열을 노출 하지 않는 것도 중요 합니다 .이는 시드 효율을 저하 시킬 수 있습니다. 이러한 초음파 처리 된 PFFs는 대규모 실험에서 사용 하기 전에 작은 세포 배양 또는 생체 내 실험에서의 효능에 대해 시험 되어야 한다. 다른 초음파 세션은 가변성을 소개 할 수 있는 잠재력을가지고 있기 때문에 실험적 치료 그룹을 계획 해야 합니다.
Pffs를 생체 내에서 전달 하는 경우, 주사 부위 (들) 및 사용 된 총 양의 pffs의 국 소화는 신경 변성7,14의 정도 뿐만 아니라 개재 물을 개발 하는 뉴런의 수에 영향을 미칠 수 있다. 프로토콜의 좌표는 시작 하는 장소를 제공 하지만, 대규모 실험에서 사용 하기 전에 원하는 표적 지역이 α-syn 병리학을 개발 하도록 하기 위해 실험실 내에서 테스트 되어야 합니다. 원한다 면, 추적 염료 또는 형광 구슬 PFFs를 사용 하기 전에 지역 타겟팅을 테스트 하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 생체 내에서 사용 되는 pffs의 양은 그룹 마다 다르며, 대부분의 그룹은 pffs의 5 ~ 20 µ g 사이에 총을 사용 하 여 2 개의 주사 부위1,2, 3,5 사이에서 나누어 , 6 , 7 , 14. 주사 사이트의 수, 주사 부의 위치, 주입 된 pffs의 양은 시 핵 병의 결과 및 진행 성에 영향을 미칠 수 있으므로, 사용 되는 파라미터의 다운스트림 결과는 모델을 사용 하기 전에 특성화 되어야 잠재적인 개입을 테스트 하거나 모델의 임시 기능을 검사 합니다.
치료법을 시험 하거나 질병 진행을 연구 하는 데 사용할 모델을 선택할 때, 사용 된 모델을 선택 하 여 질문에 가장 잘 대답 합니다. 모든 모델이 PD의 특정 질병 기능을 소유 하거나 잠재적인 개입을 테스트 하는 데 필요한 기간을 제공 하지는 않습니다. PFF 모델은 α-syn 병리학 및 신경 퇴행과 같은 PD의 주요 특징을 탈환 하며, 겸손 한 운동 장애로 이어질 수 있습니다. 이 모델은 예측 가능 하 고 일정 한 시간 과정을 제공 하며, 신경 변성을 위해 몇 달 동안 개재 물이 형성 됩니다. 이를 통해 연구원은 시 핵 병의 진행 과정 전반에 걸쳐 여러 단계를 검토 하 고 악용할 수 있습니다. 전반적인 모델의 현재와 미래의 사용은 질병 진행 및 새로운 치료법의 개발에 도움이 될 것으로 예상 된다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 마이클 j. 폭스 재단의 보조금에 의해 지원 되었다, 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소 (NS099416) 그리고 웨스턴 브레인 연구소.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |