Цель этой статьи состоит в том, чтобы наметить шаги, необходимые для генерации фибриллы от мономерные альфа-нуклеин, последующего контроля качества, и использование предварительно фибриллы в естественных условиях.
Использование в естественных условиях альфа-нуклеин предварительно сформированных фибрил (а-Син PFF) модель синуминатии набирает популярность среди исследователей, направленных на модель болезни Паркинсона нуклеопатии и нигростриатальной дегенерации. Стандартизация поколения а-Син PFF и применения в естественных условиях имеет решающее значение для того, чтобы обеспечить последовательную, надежную а-Син патологии. Здесь мы представляем подробный протокол для генерации фибрилилл из мономерные, а после-фибриллизации шаги контроля качества, и предложил параметры для успешной нейрохирургической инъекции с-Син ПХФ в крыс или мышей. Начиная с мономерные а-Син, фибриллизации происходит в течение 7-дневного инкубационного периода при встряхивании в оптимальных буферных условиях, концентрации и температуры. Контроль качества после фибриллизации определяется наличием фиброидных фибрилл через седиментации, формирование амилоидных конформации в фибриллами с помощью анализа Тиофлавин т, а электронно-микроскопической визуализации фибрилилл. В то время как успешная проверка с использованием этих анализов необходима для достижения успеха, их недостаточно для гарантии того, что в нейроне будут посевной паф-Син, так как такое агрегирование активности каждой партии pffs должно быть протестировано в клеточной культуре или в пилотных когортах животных. Перед использованием, ПХФ должны быть sonicated при точно стандартизированных условиях, после экспертизы с использованием электронной микроскопии или динамического рассеяния света для подтверждения длины фибрил находятся в пределах оптимального диапазона размеров, со средней длиной 50 Нм. После этого можно добавлять в клеточные носители культуры или использовать их в животных. Патология, обнаруживаемые иммуноокрашивания для фосфорилированных а-Син (псин; Серин 129), является очевидной дней или недель спустя в клеточных культур и грызунов моделей, соответственно.
Болезнь Паркинсона (PD) характеризуется в первую очередь посмертно двумя основными патологическими особенностями: широко распространенной и прогрессивной альфа-нуклеин-патологией (а-Син) и нигростриатальной дегенерацией. После инъекции в дикие мыши или крысы, а-Син преформируются фибриллы (Pффы) индуцируют прогрессивное накопление патологического а-Син, что может привести к затяжной дегенерации субстанции Нигра Парс Компакта (SNpc) дофаминовых нейронов в течение многих месяцев, а также сенсомоторных дефицитов1,2,3,4,5,6. Нейроны подвергаются воздействию а-Син фибриллы, либо через прямой внутримозговой инъекции или добавлены к средствам массовой информации культивируемых нейронов. Когда pффы взяты в нейроны, пафы действуют, чтобы “семя” формирование включений через шаблонирование, и накопление эндогенного а-Син в фосфорилированных включений1,7,8, 9. в Включения имеют сходные свойства с телами Леви: содержащие а-Син фосфорилированные в Серине 129 (Псин), убиквитин и P62; обладают амилоидных четвертичных структур, как показано с положительным окрашивание Тиофлавин; и устойчивы к протеиназы к пищеварению1,3,5,7,8,9,10,11, 12. PFF воздействия приводит к а-Син формирование включения в начальной и некоторые увековечены нейронов в культуре, а также мышей, крыс, и не-человека приматов в естественных условиях1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Важно отметить, что Pффс не приведет к формированию «а-Син» во всех моделях клеточных культур, а некоторые культивированные нейроны будут лучше, чем другие.
Еще одной важной особенностью в естественных условиях-Син PFF модель различных последовательных патологических фаз, которые возникают в течение нескольких месяцев. У грызунов, следующих внутрирасторопиальной инъекции, образование «а-Син» обычно достигает пика в рамках SNpc и многих корковых областей в течение 1-2 месяцев. Этот агрегированный пик сопровождается нигростриатальной дегенерацией ≈ 2-4 месяцев спустя1,3,5. Эти различные патологические этапы предоставляют исследователям платформу для изучения и разработки стратегий, которые 1) уменьшают агрегацию, 2) ясно уже сформированные-Син включения, и/или 3) предотвращают последующее нейродегенерацию. Модель PFF предлагает различные преимущества и недостатки по сравнению с нейротоксикант, трансгенные и вирусные векторные опосредованные модели, как ранее рассмотренные6. Выбор, какую модель или подход принять должны определяться, какая модель лучше всего подходит вопрос следователи просят.
Хотя модель PFF успешно используется во многих лабораториях, есть еще группы, которые испытали несоответствия с генерирования фибриллы и производство последовательной а-Син патологии14. Примеры несоответствий варьируются от ПХФ, которые производят мало или вообще не патологию-Син, партию к пакетной эффективности посева, и даже провал фибрилилл в форме. Таким образом, стандартизация поколения но-Син PFF и в естественных условиях применения имеет решающее значение для того, чтобы обеспечить точное толкование в отношении воздействия новых терапевтических вмешательств. В следующем Протоколе излагаются шаги, необходимые для генерации ПХФ от а-Син мономеров, в пробирке контроля качества из ПХФ когда-то формируется, УЗИ и измерение Pффс до использования, и предложения для облегчения успешного в естественных условиях инъекции В крыс или мышей.
Производство с-Син, способных посевных нейронов и ведущих к Леви тела типа включений зависит от нескольких факторов и шагов. Важнейшим фактором является то, что мономеры, используемые для генерации фибрилилл, должны быть специально сформулированы для фибролизации4,9,14,15. Если мономеры не сформулированы для фибролизации, фибриллы не могут образовываться или фибриллы, которые образуют форму, могут не образовывать патологию-Син. Аналогичным образом, буфер, в котором мономеры также оказывают влияние на фибриллизации. Таким образом, для наилучшего результата концентрация соли должна быть примерно 100 мм и pH между 7,0 и 7,3. Первоначальный шаг, который вводит изменчивость является метод, при котором начальное содержание белка определяется, с измерением на A280 вероятно, для получения более точных результатов и, следовательно, является предпочтительным методом. Несоответствие концентрации белка может снизить эффективность процесса обработки, а также изменить предполагающие концентрацию PFF, используемые в экспериментах. Оба могут привести к снижению эффективности посева и пакетной вариации между экспериментами.
Первоначальные шаги контроля качества подтверждают критические особенности ПХФ, в частности, что они имеют фибриллярной конформации (электронная микроскопия), содержат амилоидные структуры (Тиофлавин т-анализ), и гранулирует (осаждения). Важно отметить, что результаты анализа Тиофлавин т будет колебаться со временем и не являются прямым показателем количества амилоидных структур настоящее время, скорее, Тиофлавин т анализ должен использоваться только в качестве индикатора амилоидных структур присутствие в течение образца. Тиофлавин т, как правило, используется в пробирке анализов, таких, как вышеупомянутый анализ, чтобы показать фибриллы содержат амилоидные структуры. Альтернативно, Тиофлавин S используется в тканях для обнаружения амилоидных структур, как показано на рисунке 7. Что касается седиментации, то результаты показывают только то, что ПХФ находятся преимущественно в фракции гранулитаблицы. По мере того как пробы запускаются в условиях денатурирующих, на гелях присутствует одна видная полоса приблизительно 14 кДа, размером с-Син мономеров. Это в отличие от нескольких полос присутствуют на высших молекулярных весов, которые можно было бы ожидать с Pффс, если родной или не денатурирующих гель был использован. И наконец, успешное прохождение всех этих первоначальных этапов контроля качества не гарантирует включение в него посевной активности. Для этой причины, эксперименты культуры клетки или малая когорта хирургически-впрыснутого животных должны быть использованы для того чтобы испытать эффективность Pффов перед пользой в более больших экспериментах.
Ультразвука является решающим шагом в процессе и параметры будут отличаться в зависимости от модели sonicator используется. Параметры сонофикации должны быть применены и проверены, чтобы показать, что короткие фрагменты PFF были произведены. Размер фибрила имеет подшипник на посеве, с более коротким посева фибрилилл более эффективно. Хотя короткие фибрилл семян более эффективно, этот эффект плато и оптимальной длины PFF составляет около 50 Нм4,18. Кроме того, важно не более-sonicate образцов и подвергать ПХФ к чрезмерному нагреву, так как это может уменьшить эффективность посева. Эти sonicated ПХФ должны быть проверены на эффективность в небольших клеточных культуры или в естественных условиях эксперименты перед использованием в больших масштабах экспериментов. Поскольку различные сеансы сонофикации имеют потенциал для внедрения изменчивости, экспериментальные группы по лечению должны быть запланированы соответствующим образом.
При доставке ПХФ в естественных условиях, локализация места инъекции (s) и общее количество используемых pффов может повлиять на количество нейронов, которые будут развиваться включений, а также степень нейродегенерации7,14. Координаты в протоколе обеспечивают место для начала, но должны быть проверены в лаборатории для обеспечения желаемого целевого региона развивается патология-Син до использования в крупномасштабных экспериментов. При желании, отслеживание красителя или флуоресцентные шарики могут быть использованы как способ тестирования регионального таргетинга перед использованием Pффс. Количество ПХФ, используемых в естественных условиях варьируется между группами, с большинством групп, использующих в общей сложности от 5 до 20 мкг ПФС на один или разделены между двумя инъекцией сайтов1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14. по мере того как число участков инъекции, местоположение мест инъекции и количество вводящих в действие ПХФ могут иметь результаты и прогрессирование синуклеопатии, в нисходящих исходам используемых параметров следует охарактеризовать до использования модели для протестировать потенциальные вмешательства или изучить временные особенности модели.
При выборе модели для использования для тестирования терапии или изучения прогрессирования заболевания, модель, используемая должны быть выбраны, чтобы наилучшим образом ответить на вопрос. Не все модели будут обладать определенными заболеваниями PD, или предлагать временные рамки, необходимые для тестирования потенциальных вмешательств. Модель PFF повторяет ключевые особенности PD, такие как патология-Син и нейродегенерация, и может приводить к незначительным двигательные нарушения. Модель предлагает предсказуемое и длительное время-курс, где включения образуют за несколько месяцев до нейродегенерации. Это позволяет исследователям исследовать и эксплуатировать различные фазы во время длительного прогрессирования синуклеопатии. Текущее и будущее использование модели в целом, как ожидается, будет полезным в изучении прогрессирования заболевания и развития новых методов лечения.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантами Фонда Майкла Джея Фокса, национального института неврологических расстройств и инсульта (NS099416) и Уэстона Института мозга.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |