تُعرض هنا بروتوكولات للاختبارات البيوكيميائية في المختبر باستخدام ملصقات البيوتين التي قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة تفاعلات حمض البروتين والنوى.
تلعب تفاعلات حمض البروتين والنوى أدوارًا هامة في العمليات البيولوجية مثل النسخ وإعادة التركيب والتمثيل الغذائي للحمض النووي الريبي. تتطلب الطرق التجريبية لدراسة تفاعلات الأحماض النووية البروتينية استخدام علامات الفلورسنت أو النظائر المشعة أو التسميات الأخرى للكشف عن جزيئات مستهدفة محددة وتحليلها. البيوتين، وهو تسمية حمض نووي غير مشع، يستخدم عادة في اختبار التحول التنقل الكهربائي (EMSA) ولكن لم يتم استخدامه بانتظام لرصد نشاط البروتين أثناء عمليات الحمض النووي. يوضح هذا البروتوكول فائدة وضع العلامات على البيوتين أثناء التفاعلات الأنزيمية في المختبر، مما يدل على أن هذه التسمية تعمل بشكل جيد مع مجموعة من الاختبارات البيوكيميائية المختلفة. على وجه التحديد، تمشيا مع النتائج السابقة باستخدام النظائر المشعة 32P-المسمى ركائز، وأكد عن طريق EMSA المسمى البيوتين أن MEIOB (بروتين تشارك على وجه التحديد في إعادة تركيب meiotic) هو بروتين الحمض النووي ملزمة، أن MOV10 (وهو حل حالة طائرات الهليكوبتر RNA) الهياكل المزدوجة RNA المسمى البيوتين، وأن MEIOB يشق الحمض النووي الذي يحمل اسم البيوتين. توضح هذه الدراسة أن البيوتين قادر على استبدال 32P في مختلف الاختبارات الكيميائية الحيوية المتعلقة بالحمض النووي في المختبر.
وتشارك تفاعلات حمض البروتين والنوى في العديد من العمليات الخلوية الأساسية مثل إصلاح الحمض النووي، والنسخ المتماثل، والنسخ، ومعالجة الحمض النووي الريبي، والترجمة. التفاعلات البروتينية مع تسلسل الحمض النووي محددة داخل الكروماتين مطلوبة للسيطرة الصارمة على التعبير الجيني في المستوى النسخي1. التنظيم الدقيق بعد النسخ من العديد من الترميز وعدم الترميز RNAs يتطلب تفاعلات واسعة ومعقدة بين أي بروتين وRNA2. هذه الطبقات من آلية تنظيم التعبير الجيني تشمل سلسلة من الأحداث الديناميكية بين الجزيئيات، والتي يتم تنسيقها من خلال تفاعلات العوامل النسخ / الجيني أو البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي مع أهدافها حمض نووي، فضلا عن تفاعلات البروتين والبروتين. لتشريح ما إذا كانت البروتينات في الجسم الحي ترتبط بشكل مباشر أو غير مباشر مع الأحماض النووية وكيف تحدث مثل هذه الجمعيات وتتوج، في المختبر يتم إجراء الاختبارات الكيميائية الحيوية لدراسة التقارب ملزمة أو النشاط الأنزيمي من البروتينات ذات الأهمية على تصميم ركائز الحمض النووي و / أو الحمض النووي الريبي.
وقد تم تطوير العديد من التقنيات للكشف عن وتوصيف المجمعات حمض النووي البروتين، بما في ذلك اختبار التحول التنقل الكهربائي(EMSA)، وتسمى أيضا اختبار التخلف هلام أو الفرقة التحول اختبار 3،4،5 . EMSA هو طريقة كيميائية حيوية متعددة الاستخدامات وحساسة تستخدم على نطاق واسع لدراسة الربط المباشر للبروتينات مع الأحماض النووية. EMSA يعتمد على التحول الكهربائي هلام في العصابات، والتي يتم تصورها بشكل روتيني باستخدام chemiluminescence للكشف عن تسميات البيوتين6،7، الفلورة من تسميات فلوروفور8،9،أو عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي للأشعة 32P التسميات10،11. أغراض أخرى من الدراسات البيوكيميائية هي تحديد وتوصيف نشاط معالجة الحمض النووي للبروتينات، مثل التفاعلات القائمة على النوى لتقييم المنتجات الانقسام من الركيزات حمض نووي12، 13 , 14 والحمض النووي / الحمض النووي الريبي هيكل الفك الاختبارات لتقييم أنشطة طائرات الهليكوبتر15،16،17.
وفي مثل هذه الاختبارات الأنزيمية، كثيراً ما تستخدم الأحماض النووية التي تحمل اسم النظائر المشعة أو التي تحمل اسم الفلوروفور كركائز بسبب حساسيتها العالية. وقد تبين أن تحليل التصوير الإشعاعي لردود الفعل الأنزيمية التي تنطوي على 32P المسمى radiotracers حساسة واستنساخ18 . ومع ذلك، ففي عدد متزايد من المختبرات في العالم، يكون استخدام النظائر المشعة مقيداً أو حتى محظوراً بسبب المخاطر الصحية المرتبطة بالتعرض المحتمل. وبالإضافة إلى الشواغل المتعلقة بالسلامة الأحيائية، تتمثل العيوب الأخرى في المعدات اللازمة اللازمة للقيام بأعمال مع النظائر المشعة، وترخيص النشاط الإشعاعي المطلوب، وفترة نصف العمر القصيرة البالغة 32P (حوالي 14 يوما)، والتدهور التدريجي لنوعية المسبار بسبب الإنهاليس الإشعاعي. وهكذا، تم تطوير أساليب بديلة غير متساوية النظائر (أي أن وضع العلامات على المسبار بالفلوروفوريس يمكّن من الكشف عن طريق التصوير الفلوري19). ومع ذلك، هناك حاجة إلى نظام تصوير عالي الدقة عند استخدام تحقيقات تحمل علامة الفلورسنت. البيوتين، وهي تسمية شائعة الاستخدام، يرتبط بسهولة إلى الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات والأحماض النووية. البيوتين-streptavidin نظام يعمل بكفاءة ويحسن حساسية الكشف دون زيادة خلفية غير محددة20،21. إلى جانب EMSA، يستخدم البيوتين على نطاق واسع لتنقية البروتين وRNA سحب إلى أسفل، من بين أمور أخرى22،23،24.
يستخدم هذا البروتوكول بنجاح الأحماض النووية التي تحمل اسم البيوتين كركائز للاختبارات البيوكيميائية في المختبر التي تشمل EMSA، بالإضافة إلى التفاعلات الأنزيمية التي لم يتم استخدام البيوتين فيها بشكل شائع. يتم بناء المجال OB MEIOB ويتم التعبير عن اثنين من المسوخ (اقتطاع ونقطة طفرة) كما GST البروتينات الانصهار25،26،27، وكذلك الماوس MOV10 المؤتلف علم الانصهار البروتين16. ويسلط هذا التقرير الضوء على فعالية هذا البروتوكول المشترك لتنقية البروتين والاختبارات التي تحمل علامة البيوتين لأغراض تجريبية متنوعة.
التحقيق في تفاعلات الحمض النووي البروتين أمر بالغ الأهمية لفهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء العمليات البيولوجية المتنوعة. على سبيل المثال، MEIOB هو بروتين الخصية محددة ضرورية لmeiosis والخصوبة في الثدييات25،26،27. MEIOB يحتوي على مجال OB الذي ي?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر ب. جيريمي وانغ (جامعة بنسلفانيا) على المناقشات والمناقشات المفيدة. كما نشكر سيغريد إيكاردت على تحرير اللغة. تم دعم K. Z. من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2016YFA0500902، 2018YFC1003500) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771653). تم دعم L. Y. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81471502، 31871503) وبرنامج الابتكار وريادة الأعمال في مقاطعة جيانغسو. J. N. بدعم من تشجيانغ الطبية للعلوم والتكنولوجيا المشروع (2019KY499). تم دعم M. L. من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771588) وخطة المواهب الشبابية 1000.
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Reagents | |||
Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |