In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As
Summary
Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.
Abstract
Les interactions protéines-acides nucléiques jouent un rôle important dans les processus biologiques tels que la transcription, la recombinaison et le métabolisme de l’ARN. Les méthodes expérimentales d’étude des interactions protéines-acides nucléiques nécessitent l’utilisation d’étiquettes fluorescentes, d’isotopes radioactifs ou d’autres étiquettes pour détecter et analyser des molécules cibles spécifiques. La biotine, une étiquette d’acide nucléique non radioactif, est couramment utilisée dans les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) mais n’a pas été régulièrement employée pour surveiller l’activité de protéine pendant des processus d’acide nucléique. Ce protocole illustre l’utilité de l’étiquetage de la biotine lors des réactions enzymatiques in vitro, démontrant que cette étiquette fonctionne bien avec une gamme d’analyses biochimiques différentes. Plus précisément, en accord avec les résultats antérieurs utilisant des substrats radio-isotopes 32étiquetés P, il est confirmé par l’intermédiaire de l’EMSA étiqueté e de biotine que MEIOB (une protéine spécifiquement impliquée dans la recombinaison méiotique) est une protéine liant l’ADN, que MOV10 (un L’hélivraime d’ARN) résout les structures duplex d’ARN labelmées de biotine, et que MEIOB fend l’ADN mono-stranded de biotine-étiqueté. Cette étude démontre que la biotine est capable de substituer 32P dans divers essais biochimiques liés à l’acide nucléique in vitro.
Introduction
Les interactions protéines-acides nucléiques sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que la réparation de l’ADN, la réplication, la transcription, le traitement de l’ARN et la traduction. Des interactions protéiques avec des séquences d’ADN spécifiques dans la chromatine sont nécessaires pour le contrôle serré de l’expression génique au niveau transcriptionnel1. La régulation posttranscriptionnelle précise de nombreux ARN codants et non codants nécessite des interactions étendues et compliquées entre toute protéine et l’ARN2. Ces couches de mécanisme de régulation de l’expression génique comprennent une cascade d’événements intermoléculaires dynamiques, qui sont coordonnés par des interactions entre facteurs de transcription/épigénétiques ou de protéines liant l’ARN avec leurs cibles d’acide nucléique, ainsi que interactions protéines-protéines. Pour disséquer si les protéines in vivo sont directement ou indirectement associées aux acides nucléiques et comment de telles associations se produisent et culminent, des essais biochimiques in vitro sont effectués pour examiner l’affinité de liaison ou l’activité enzymatique des protéines d’intérêt sur substrats d’ADN et/ou d’ARN.
De nombreuses techniques ont été développées pour détecter et caractériser les complexes acide nucléique-protéine, y compris l’analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), également appelée test de retardement de gel ou test de décalage de bande3,4,5 . EMSA est une méthode biochimique polyvalente et sensible qui est largement utilisée pour étudier la liaison directe des protéines avec des acides nucléiques. EMSA s’appuie sur le changement électrophoretique gel dans les bandes, qui sont régulièrement visualisés en utilisant la chemiluminescence pour détecter les étiquettes de biotine6,7, la fluorescence des étiquettes fluorophore8,9, ou par l’autoradiographie des étiquettes radioactives 32P10,11. D’autres fins des études biochimiques sont l’identification et la caractérisation de l’activité de traitement de l’acide nucléique des protéines, telles que les réactions à base de nucléane pour évaluer les produits de clivage à partir de substrats d’acide nucléique12, 13 (en) , 14 et ADN/ARN structure-déroulant des essais pour évaluer des activités d’hélicase15,16,17.
Dans de tels essais d’activité enzymatiques, les acides nucléiques radio-isotopes ou fluorophore-étiquetés sont souvent employés comme substrats en raison de leur sensibilité élevée. L’analyse des radiographies des réactions enzymatiques impliquant 32radiotracers étiquetés P s’est avérée sensible et reproductible18. Pourtant, dans un nombre croissant de laboratoires dans le monde, l’utilisation de radio-isotopes est limitée, voire interdite en raison des risques pour la santé associés à l’exposition potentielle. En plus des préoccupations en matière de biosécurité, d’autres inconvénients sont l’équipement nécessaire pour effectuer des travaux avec des radio-isotopes, une licence de radioactivité requise, une demi-vie courte de 32P (environ 14 jours) et une détérioration graduelle de la qualité de la sonde en raison de radiolyse. Ainsi, d’autres méthodes non isotopiques ont été développées (c.-à-d., l’étiquetage de la sonde avec des fluorophores permet la détection par imagerie fluorescente19). Cependant, un système d’imagerie haute résolution est nécessaire lors de l’utilisation de sondes étiquetées fluorescentes. La biotine, une étiquette couramment utilisée, se lie facilement aux macromolécules biologiques telles que les protéines et les acides nucléiques. Le système de biotine-streptavidin fonctionne efficacement et améliore la sensibilité de détection sans augmenter le fond non spécifique20,21. Outre EMSA, la biotine est largement utilisée pour la purification des protéines et l’ARN pull-down, entre autres22,23,24.
Ce protocole utilise avec succès les acides nucléiques étiquetés biotine comme substrats pour les essais biochimiques in vitro qui incluent EMSA, en plus des réactions enzymatiques dans lesquelles la biotine n’a pas été couramment utilisée. Le domaine OB MEIOB est construit et deux mutants (truncation et mutation ponctuelle) sont exprimés sous forme de protéines de fusion de TPS25,26,27, ainsi que la souris MOV10 protéine de fusion FLAG recombinant16 . Ce rapport souligne l’efficacité de ce protocole combiné pour la purification des protéines et les essais étiquetés biotine à des fins expérimentales diverses.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude des interactions protéine-acide nucléique est essentielle à notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à divers processus biologiques. Par exemple, MEIOB est une protéine spécifique aux testicules essentielle à la méiose et à la fertilité chez les mammifères25,26,27. MEIOB contient un domaine OB qui se lie à l’ADN à brin unique et présente 3′ à 5′ activité d’exonuclease<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions P. Jeremy Wang (Université de Pennsylvanie) pour les modifications et les discussions utiles. Nous remercions également Sigrid Eckardt pour l’édition linguistique. K. Z. a reçu l’appui du National Key R-D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) et de la National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. a reçu le soutien de la National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) et du Programme d’innovation et d’entrepreneuriat de la province du Jiangsu. J. N. a reçu le soutien du Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. a reçu l’appui de la National Natural Science Foundation of China (31771588) et du 1000 Youth Talent Plan.
Materials
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
- Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
- Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA–protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
- Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
- Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
- Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
- Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3′-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
- Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
- Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
- Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O’Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
- Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
- Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
- Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
- Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5′ cap and protected against decapping: new tools to capture RNA – protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
- Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
- Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
- Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).
