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Genetics

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

doi: 10.3791/59830 Published: July 17, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

Abstract

Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in biologischen Prozessen wie Transkription, Rekombination und RNA-Stoffwechsel. Experimentelle Methoden zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen erfordern die Verwendung von Fluoreszenz-Tags, radioaktiven Isotopen oder anderen Etiketten, um bestimmte Zielmoleküle zu erkennen und zu analysieren. Biotin, ein nicht-radioaktives Nukleinsäurelabel, wird häufig in elektrophoretischen Mobilitätsschicht-Assays (EMSA) verwendet, wurde aber nicht regelmäßig zur Überwachung der Proteinaktivität während Nukleinsäureprozessen eingesetzt. Dieses Protokoll veranschaulicht den Nutzen der Biotinkennzeichnung während in vitro enzymatischer Reaktionen und zeigt, dass dieses Etikett gut mit einer Reihe von verschiedenen biochemischen Assays funktioniert. Insbesondere wird in Übereinstimmung mit früheren Befunden mit Radioisotop 32P-markierten Substraten über biotin-markiertes EMSA bestätigt, dass MEIOB (ein Protein, das speziell an der meiotischen Rekombination beteiligt ist) ein DNA-bindendes Protein ist, RNA-Helicase) löst biotinmarkierte RNA-Duplexstrukturen auf und dass MEIOB biotinmarkierte einsträngige DNA spaltet. Diese Studie zeigt, dass Biotin in der Lage ist, 32P in verschiedenen Nukleinsäure-bezogenen biochemischen Assays in vitro zu ersetzen.

Introduction

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Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen sind an vielen wesentlichen zellulären Prozessen wie DNA-Reparatur, Replikation, Transkription, RNA-Verarbeitung und Translation beteiligt. Protein-Wechselwirkungen mit spezifischen DNA-Sequenzen innerhalb des Chromatins sind für die genaue Kontrolle der Genexpression auf der Transkriptionsebene1erforderlich. Eine präzise posttranskriptionelle Regulation zahlreicher kodierender und nicht kodierender RNAs erfordert umfangreiche und komplizierte Wechselwirkungen zwischen jedem Protein und RNA2. Diese Schichten des Regulierungsmechanismus der Genexpression bestehen aus einer Kaskade dynamischer intermolekularer Ereignisse, die durch Wechselwirkungen von Transkriptions-/epigenetischen Faktoren oder RNA-bindenden Proteinen mit ihren Nukleinsäurezielen koordiniert werden, sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen. Um zu sezieren, ob Proteine in vivo direkt oder indirekt mit Nukleinsäuren in Verbindung gebracht werden und wie solche Assoziationen auftreten und kulminieren, werden in vitro biochemische Assays durchgeführt, um die Bindungsaffinität oder enzymatische Aktivität von Proteinen von Interesse auf substrate von DNA und/oder RNA.

Viele Techniken wurden entwickelt, um Nukleinsäure-Protein-Komplexe zu erkennen und zu charakterisieren, einschließlich des elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA), auch als Gel-Retardierungs-Assay oder Band-Shift-Assay3,4,5 bezeichnet . EMSA ist eine vielseitige und empfindliche biochemische Methode, die weit verbreitet ist, um die direkte Bindung von Proteinen mit Nukleinsäuren zu untersuchen. EMSA setzt auf Gel elektrophoretische Verschiebung in Bändern, die routinemäßig mit Chemilumineszenz visualisiert werden, um Biotin-Etikettenzuerkennen 6,7, die Fluoreszenz der Fluorophor-Etiketten8,9, oder durch Autoradiographie radioaktiver 32P-Etiketten10,11. Andere Zwecke biochemischer Studien sind die Identifizierung und Charakterisierung der Nukleinsäure-Verarbeitungsaktivität von Proteinen, wie nukleasingbasierte Reaktionen zur Bewertung der Spaltungsprodukte aus Nukleinsäuresubstraten12, 13 , 14 und DNA/RNA-Struktur-Abwicklungs-Assays zur Bewertung der Helicase-Aktivitäten15,16,17.

Bei solchen enzymatischen Aktivitätstests werden die radioisotop-markierten oder fluorophor-markierten Nukleinsäuren aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit häufig als Substrate verwendet. Die Analyse von Röntgenaufnahmen enzymatischer Reaktionen mit 32P-markierten Radiotracernwurde als empfindlich und reproduzierbar 18 gefunden. Doch in einer wachsenden Anzahl von Laboratorien in der Welt ist die Verwendung von Radioisotopen aufgrund der gesundheitsrechtlichen Risiken, die mit einer möglichen Exposition verbunden sind, eingeschränkt oder sogar verboten. Neben den Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit sind weitere Nachteile die notwendige Ausrüstung für die Durchführung von Arbeiten mit Radioisotopen, die erforderliche Radioaktivitätslizenz, eine kurze Halbwertszeit von 32P (ca. 14 Tage) und eine allmähliche Verschlechterung der Sondenqualität aufgrund von Radiolyse. So wurden alternative nicht-isotopenfreie Methoden entwickelt (d.h. die Kennzeichnung der Sonde mit Fluorophoren ermöglicht die Detektion mittels fluoreszierender Bildgebung19). Bei der Verwendung fluoreszierender Sonden wird jedoch ein hochauflösendes Bildgebungssystem benötigt. Biotin, ein häufig verwendetes Label, bindet leicht an biologische Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren. Biotin-streptavidin System arbeitet effizient und verbessert die Erkennungsempfindlichkeit ohne Erhöhung des unspezifischen Hintergrunds20,21. Neben EMSA wird Biotin häufig zur Proteinreinigung und RNA-Pull-down eingesetzt, unter anderem22,23,24.

Dieses Protokoll verwendet erfolgreich biotinmarkierte Nukleinsäuren als Substrate für in vitro biochemische Assays, die EMSA enthalten, zusätzlich zu enzymatischen Reaktionen, bei denen Biotin nicht häufig verwendet wurde. Die MEIOB-OB-Domäne ist aufgebaut und zwei Mutanten (Abschneide und Punktmutation) werden als GST-Fusionsproteine25,26,27, sowie Maus MOV10 rekombinantes FLAG-Fusionsprotein16exprimiert. Dieser Bericht hebt die Wirksamkeit dieses kombinierten Protokolls für die Proteinreinigung und biotinmarkierte Assays für verschiedene experimentelle Zwecke hervor.

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Protocol

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1. Proteinzubereitung

  1. MEIOB- und MOV10-Ausdruckskonstrukte
    1. Generieren cDNA-Expression konstruktiert Codierungsmaus MEIOB-A, C und E (Abbildung 1A) und MOV10.
      1. Richten Sie die Polymerase-Kettenreaktionsreaktionen (PCR) für jedes Fragment ein. Mischen Sie 1 l Maus-cDNA (aus C57BL/6-Maus-Testis), 1 l dNTP, 2 l von 10 -M Vorwärtsprimer, 2 l von 10 -M-Reverse-Primer, 1 L DNA-Polymerase, 25 l 2x PCR-Puffer und 18 l doppelt destilliertem H2 O(ddH2O) in einem End- Volumen von 50 l.
        HINWEIS: Die Primer für die Verstärkung von Meiob- und Mov10-Genfragmenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
      2. PCR-Reaktionen mit folgenden Programmen durchführen: 95 °C für 5 min, 35 Heizzyklen bei 95 °C für 15 s, Glühen bei 64 °C für 15 s, Verlängerung bei 72 °C für 20 s (2 min für verlängerung der gesamten Länge MOV10) und Endverlängerung bei 68 °C für 7 min.
        HINWEIS: Verwenden Sie das Primerpaar MEIOB-E (F1) und MEIOB-E-mut (R1) und MEIOB-E-mut (F2) und MEIOB-E (R2), um zwei Segmente zu verstärken, die die mutierte Sequenz innerhalb einer überlappenden Sequenz an den Enden 3' bzw. 5' enthalten, um eine mutierte PCR-Vorlage zu generieren.
    2. Analysieren Sie die verstärkte PCR-DNA durch Gelelektrophorese, schneiden Sie das Band der erforderlichen Größe schnell unter einer UV-Lampe aus dem Gel und legen Sie es in ein Zentrifugenrohr.
      HINWEIS: Die erwarteten Produktgrößen auf dem Agarose-Gel für MEIOB-A sind 536 bp, MEIOB-C ist 296 bp, MEIOB-E sind 312 bp und 229 bp, und MOV10 ist 3015 bp.
    3. Reinigen Sie die PCR-DNA mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Herstellerprotokoll.
      1. Fügen Sie dem Zentrifugenrohr ab Schritt 1.1.2 ein gleiches Volumen des Auflösenspuffers hinzu und schmelzen Sie Das gel in einem 50-55 °C Wasserbad für 5-10 min, damit die Gelstücke vollständig schmelzen. Zentrifuge kurz, um tröpft alle Tröpfchen von der Wand des Rohres zu sammeln.
        ANMERKUNG: Die Massen-/Volumenkonzentration des Gels und des Auflösungspuffers beträgt 1 mg/L.
      2. Legen Sie die Adsorptionsspalte in das Sammelrohr, übertragen Sie die Lösung, die das gelöste Gelfragment enthält, in die Adsorptionsspalte und Zentrifugen bei 12.000 x g für 2 min.
      3. Entsorgen Sie das Filtrat an der Unterseite der Sammelrohre. Fügen Sie der Säule 600 l des Waschpuffers, Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min, und entsorgen Sie das Filtrat.
      4. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.3 einmal.
      5. Legen Sie die Säule wieder in das Sammelrohr und Zentrifugen bei 12.000 x g für 2 min, um den verbleibenden Waschpuffer zu entfernen.
      6. Legen Sie die Adsorptionssäule in ein 1,5 ml sterilisiertes Zentrifugenrohr, fügen Sie 50 l ddH2O in die Mitte der Adsorptionssäule und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min. Messen Sie die DNA-Konzentration des Eluats mit Spektralphotometer.
    4. Einschränkung der Verdauung von Plasmiden
      1. Digest pGEX-4T-1 Vektor mit BamHI und NotI. Mischen Sie dazu 4 g pGEX-4T-1-Vektor, 5 l 10x Digest-Puffer, 1 l BamHI und 1 l NotI und ddH2O auf ein Endreaktionsvolumen von 50 l. Bei 37 °C für 2 h inkubieren.
      2. Verdauen Sie den pRK5-Vektor mit BamHI und XhoI, indem Sie 4 g pRK5-Vektor, 5 l 10x Digest-Puffer, 1 l BamHI und 1 L XhoI und ddH2O auf ein endliches Reaktionsvolumen von 50 l mischen. Bei 37 °C für 2 h inkubieren.
    5. Analysieren Sie die Vektor-DNA durch Gelelektrophorese, schneiden Sie das gewünschte Größenband schnell mit einem Skalpell unter einer UV-Lampe aus dem Gel und legen Sie es in ein Zentrifugenrohr.
    6. Reinigen Sie die Vektor-DNA mit einem Gel-Extraktionskit als 1.1.3 nach Anweisung des Herstellers.
      ANMERKUNG: Die Länge der linearisierten Plasmide: pGEX-4T-1, 4.4 kb; pRK5, 4.7 kb.
    7. Richten Sie eine standardrekombinante Ligationsreaktion ein, indem Sie 0,03 pmol linearisierten Vektor, 0,06 pmol cDNA-Fragment, 2 l Ligase und 4 l 5x Ligasepuffer und ddH2O in einem Endreaktionsvolumen von 10 l kombinieren.
      HINWEIS: Klonen Sie MEIOB-A, C und E in einen pGEX-4T-1-Vektor und MOV10 in einen pRK5-Vektor.
    8. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min, und kühlen Sie dann die Reaktion sofort für 5 min auf Eis. Transformieren Sie MEIOB-rekombinante Plasmide in BL21-Bakterien und MOV10-rekombinante Plasmide in DH5-Bakterien.
      HINWEIS: Überprüfen Sie alle rekombinanten Konstrukte durch Sanger-Sequenzierung.
    9. Bereiten Sie Glyzerinbestände von Bakterienkulturen vor, die verifizierte rekombinante Plasmide enthalten, indem Sie flüssigen Kulturen ein gleiches Volumen von 50 % Glycerin hinzufügen und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Streichen Sie für jedes nachfolgende Experiment Bakterien aus Glyzerinbeständen auf eine frische Agarplatte und verwenden Sie eine einzige Kolonie für die Expansion, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  2. MEIOB Proteinextrakte aus Bakterien
    1. Wählen Sie eine Kolonie jedes BL21-Stamms, der mit dem leeren oder rekombinanten pGEX-4T-1-Plasmid transfiziert ist, das durch Sequenzierung verifiziert wird, und impfen Sie in 3 ml LB, der 100 g/ml Ampicillin enthält. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm wachsen.
    2. 300 ml ulkulieren, mit 100 g/ml Ampicillin ab 3 ml Nachtkultur (ab Schritt 1.2.1). Wachsen Sie die Kulturen mit Schütteln bei 37 °C für 2 h, bis OD600 0,5-1,0 erreicht.
    3. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl beta-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,2 mM. Inkubieren Sie die Kulturen für weitere 3 h mit Schütteln bei 180 Rpm und 18 °C.
    4. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 3.500 x g und 4 °C für 20 min.
    5. Setzen Sie das Pellet in 20 ml eiskalten Dulbecco-Phosphat-Gepufferten Saline-Puffer (DPBS) wieder aus. Sonicate die bakterielle Suspension auf Eis für 25 Zyklen in kurzen 10 s Bursts (Ausgangsleistung 20%) gefolgt von 2-3 s auf Eis ruhen.
    6. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 x g und 4 °C für 15 min. Übertragen Sie den gesamten Überstand auf ein frisches Rohr.
    7. Vorwaschen Perlen.
      1. Fügen Sie 300 L Glutathion-Sepharose-Perlen in ein frisches 15 ml-Rohr und waschen Sie die Perlen mit 10 ml eiskaltem PBS-Puffer.
      2. Zentrifugieren Sie bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet und die Waschlösung zu entsorgen.
    8. Das Lysat in die gewaschenen Perlen geben und bei 4 °C für 2 h brüten. Zentrifugieren bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet. Spülen Sie die Perlen in 10 ml eiskalte PBS 8x.
    9. Die Perlen mit 1 ml des Elutionspuffers (10 mM Glutathion in 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0) 6x, inkubieren bei 4 °C für 10 min vor jedem Elutionsschritt. Zentrifuge bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet. Sammeln und poolen Sie die 6 Fraktionen.
    10. Übertragen Sie die eluierten Proteine in einen Zentrifugalfilter und konzentrieren Sie sich durch Zentrifugation bei 7.500 x g, um ein Endvolumen von 100-200 l zu erhalten.
  3. MOV10 Proteinextrakte aus HEK293T Zellen
    1. Die MOV10-Proteine in kultivierten HEK293T-Zellen exprimieren.
      1. Bereiten Sie MOV10-pRK5 Plasmid in einer Konzentration von >500 ng/L vor.
      2. Samen HEK293T Zellen in 15 cm Geschirr. Wenn die Zelldichte 70%-90% erreicht, ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch das frische Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.
      3. Für eine Transfektion 60 g MOV10-pRK5-Plasmid-DNA in 3 ml des reduzierten Serummediums verdünnen, dann 120 l des Transfection Enhancer Reagenz hinzufügen und gut mischen.
      4. In einem separaten Rohr 90 l des Transfektionsreagenzes mit 3 ml reduziertem Serummedium (ohne Penicillin-Streptomycin) verdünnen und gut vermischen.
      5. Fügen Sie die verdünnte DNA zu jeder Tube des verdünnten Transfektionsreagenzhinzuers hinzu. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
      6. Fügen Sie die Transfektionsmischung der Zellkultur hinzu, und fügen Sie Kulturzellen für 36-48 h hinzu.
    2. Nach 36-48 h, sammeln Zellen von jeder Platte in einem 50 ml Rohr. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Waschen Sie jedes Pellet mit 10 ml eiskaltem PBS und sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
    3. Setzen Sie das Pellet in 3 ml Zelllysepuffer mit vollständigem Ehylenidemintetraessigsäure (EDTA)-freiem Protease-Inhibitor-Cocktail aus. 30 min auf Eis bebrüten. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 x g und 4 °C für 20 min.
    4. Fügen Sie 100 l Anti-FLAG-Magnetperlen pro Schale der Zellen in einem 1,5 ml-Rohr hinzu.
    5. Waschen Sie die Magnetperlen 2x mit K150 Puffer (50 mM HEPES bei pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Die Magnetperlen in 1 ml eiskaltem K150-Puffer wieder aufhängen.
      2. Inkubieren Sie die Magnetperlen für 2 min bei 4 °C mit sanfter Rotation und pellet die Magnetperlen mit Hilfe eines Magneten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
    6. Fügen Sie die magnetischen Perlen zum Zelllysatüberstand ab Schritt 1.3.3 hinzu und brüten Sie bei 4 °C für 2 h.
    7. Waschen Sie die proteingebundenen Magnetperlen 3x mit K150 Puffer, dann 2x mit K150 mit 250 mM NaCl, dann 3x mit K150 Puffer als 1.3.5.
    8. Die Perlen in 300 l FLAG-Elutionspuffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 % Glycerin) wieder aufhängen, FLAG-Peptid zu einer Endkonzentration von 0,5 g/l hinzufügen und mit Perlen auf einem Rotator bei 4 °C für 1 h brüten , dann Pellet die magnetischen Perlen mit Hilfe eines Magneten.
    9. Sammeln Sie den Überstand, der die eluierten MOV10-Proteine enthält, bestimmen Sie die Konzentration und lagern Sie bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.

2. Nukleinsäurezubereitung

  1. Kaufen Sie DNA- und RNA-Oligonukleotide (Oligos) mit oder ohne Biotin-Etiketten aus einer geeigneten Quelle. Verdünnen Sie jeden Oligo in RNase-freiem ddH2O bis 20 m und halten Sie ihn bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Oligosequenzen von DNA/RNA-Substraten sind in Tabelle 2aufgeführt.
  2. Folgende Mischung für die doppelsträngige RNA (dsRNA) Glühreaktion für DEN MOV10 Helicase-Aktivitätstest vorbereiten: Mischen Sie 60 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-Ethan-Sulfonsäure (HEPES) bei pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 und RNase-frei ddH2 O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l.
  3. Anneale RNA-Oligos zu RNA-Duplex, indem sie eine Mischung aus dem biotin-markierten OberenStrang (2 M, Endkonzentration) und einem 1,5-fachen seines unbeschrifteten komplementären Bodenstrangs im Glühpuffer (Schritt 2.2) bei 95 °C für 5 min erhitzen und dann langsam in den Raum abkühlen Temperatur (RT).

3. In vitro biochemische Assays

  1. EMSA und enzymatische Reaktionen
    1. Für den MEIOB EMSA-Test 50 mM Tris HCl bei pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mM (oder andere relevante Konzentrationen wie in Abbildung 2 und Abbildung3) MEIOB-Protein und 10 nM biotin-markierte Oligonukleotide und ddH2 O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l. Inkubieren Sie bei RT für 30 min, und fügen Sie 5x Stop-Puffer (125 mM EDTA, 50% Glycerin) hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
    2. Richten Sie MEIOB-Nukleaseaktivitätsreaktionen wie in Schritt 3.1.1 beschrieben ein, jedoch ohne Zugabe von 10 mM EDTA.
    3. Für den MOV10 Helicase-Aktivitätstest 50 mM Tris-HCl bei pH 7,5 mischen, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/L RNase-Inhibitor, 10 nM biotin-markiertes RNA-Substrat, 2 mM Adenosintriphosphat (ATP), 100 nM RNA-Falle und 20 ng MOV10-Protein und ddH-C6 >2O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 10 min, 30 min und 60 min. Fügen Sie den 5x Stop-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
      HINWEIS: RNA-Falle, ein biotinunbeschriftetes Oligo mit Sequenz, Komplementarität zum markierten Oligo, die verhindert, dass die ungewickelte dsRNA wieder glüht.
  2. Polyacrylamid-Gel
    1. Waschen Sie die Gelplatten (16 cm x 16 cm) und 1,5 mm Kämme. Montieren Sie die Gelelektrophoreseeinheiten.
    2. Zur Herstellung eines 10% nativen Polyacrylamidgels 14 ml ddH2O, 1,25 ml 10x Tris-Borsäure-EDTA (TBE), 8,3 ml 30% Acrylamid, 1,25 ml 50% Glycerin, 187,5 l 10% frisch zubereitetes Ammoniumpersulfat (APS) und 12,5 ml Tetramethylethylendiamin (TEMED).
    3. Zur Herstellung eines 20% nativen Polyacrylamidgels 5,5 ml ddH2O, 1,25 ml 10x TBE, 1,25 ml 50% Glycerin, 16,7 ml 30% Acrylamid, 187,5 l mit 10 % APS und 12,5 l TEMED mischen.
    4. Die Acrylamidlösung sofort in das Gel geben und den Kamm einlegen. Lassen Sie die Mischung ca. 30 min polymerisieren.
  3. Gellauf
    1. Entfernen Sie den Kamm, füllen Sie die Tanks mit dem Elektrophorese-Laufpuffer (0,5x TBE).
    2. Spülen Sie die Probenbrunnen mit 0,5x TBE-Puffer, dann führen Sie das Gel bei 100 V auf Eis für 30 min vor. Ersetzen Sie den Laufpuffer durch frischen 0,5x TBE.
    3. Laden Sie 20-25 L Proben in jeden Bohrwert.
    4. Verwenden Sie ein 10% natives Acrylamid-Gel für den EMSA-Assay und ein 20% natives Acrylamid-Gel für die enzymatischen Assays. Elektrophorese bei 100 V im Eisbad laufen lassen, bis der Bromphenolblaumarker in das untere Viertel des Gels migriert ist.
  4. Zerlegen Sie die Gelplatten, trimmen Sie das Gel, indem Sie Ladebrunnen und ungenutzte Bahnen entfernen. Legen Sie das Gel in 0,5x TBE-Puffer.
  5. Schneiden Sie das Filterpapier und die Nylonmembran auf die Größe des Gels. Das saubere Filterpapier und die Nylonmembran vorbefeuchten.
  6. Montieren Sie den Stapel für die Übertragung.
    1. Legen Sie die vornasse Membran auf das vornasse Filterpapier.
    2. Legen Sie das Gel auf die Membran.
    3. Bedecken Sie das Gel mit einer weiteren Schicht vornassen Filterpapiers.
    4. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie eine saubere Pipette von der Mitte bis zum Rand rollen.
  7. Übertragen Sie die Proben vom Gel in einem halbtrockenen elektrophoretischen Gerät bei 90 mA für 20 min auf die Membran.
  8. Stoppen Sie den Transfer, und trocknen Sie dann die Membran auf einem neuen Filterpapier für 1 min.
  9. Vernetzen Sie die Proben, indem Sie die Membran bei 120 mJ/cm2 für 45-60 s in einem UV-Licht-Vernetzenmiten mit 254 nm Glühbirnen (Auto-Crosslink-Funktion) bestrahlen. Die Membran bei RT 30 min an der Luft trocknen.
  10. Chemilumineszenz-Erkennung
    1. Protokoll 1: Verwenden Sie ein Standardvolumen des kommerziellen Chemilumineszenz-Nukleinsäuredetektionskits.
      1. Fügen Sie 20 ml Sperrpuffer in die Membran und inkubieren für 15-30 min mit sanftem Schütteln auf einem Rotator bei 20-25 Rpm.
      2. Bereiten Sie konjugierende/blockierende Pufferlösung vor, indem Sie 66,7 l stabilisiertes Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat zu 20 ml Blockierpuffer hinzufügen.
      3. Entfernen Sie den Sperrpuffer vorsichtig und ersetzen Sie ihn durch einen Konjugat-/Blockierungspuffer. 15 min auf einem Rotator bei 20-25 Rpm inkubieren.
      4. Waschen Sie die Membran 4x mit Schütteln bei 40-45 Rpm für jeweils 5 min.
      5. Fügen Sie der Membran 30 ml Substratausgleichspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Membran für 5 min mit Schütteln bei 20-25 Rpm.
      6. Bereiten Sie substratverarbeitende Lösung durch Zugabe von 6 ml L L L L L L L L L L L L L stabiler Peroxidlösung vor. Vermeiden Sie Licht.
      7. Bedecken Sie die gesamte Oberfläche der Membran mit Substratarbeitslösung und brüten Sie für 5 min.
      8. Scannen Sie die Membran in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem für 1-3 s.
    2. Protokoll 2: Verwenden Sie 2x verdünnte kommerzielle Chemilumineszenz Nukleinsäure-Detektionkit und folgen Sie den Schritten 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. Protokoll 3: Verwenden Sie selbsthergestellte Reagenzien6.
      1. Vorbereiten des Sperrpuffers: Mischen Sie 0,1 M Tris-HCl bei pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2und 3% Rinderserumalbumin Fraction V. AP 7.5 Puffer: Mix 0.1 M Tris-HCl bei pH 7,5, 0,1 M NaCl und 2 mM MgCl2. AP 9.5 Puffer: Mix 0.1 M Tris-HCl bei pH 9,5, 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl2. TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0, 1 mM EDTA bei pH 8,0 mischen.
      2. Die Membran im Sperrpuffer bei 30 °C für 1 h einweichen.
      3. Fügen Sie 8,5 l Streptavidin alkalische Phosphatase zu 10 ml AP 7.5 Puffer hinzu. Schütteln Sie die Membran in dieser Lösung bei RT 10 min. Dann waschen Sie die Membran 2x in 15 ml AP 7.5 Puffer für 10 min.
      4. Waschen Sie die Membran noch einmal in 20 ml AP 9.5 Puffer für 10 min. Fügen Sie 20 ml TE Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
      5. Fügen Sie 7,5 ml Entwicklungslösung auf die Membran, und scannen Sie die Membran in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem für 1-3 s.

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Representative Results

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Die Proteinstruktur von MEIOB und die in dieser Studie verwendeten Expressionskonstrukte sind in Abbildung 1Adargestellt. OB-Falten in MEIOB sind kompakte fassartige Strukturen, die einsträngige Nukleinsäuren erkennen und mit ihnen interagieren können. Eine der OB-Domänen (aa 136-307, Konstrukt A) bindet einsträngige DNA (ssDNA), das abgeschnittene Protein (aa 136-178 Schnitte, Konstrukt C) und die punktmutierte Form (R235A Mutation, Konstrukt E) von MEIOB haben keine DNA-bindende Aktivität26. Die GST-MEIOB-Fusionsproteine wurden in BL21-Bakterien überexprimiert, mit nachfolgenden Isolationsschritten, die zu gereinigten Proteinen führten, die durch Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse gezeigt wurden (Abbildung 1B). Nukleinsäuresubstrate in unterschiedlichen Konzentrationen veranschaulichen die hohe Empfindlichkeit des Biotinsignals mit einem nachweisbaren Signal von 1 nM Oligo nach einer relativ kurzen Belichtungszeit für 1-3 s (Abbildung 2A). Das Wildtyp-MEIOB-A-Protein, nicht aber die mutierten MEIOB-E- und MEIOB-C-Proteine, bindet stark an 36 nt biotinmarkierte ssDNA-Substrate (die gleiche Länge und Sequenz wie bisher26) (Abbildung 2B) und spaltet die Substrate in Leitern (Abbildung 2C).

Der In-vitro-Assay von MEIOB-Proteinen mit RNA-Oligos in der gleichen Sequenz wie ssDNA-Substrate in Abbildung 2B,C veranschaulicht die Bindungsfähigkeit und Exonukleaseaktivität von MEIOB auf 36 nt einsträngiger RNA (ssRNA) (Abbildung 3A,B ). Die Bindungsaktivität von MEIOB mit DNA und RNA wurde weiter quantitativ analysiert (Abbildung 3C). Zusätzlich wurden FLAG-markierte MOV10-Proteine aus HEK293T-Zellen gereinigt (Abbildung 4A). Zur Messung der Helicase-Aktivität von MOV10 wurde eine Duplex-RNA entwickelt (gleiche Länge, aber andere Sequenz als bisher16) mit einem 18 nt 5' Überhang (Abbildung 4B). Als das biotinmarkierte RNA-Duplex in Gegenwart von ATP mit MOV10 inkubiert wurde, erschien mit zunehmender Zeit ein niedrigeres Band, das der freigesetzten einsträngigen biotin-markierten RNA entsprach, was die Funktion des MOV10 als RNA-Helicase widerspiegelte. Um die Kosten zu senken, wurde schließlich versucht, die Verwendung von Reagenzien für den Chemilumineszenznachweis des Biotin-Etiketts zu optimieren. Es wurde festgestellt, dass eine zweifache Verdünnung des chemilumineszierenden Nukleinsäuredetektionskits die chromogene Empfindlichkeit des Biotin-Streptavidin-Systems nicht negativ beeinflusste, und aufregenderweise funktionierten die selbsthergestellten Reagenzien fast gleich gut (Abbildung5 ).

Figure 1
Abbildung 1 : Reinigung von MEIOB-Proteine. (A) Schematische Darstellung der in dieser Studie verwendeten MEIOB-Konstrukte26. MEIOB enthält eine OB-Domäne. Alle MEIOB-Konstrukte (A, C, E) wurden als GST-Fusionsproteine exprimiert. (B) Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse der MEIOB-Proteine, die mit dem GST-Bakteriensystem gereinigt werden. Die roten Pfeile zeigen die Positionen der gereinigten MEIOB-Proteine an. Bänder bei ca. 26 KDa entsprechen Glutathion. Für Western Blot wurde Anti-GST-Antikörper mit 1:6000 Verdünnung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : In-vitro-Assays von MEIOB-ssDNA-Wechselwirkungen . (A) Signalfestigkeitstest mit unterschiedlichen Konzentrationen von 36 nt Biotin-markierter ssDNA. (B) EMSA-Ergebnis der MEIOB-Proteinbindung an Biotin 5' endmarkierte DNA-Substrate (10% natives Gel). (C) MEIOB-vermittelte Spaltung von Biotin 5' endmarkierten DNA-Substraten (20% natives Gel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : In-vitro-Assays von MEIOB-ssRNA-Wechselwirkungen. (A) EMSA-Ergebnis der MEIOB-Proteinbindung an Biotin 5' endmarkierte RNA-Substrate (10% natives Gel). (B) MEIOB-vermittelte Spaltung von Biotin 5' endmarkierten RNA-Substraten (20% natives Gel). (C) Diagramm des Prozentsatzes der DNA/RNA-gebundenen im Vergleich zur MEIOB-A-Konzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Gereinigtes MOV10-Protein und seine Abrollung von 5' tailed dsRNA in vitro. (A) Coomassie blaue Färbung des MOV10-Proteins, das mit dem FLAG-HEK293T-System gereinigt wird. Die roten Pfeile zeigen die Positionen des gereinigten MOV10-Proteins an. Bänder am Coomassie-Gel mit einem Molekulargewicht von ca. 55 kDa entsprechen der schweren Immunglobulinkette (IgG) des FLAG-Antikörpers. (B) MOV10 entlädt 5' tailed dsRNA mit zunehmender Zeit (10, 30, 60 min) bei 37 °C. ssRNA = 18 nt einsträngige RNA, dsRNA = 54 nt doppelsträngige RNA mit einem 18 nt 5' Schwanz (20% natives Gel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Alternative Methoden von Verwendung von Biotin chromogen Reagenz s auf MEIOB-Test. Kommerzielles Standardvolumen: angewiesen durch chemiluminescent Nukleinsäure-Detektionskit; 2x verdünntes Handelsvolumen: zweifache Verdünnung jedes Puffers in chemilumineszierendem Nukleinsäure-Detektionskit, selbsthergestellte Reagenzien: siehe Details in Schritt 3.7.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Table 1
Tabelle 1: Primer zur PCR-Verstärkung des Gens Fragmente von Meiob und Mov10. Die fetten Buchstaben in Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen sind BamHI- und NotI-Schneidstellen; die kursiven Fettbuchstaben in einer umgekehrten Grundierung sind XhoI-Schneidstellen; Die fett gedruckten Buchstaben in den Feldern geben die Nukleotide an, die der Punktmutation R235A entsprechen.

Table 2
Tabelle 2: Sequenzen von DNA/RNA-Substraten, die in dieser Arbeit verwendet werden.

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Discussion

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Die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen ist entscheidend für unser Verständnis molekularer Mechanismen, die verschiedenen biologischen Prozessen zugrunde liegen. Zum Beispiel ist MEIOB ein Testis-spezifisches Protein, das für Meiose und Fruchtbarkeit bei Säugetieren25,26,27unerlässlich ist. MEIOB enthält eine OB-Domäne, die an einsträngige DNA bindet und eine 3' bis 5' Exonukleaseaktivität26aufweist, die sich direkt auf ihre physiologische Relevanz während der meiotischen Rekombination bezieht. Als weiteres Beispiel ist MOV10 ein RNA-Helicase mit allgegenwärtiger Funktion, der mit RNA-Sekundärstrukturen assoziiert werden kann16. Dementsprechend zeigt MOV10 breite RNA-bindende Eigenschaften und 5' bis 3' RNA-Duplex-Abwickelaktivität16. Die Studien, die über die oben genannten biochemischen Aktivitäten dieser Proteine berichteten, stützten sich auf die Verwendung von 32P-Isotopen, um Nukleinsäuren für In-vitro-Assays zu kennzeichnen. In der vorliegenden Studie haben wir Protokolle für eine Reihe von biotin-markierten In-vitro-Experimenten der MEIOB- und MOV10-Funktion erstellt. Diese Protokolle beginnen mit der Herstellung von aktiven Proteinen und endeten mit der Abbildung von Biotinsignalen.

Insbesondere, im Einklang mit früheren Studien25,26, MEIOB Proteine wurden in Bakterien mit und Reinigung ergab ein einziges Band mit starken Coomassie Färbung Signal nach Gel Elektrophorese. Die Reinigung des MOV10-Proteins in voller Länge war jedoch wirksamer, wenn es in HEK293T-Zellen als FLAG-Tag-fused Protein überexprimiert wurde, als als GST-verschmolzenes Protein in Bakterien (Daten nicht gezeigt). Um ausreichende Mengen an Protein bei ausreichender Reinheit für nachfolgende Reaktionen zu erhalten, müssen diese beiden Systeme der Proteinreinigung verglichen werden, um die am besten geeignete Methode für Proteine mit unterschiedlichen Größen und/oder Eigenschaften zu bestimmen. Nukleinsäuren wurden dann mit Biotin anstelle von 32P als Substrat gekennzeichnet und erhielten ein robustes Signal bei der Untersuchung der Nukleinsäure-bindenden Affinität oder Nukleinsäure-Verarbeitung von beiden Proteinen. Da jedoch Proteine, die von Bakterien gereinigt werden, häufig mit RNase kontaminiert sind, ist es schwierig auszuschließen, dass die Spaltungsaktivität, die während der In-vitro-Reaktion beobachtet wird, zum Teil durch eine Kontamination der RNase resultieren kann. In-vitro-Assays mit MEIOB-Mutanten mit reduzierter katalytischer Aktivität (abgeschnitten und punktmutiert) zeigten eine erhebliche Beeinträchtigung der RNA-Substratverarbeitung, eine mögliche RNase-Kontamination kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse, die mit jedem meiOB-Konstrukt auf ssDNA und MOV10 Abwickel dsRNA erhalten wurden, sind ähnlich denen, die in der vorherigen Studie16,26erhalten wurden. MEIOB verarbeitet jedoch DNA, um einen Abstrich zu erzeugen, während ein diskreteres Band mit RNA gemäß den experimentellen Ergebnissen gesehen wird (Abbildung 2C und Abbildung 3B). Möglicherweise verfügt MEIOB über Differentialbindungsfähigkeiten an DNA und RNA-Substrat (Abbildung 2B, Abbildung 3A,C), was zu einem Unterschied in ihren Spaltprodukten führt. Es kann auch sein, dass MEIOB DNA und RNA in einer deutlichen Weise spaltet. Die genaue Rolle von MEIOB in der RNA-Verarbeitung muss noch weiter untersucht werden (z. B. mit FLAG-Tag-fused MEIOB-Protein in HEK293T-Zellen exprimiert).

Biotin-markierte Nukleinsäuresonden sind gegenüber 32P-markierten Sonden insofern vorteilhaft, als sie keinen spezifischen Schutz und keine Abfallentsorgung erfordern. Zweitens können biotinmarkierte Sonden mindestens 1 Jahr lang bei -20 °C stabil konserviert werden, während 32P-markierte Sonden nur 2 Wochen halten. Daher kann die gleiche Charge der biotinmarkierten Nukleinsäuren über einen langen Zeitraum verwendet werden, wobei die Reproduzierbarkeit von Experimenten erhalten bleibt. Schließlich kann eine schnelle Autoradiographie radioaktiver Sonden von teuren Instrumenten wie Phosphor-Bildschirm abhängen. Im Gegensatz dazu können alle hier beschriebenen biotinmarkierten Assays innerhalb eines Tages durchgeführt werden und benötigen keine spezielle Ausrüstung. Die Nachteile der Biotinkennzeichnung umfassen vor allem zusätzliche experimentelle Schritte wie Geltransfer und Chemilumineszenz, die zum Nachweis biotinmarkierter Substrate notwendig sind, aber zusätzlich Optimierung oder Fehlerbehebung erfordern können. Eine weitere allgemeine Schwäche ist die relativ geringe Empfindlichkeit der Biotin-Etikettierung im Vergleich zur Radioisotopenkennzeichnung. In diesen Assays wurde jedoch ein gut sichtbarer Nachweis einer sehr geringen Konzentration von Nukleinsäuren erreicht (Abbildung 2A).

Darüber hinaus eignet sich ein halbtrockenes Gel-Transfergerät für die Übertragung länger als regulärer Gele auf Membranen. Im Vergleich zum Nasstransfer ist der halbtrockene Transfer vor allem bei Nukleinsäuren schneller und ergibt ein niedriges Hintergrundsignal. Darüber hinaus wurden die Kosten für die chromogene Reaktion des Biotin-Streptavidin-Systems durch verdünnender oder eigene, die beide ähnliche Signale erreichten, gesenkt. Die Nachweisempfindlichkeit der selbsthergestellten Reagenzien mag zwar nicht so hoch, wenn auch hierin ausreichend erscheinen (Abbildung 5C), aber sie kann durch Verlängerung der Sperrzeit (unveröffentlichte Daten) verbessert werden. Auch können die Signale mit einer erhöhten Konzentration der Nukleinsäuresonde, die für die Assays verwendet wird, verstärkt werden. Angesichts der oben genannten experimentellen Beweise kann das Biotin-Label ein vorteilhafter Ersatz für 32P in mehreren biochemischen In-vitro-Tests sein.

Insgesamt bietet dieses Protokoll eine biotinmarkierte Plattform für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, die sich als robust, zuverlässig, effizient und erschwinglich erweist.

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Disclosures

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Acknowledgments

Wir danken P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) für hilfreiche Bearbeitungen und Diskussionen. Wir danken auch Sigrid Eckardt für die Sprachbearbeitung. K. Z. wurde von national Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) und national Natural Science Foundation of China (31771653) unterstützt. L. Y. wurde von der National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) und dem Innovative and Entrepreneurial Program der Provinz Jiangsu unterstützt. J. N. wurde vom Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499) unterstützt. M. L. wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31771588) und des 1000 Youth Talent Plan unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Germany 5242R
Chemiluminescent Imaging System Tanon, China 5200
Digital sonifer Branson, USA BBV12081048A 450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotter Hoefer, USA TE77XP
Tube Revolver  Crystal, USA 3406051
UV-light cross-linker UVP, USA CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter  Milipore, USA UFC801096 4 ml/10 K
Nylon membrane Thermo Scientific, USA TG263940A
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430167 100 mm 
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430597 150 mm 
Microtubes tubes AXYGEN, USA MCT-150-C 1.5 mL 
Tubes Corning, USA 430791 15 mL
Reagents 
Ampicillin SunShine Bio, China 8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beads Sigma, USA M8823
ATP Thermo Scientific, USA 591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime, China C3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent  Sigma, USA 107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit  Vazyme, China C112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit Thermo Scientific, USA T1269950
dNTP Sigma-Aldrich, USA DNTP100-1KT
DMEM Gibco, USA 10569044
DPBS buffer Gibco, USA 14190-136
EDTA Invitrogen, USA AM9260G 0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktail Roche, USA 04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit  Vazyme, China  
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit Vazyme, China DC301-01
FBS Gibco, USA 10437028
FLAG peptide Sigma, USA F4799
Glycerol Sigma, USA SHBK3676
GST Bulk Kit GE Healthcare, USA 27-4570-01
HEPES buffer Sigma, USA SLBZ2837 1 M 
IPTG Thermo Scientific, USA 34060
KoAc Sangon Biotech, China 127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent Thermo Scientific, USA L3000001
MgCl2 Invitrogen, USA AM9530G 1 M
NaCl Invitrogen, USA AM9759
 
5 M 
NP-40 Amresco, USA M158-500ML
Opti-MEM medium Gibco, USA 31985062
PBS Gibco, USA 10010023 PH 7.4
RNase Inhibitor Promega, USA N251B
Streptavidin alkaline phosphatase Promega, USA V5591
TBE Invitrogen, USA 15581044
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15567027 1 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15568025 1 M, PH 8.0
Tween-20 Sangon Biotech, China A600560

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References

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In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen
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Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).More

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).

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