In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen
Summary
Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.
Abstract
Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in biologischen Prozessen wie Transkription, Rekombination und RNA-Stoffwechsel. Experimentelle Methoden zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen erfordern die Verwendung von Fluoreszenz-Tags, radioaktiven Isotopen oder anderen Etiketten, um bestimmte Zielmoleküle zu erkennen und zu analysieren. Biotin, ein nicht-radioaktives Nukleinsäurelabel, wird häufig in elektrophoretischen Mobilitätsschicht-Assays (EMSA) verwendet, wurde aber nicht regelmäßig zur Überwachung der Proteinaktivität während Nukleinsäureprozessen eingesetzt. Dieses Protokoll veranschaulicht den Nutzen der Biotinkennzeichnung während in vitro enzymatischer Reaktionen und zeigt, dass dieses Etikett gut mit einer Reihe von verschiedenen biochemischen Assays funktioniert. Insbesondere wird in Übereinstimmung mit früheren Befunden mit Radioisotop 32P-markierten Substraten über biotin-markiertes EMSA bestätigt, dass MEIOB (ein Protein, das speziell an der meiotischen Rekombination beteiligt ist) ein DNA-bindendes Protein ist, RNA-Helicase) löst biotinmarkierte RNA-Duplexstrukturen auf und dass MEIOB biotinmarkierte einsträngige DNA spaltet. Diese Studie zeigt, dass Biotin in der Lage ist, 32P in verschiedenen Nukleinsäure-bezogenen biochemischen Assays in vitro zu ersetzen.
Introduction
Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen sind an vielen wesentlichen zellulären Prozessen wie DNA-Reparatur, Replikation, Transkription, RNA-Verarbeitung und Translation beteiligt. Protein-Wechselwirkungen mit spezifischen DNA-Sequenzen innerhalb des Chromatins sind für die genaue Kontrolle der Genexpression auf der Transkriptionsebene1erforderlich. Eine präzise posttranskriptionelle Regulation zahlreicher kodierender und nicht kodierender RNAs erfordert umfangreiche und komplizierte Wechselwirkungen zwischen jedem Protein und RNA2. Diese Schichten des Regulierungsmechanismus der Genexpression bestehen aus einer Kaskade dynamischer intermolekularer Ereignisse, die durch Wechselwirkungen von Transkriptions-/epigenetischen Faktoren oder RNA-bindenden Proteinen mit ihren Nukleinsäurezielen koordiniert werden, sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen. Um zu sezieren, ob Proteine in vivo direkt oder indirekt mit Nukleinsäuren in Verbindung gebracht werden und wie solche Assoziationen auftreten und kulminieren, werden in vitro biochemische Assays durchgeführt, um die Bindungsaffinität oder enzymatische Aktivität von Proteinen von Interesse auf substrate von DNA und/oder RNA.
Viele Techniken wurden entwickelt, um Nukleinsäure-Protein-Komplexe zu erkennen und zu charakterisieren, einschließlich des elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA), auch als Gel-Retardierungs-Assay oder Band-Shift-Assay3,4,5 bezeichnet . EMSA ist eine vielseitige und empfindliche biochemische Methode, die weit verbreitet ist, um die direkte Bindung von Proteinen mit Nukleinsäuren zu untersuchen. EMSA setzt auf Gel elektrophoretische Verschiebung in Bändern, die routinemäßig mit Chemilumineszenz visualisiert werden, um Biotin-Etikettenzuerkennen 6,7, die Fluoreszenz der Fluorophor-Etiketten8,9, oder durch Autoradiographie radioaktiver 32P-Etiketten10,11. Andere Zwecke biochemischer Studien sind die Identifizierung und Charakterisierung der Nukleinsäure-Verarbeitungsaktivität von Proteinen, wie nukleasingbasierte Reaktionen zur Bewertung der Spaltungsprodukte aus Nukleinsäuresubstraten12, 13 , 14 und DNA/RNA-Struktur-Abwicklungs-Assays zur Bewertung der Helicase-Aktivitäten15,16,17.
Bei solchen enzymatischen Aktivitätstests werden die radioisotop-markierten oder fluorophor-markierten Nukleinsäuren aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit häufig als Substrate verwendet. Die Analyse von Röntgenaufnahmen enzymatischer Reaktionen mit 32P-markierten Radiotracernwurde als empfindlich und reproduzierbar 18 gefunden. Doch in einer wachsenden Anzahl von Laboratorien in der Welt ist die Verwendung von Radioisotopen aufgrund der gesundheitsrechtlichen Risiken, die mit einer möglichen Exposition verbunden sind, eingeschränkt oder sogar verboten. Neben den Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit sind weitere Nachteile die notwendige Ausrüstung für die Durchführung von Arbeiten mit Radioisotopen, die erforderliche Radioaktivitätslizenz, eine kurze Halbwertszeit von 32P (ca. 14 Tage) und eine allmähliche Verschlechterung der Sondenqualität aufgrund von Radiolyse. So wurden alternative nicht-isotopenfreie Methoden entwickelt (d.h. die Kennzeichnung der Sonde mit Fluorophoren ermöglicht die Detektion mittels fluoreszierender Bildgebung19). Bei der Verwendung fluoreszierender Sonden wird jedoch ein hochauflösendes Bildgebungssystem benötigt. Biotin, ein häufig verwendetes Label, bindet leicht an biologische Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren. Biotin-streptavidin System arbeitet effizient und verbessert die Erkennungsempfindlichkeit ohne Erhöhung des unspezifischen Hintergrunds20,21. Neben EMSA wird Biotin häufig zur Proteinreinigung und RNA-Pull-down eingesetzt, unter anderem22,23,24.
Dieses Protokoll verwendet erfolgreich biotinmarkierte Nukleinsäuren als Substrate für in vitro biochemische Assays, die EMSA enthalten, zusätzlich zu enzymatischen Reaktionen, bei denen Biotin nicht häufig verwendet wurde. Die MEIOB-OB-Domäne ist aufgebaut und zwei Mutanten (Abschneide und Punktmutation) werden als GST-Fusionsproteine25,26,27, sowie Maus MOV10 rekombinantes FLAG-Fusionsprotein16exprimiert. Dieser Bericht hebt die Wirksamkeit dieses kombinierten Protokolls für die Proteinreinigung und biotinmarkierte Assays für verschiedene experimentelle Zwecke hervor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen ist entscheidend für unser Verständnis molekularer Mechanismen, die verschiedenen biologischen Prozessen zugrunde liegen. Zum Beispiel ist MEIOB ein Testis-spezifisches Protein, das für Meiose und Fruchtbarkeit bei Säugetieren25,26,27unerlässlich ist. MEIOB enthält eine OB-Domäne, die an einsträngige DNA bindet und eine 3′ bis 5′ Exonukleaseaktivität<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) für hilfreiche Bearbeitungen und Diskussionen. Wir danken auch Sigrid Eckardt für die Sprachbearbeitung. K. Z. wurde von national Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) und national Natural Science Foundation of China (31771653) unterstützt. L. Y. wurde von der National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) und dem Innovative and Entrepreneurial Program der Provinz Jiangsu unterstützt. J. N. wurde vom Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499) unterstützt. M. L. wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31771588) und des 1000 Youth Talent Plan unterstützt.
Materials
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
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