Здесь представлены протоколы для биохимических анализов in vitro с использованием этикеток биотина, которые могут быть широко применимы для изучения белково-нуклеиновых кислотных взаимодействий.
Белково-нуклеиновые кислоты взаимодействия играют важную роль в биологических процессах, таких как транскрипция, рекомбинация, и метаболизм РНК. Экспериментальные методы изучения белково-нуклееновых кислотных взаимодействий требуют использования флуоресцентных меток, радиоактивных изотопов или других меток для обнаружения и анализа конкретных молекул-мишеней. Биотин, нерадиоактивный ярлык нуклеиновой кислоты, обычно используется в электрофоретической перекосной анализов (EMSA), но не регулярно используется для мониторинга активности белка во время нуклеиновых процессов. Этот протокол иллюстрирует полезность маркировки биотина во время ферментативных реакций in vitro, демонстрируя, что эта этикетка хорошо работает с целым рядом различных биохимических анализов. В частности, в соответствии с предыдущими выводами с использованием радиоизотопа 32P-маркированных субстратов, это подтверждается с помощью биотина помечены EMSA, что MEIOB (белок, специально участвующих в мейотической рекомбинации) является ДНК-связывающей белка, что MOV10 (an Рнк helicase) разрешает биотин-маркированные структуры дуплекса РНК, и что MEIOB расщепляет биотин-маркированную одноцепочечную ДНК. Это исследование показывает, что биотин способен заменить 32P в различных нуклеиновой кислоты связанных биохимических анализов в пробирке.
Белково-ядерные кислоты взаимодействия участвуют во многих важных клеточных процессов, таких как ремонт ДНК, репликация, транскрипция, обработка РНК, и перевод. Белковые взаимодействия с конкретными последовательностями ДНК в хроматине необходимы для жесткогоконтроля экспрессии генов на транскрипционном уровне 1. Точная посттрансконсальная регуляция многочисленных кодирования и некодирования РНК требует обширных и сложных взаимодействий между любым белком и РНК2. Эти слои регулятивного механизма экспрессии генов составляют каскад динамических межмолекулярных событий, которые координируются взаимодействием транскрипционных/эпигенетических факторов или РНК-связывающих белков с их целями нуклеиновой кислоты, а также белково-белковых взаимодействий. Чтобы вскрыть ли белки in vivo прямо или косвенно связаны с нуклеиновыми кислотами и как такие ассоциации происходят и завершаются, в пробирке проводятся биохимические анализы для изучения связывающей сродства или ферментативной активности белков, представляющих интерес, разработанные субстраты ДНК и/или РНК.
Многие методы были разработаны для обнаружения и характеристики нуклеиновых кислотно-белковых комплексов, в том числе электрофоретической перекос асссепования (EMSA), также называют сярприг отсталости геля или перекладину полосы анализ3,4,5 . EMSA является универсальным и чувствительным биохимическим методом, который широко используется для изучения прямого связывания белков с нуклеиновыми кислотами. EMSA опирается на гель электрофоретический сдвиг в диапазонах, которые регулярно визуализированы с помощью хемилюминесценции для обнаружения биотина этикетки6,7, флуоресценция флюорофор этикетки8,9, или авторадиография радиоактивных 32P этикетки10,11. Другие цели биохимических исследований являются выявление и характеристика нуклеиновой кислоты обработки деятельности белков, таких как нуклеаза основе реакций для оценки декольте продуктов из нуклеиновой кислоты субстратов12, 13 Год , 14 и ДНК / РНК структуры раскручивания анализы для оценки деятельности геликей15,16,17.
В таких ферментативных анализов деятельности, радиоизотоп-маркированных или фторофора помечены нуклеиновые кислоты часто используются в качестве субстратов из-за их высокой чувствительности. Анализ радиографов ферментативных реакций с участием 32P помеченных радиотрафов было установлено, чувствительны и воспроизводимых18. Тем не менее, во все большем числе лабораторий в мире использование радиоизотопов ограничено или даже запрещено из-за рисков для здоровья, связанных с потенциальным воздействием. В дополнение к проблемам биобезопасности, другими недостатками являются необходимое оборудование для проведения работы с радиоизотопами, требуемая лицензия на радиоактивность, короткий период полураспада 32P (около 14 дней) и постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза. Таким образом, были разработаны альтернативные неизотопные методы (т.е. маркировка зонда флюорофорами позволяет обнаружить с помощью флуоресцентной визуализации19). Тем не менее, система визуализации с высоким разрешением необходима при использовании флуоресцентно помеченных зондов. Биотин, широко используемый ярлык, легко связывает к биологическим макромолекулам such as протеины и нуклеиновые кислоты. Система Biotin-streptavidin работает эффективно и улучшает чувствительность обнаружения без увеличения неспецифического фона20,21. Помимо EMSA, биотин широко используется для очистки белка и РНК выдвижной, среди прочего22,23,24.
Этот протокол успешно использует биотин-маркированные нуклеиновые кислоты как субстраты для биохимических анализов in vitro которые включают EMSA, в дополнение к enzymatic реакциям в которых биотин обыкновенно не был использован. MEIOB OB домен построен и два мутанта (усечение и точка мутации) выражаются как GST синтез атомиибелков 25,26,27, а также мыши MOV10 рекомбинантный белок слияния FLAG16. В этом докладе подчеркивается эффективность этого комбинированного протокола для очистки белка и биотин-маркированных анализов для различных экспериментальных целей.
Исследование взаимодействия белково-нуклеиновой кислоты имеет решающее значение для нашего понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе различных биологических процессов. Например, MEIOB является яичка конкретных белка, необходимого для мейоза и плодородия у млекопитающих<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим. Джереми Вана (Университет Пенсильвании) за полезные edits и обсуждения. Мы также благодарим Сигрид Экардт за редактирование языка. К. З. была поддержана Национальной программой исследований и разбироков Китая (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) и Национальным фондом естественных наук Китая (31771653). Л. Я. был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (81471502, 31871503) и инновационной и предпринимательской программой провинции Цзянсу. J. N. была поддержана Чжэцзянской медицинской научно-технической проекта (2019KY499). М.Л. был поддержан грантами Национального фонда естественных наук Китая (31771588) и планом 1000 молодежных талантов.
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Reagents | |||
Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |