Summary
Le protocole actuel décrit les méthodes pour établir des modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient et des lignées cellulaires cancéreuses primaires à partir d'échantillons chirurgicaux de cancer gastrique. Les méthodes fournissent un outil utile pour le développement de médicaments et la recherche en biologie du cancer.
Abstract
L'utilisation de modèles précliniques pour faire progresser notre compréhension de la biologie tumorale et d'étudier l'efficacité des agents thérapeutiques est la clé de la recherche sur le cancer. Bien qu'il existe de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses gastriques établies et de nombreux modèles de souris transgéniques conventionnels pour la recherche préclinique, les inconvénients de ces modèles in vitro et in vivo limitent leurs applications. Parce que les caractéristiques de ces modèles ont changé dans la culture, ils ne modélisent plus l'hétérogénéité tumorale, et leurs réponses n'ont pas été en mesure de prédire les réponses chez l'homme. Ainsi, des modèles alternatifs qui représentent mieux l'hétérogénéité tumorale sont en cours de développement. Les modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient préservent l'aspect histologique des cellules cancéreuses, conservent l'hétérogénéité intratumorale, et reflètent mieux les composants humains pertinents du microenvironnement de tumeur. Cependant, il faut habituellement 4-8 mois pour développer un modèle de PDX, qui est plus long que la survie prévue de beaucoup de patients gastriques. Pour cette raison, l'établissement de lignées cellulaires cancéreuses primaires peut être une méthode complémentaire efficace pour les études de réponse médicamenteuse. Le protocole actuel décrit les méthodes d'établissement des modèles De PDX et des lignées cellulaires cancéreuses primaires à partir d'échantillons chirurgicaux de cancer gastrique. Ces méthodes constituent un outil utile pour le développement de médicaments et la recherche en biologie du cancer.
Introduction
Le cancer gastrique est le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde et la troisième cause de décès par cancer. En 2018, plus d'un million de nouveaux cas de cancer gastrique ont été diagnostiqués dans le monde, et on estime que 783 000 personnes ont été tuées par cette maladie1. L'incidence et la mortalité du cancer gastrique restent très élevées dans les pays du nord-est de l'Asie2,3. Malgré des progrès significatifs dans le domaine de la thérapeutique du cancer, le pronostic des patients atteints d'un cancer gastrique avancé demeure faible, avec un taux de survie à cinq ans d'environ 25 %4,5,6, 7,. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le cancer gastrique
Le traitement du cancer gastrique est difficile en raison de sa haute hétérogénéité8,9. Ainsi, la question de savoir comment relever les défis de l'hétérogénéité tumorale pour réaliser la médecine de précision est au cœur de la recherche sur le cancer. Les modèles in vitro et in vivo jouent un rôle crucial dans l'élucidation des mécanismes hétérogènes et de la biologie du cancer gastrique. Cependant, bien qu'il existe de nombreuses lignées de cellules cancéreuses gastriques et de nombreux modèles de souris transgéniques conventionnels pour la recherche préclinique, les inconvénients de ces modèles limitent leurs applications10. Parce que les caractéristiques de ces modèles ont changé dans la culture, ils ne modélisent plus l'hétérogénéité tumorale, et leurs réponses n'ont pas été en mesure de prédire les réponses chez l'homme11. Ces problèmes limitent considérablement la possibilité d'identifier des sous-groupes de patients atteints de cancer qui répondront aux médicaments ciblés. La culture à court terme des tumeurs primaires fournit un moyen relativement rapide et personnalisé d'étudier les propriétés pharmacologiques anticancéreuses, qui seront probablement la marque du traitement personnalisé du cancer.
Les xénogreffes dérivées du patient (PDX) sont préférées comme modèle préclinique alternatif pour le profilage de réponse de drogue12. En outre, les modèles PDX offrent un outil puissant pour étudier l'initiation et la progression du cancer13,14. Les modèles De PDX préservent l'aspect histologique des cellules cancéreuses, conservent l'hétérogénéité intratumorale, et reflètent mieux les composants humains pertinents du microenvironnement de tumeur15,16. Cependant, la limitation des modèles largement utilisés de PDX est le faible taux de succès pour établir et propager en série des tumeurs solides humaines. Dans cette étude, des méthodes décemment réussies pour établir des modèles de PDX et des lignées cellulaires primaires sont décrites.
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Protocol
Cette étude humaine a été approuvée par le Comité d'examen de l'éthique institutionnelle du Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, Chine). L'étude sur les animaux a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Sun Yat-sen. Remarque : toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lois pertinentes et aux lignes directrices institutionnelles, y compris la Ligne directrice pour la protection de l'exposition professionnelle contre les agents pathogènes transmis par le sang.
1. Préparation de l'échantillon
- Obtenir des tissus cancéreux gastriques (P0 et passage 0) directement de l'opération. Le spécimen de tumeur devrait êtreplus grand que 0.5 cm 3.
- Préparer 3-4 ml de solution de stock: par exemple, RPMI-1640 moyen (1x) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U/mL pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine.
- Mettre le spécimen de tumeur fraîche dans le stock-solution à 4 oC pendant pas plus de 4 heures.
2. Établissement du modèle PDX (Figure 1)
- Pour assurer une zone chirurgicale stérile, désinfectez tous les matériaux à l'ultraviolet pendant plus de 30 minutes avant d'être transférés dans le laboratoire animalier.
Note: la salle d'opération doit être désinfectée avec la lumière ultraviolette pendant 30 min, avant que nous nettoyons le bureau avec dichloro isocyanurique acide suppositoria désinfectant. Ensuite, le povidone-iode est utilisé pour désinfecter la peau. - À l'aide de forceps et de ciseaux, disséquez soigneusement les tissus tumoraux et coupez-les en plusieurs petits morceaux (environ 1 mm3 cubes) dans des conditions stériles.
- Anesthésiez les souris femelles NOD-SCID-IL2rg (NSG) femelles de 5 à 7 semaines par l'exposition à 1-1.5% d'isoflurane avec une machine d'anesthésie.
- Anesthésiez la souris jusqu'à ce qu'elle cesse de lutter, mais maintient même la respiration.
REMARQUE : Le tube de 50 ml est un équipement simple qui fonctionne semblable à une machine d'anesthésie. L'utilisation de la pommade vétérinaire d'oeil pour empêcher la sécheresse est inutile due au temps court d'opération.
- Anesthésiez la souris jusqu'à ce qu'elle cesse de lutter, mais maintient même la respiration.
- Faire une incision de 1 cm sur les deux flancs dorsaux à l'aide de ciseaux stériles, et implanter une pièce de tumeur dans chaque flanc de la souris.
- Pour s'assurer que la pièce de tumeur ne glisse pas dehors, employer les forceps stériles pour perturber le tissu sous-cutané. Ensuite, clip un morceau du tissu tumoral, et le placer dans le site profond.
- Fermer la zone de l'implant par suture sous-cutanée avec des aiguilles de suture chirurgicales, et marquer les oreilles de souris avec des étiquettes d'oreille étiquetées
- Stérilisez la plaie avec de l'iode.
- Placez délicatement les souris dans une cage vide après la chirurgie tout en maintenant la charge sternale. Portez une attention particulière à l'état des souris; ils se réveillent et commencent à marcher environ 3-4 minutes plus tard. Placez les souris qui ont subi une intervention chirurgicale dans une autre nouvelle cage séparée de celles qui ne sont pas soumises à la chirurgie.
- Évaluer la taille de la tumeur par palpation du site d'implantation. Mesurer les tumeurs avec un étrier Vernier deux fois par semaine.
- Une fois que la tumeur atteint 10 mm de diamètre, l'état animal s'aggrave, ou les ulcères de tumeur, euthanasient la souris avec une méthode approuvée par iRB. Réimplanter des fragments de tumeur frais récoltés dans 2 nouvelles souris pour le passage, ou stocker temporairement les spécimens dans PBS sur la glace pour l'isolement des lignées cellulaires primaires.
3. Cryoconservation de tissu
REMARQUE : Cette partie fait principalement référence aux méthodes du Kit de tissus vivants Cryo Kit Kit. Les principaux kits et équipements sont répertoriés dans le Tableau des Matériaux.
- Euthanasier les souris avec une méthode approuvée par l'IRB lorsque la tumeur est supérieure à 10 mm de diamètre.
- À l'aide de forceps et de ciseaux stériles, isolez lentement la tumeur des souris.
- Laver les tissus tumoraux avec DPBS dans un plat de 10 cm. Disséquer et enlever les zones nécrotiques, les tissus adipeux, les caillots sanguins et les tissus conjonctifs avec des forceps et des ciseaux.
- Couper les tissus tumoraux à une épaisseur maximale de 1 mm avec un moule.
- Laver les tranches avec dPBS dans un plat de 10 cm.
REMARQUE : Le processus de vitrification implique l'utilisation de tubes étiquetés V1/V2/V3 dans les étapes 3.6-3.8. Les principaux ingrédients sont le DMSO et le saccharose. - Transférer les tranches dans le tube V1 avec des forceps, et couver le tube à 4 oC pendant 4 min. Rouler et inverser le tube brièvement, et le placer à 4 oC pendant 4 min.
- Verser la solution V1 et les tranches dans un plat de 10 cm. Transférer les tranches dans le tube V2 avec des forceps, et incuber le tube V2 à 4 oC pendant 4 min. Rouler et inverser le tube brièvement, et le placer à 4 oC pendant 4 min.
- Verser la solution V2 et les tranches dans un plat de 10 cm. Transférer les tranches dans le tube V3 avec des forceps, et couver le tube à 4 oC pendant 5 min. Rouler et inverser le tube brièvement, et le placer à 4 oC pendant au moins 5 min. Assurez-vous que les tranches coulent toutes au fond du tube.
- Si plusieurs tranches restent flottantes, rouler et inverser brièvement le tube, et placer le tube à 4 oC à nouveau jusqu'à ce que toutes les tranches coulent complètement; si nécessaire, jetez les tranches flottantes.
- Verser la solution V3 et les tranches dans un plat de 10 cm.
- Couper les supports de tissu à la longueur appropriée, et les placer sur la gaze stérile. Transférer les tranches sur les supports. Envelopper les supports avec la gaze et les placer dans de l'azote liquide à l'aide de forceps, puis d'incubation pendant 5 min.
- Étiqueter les flacons cryogéniques avec les informations tissulaires.
- Transférer les supports avec des tranches de tissu en flacons cryogéniques, qui sont stockés dans de l'azote liquide.
4. Isolement des cellules primaires (Figure 2)
- Stériliser les forceps et les ciseaux à haute pression à la vapeur à 121 oC pendant 30 min.
- Reséquez des échantillons de cancer gastrique à partir de spécimens réséqués ou de tissus PDX récoltés. Placer les tissus sur la glace, puis, transférer les tissus dans un plat de culture stérile de 10 cm.
- Disséquer et enlever les zones nécrotiques, les tissus adipeux, les caillots sanguins et les tissus conjonctifs avec des forceps et des ciseaux.
- Laver les tissus tumoraux une fois avec DPBS contenant 100 U/mL de pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine dans un plat de 10 cm.
- Couper le tissu tumoral en morceaux de 1 mm3 sur le couvercle du plat; l'épaisseur maximale de chaque pièce doit être de 1 mm.
- Transférer les tissus dans un tube centrifugeuse de 50 ml avec environ 7 ml de collagène de type 1 et la solution de trypsine (1:14). Vortex le mélange brièvement.
- Incuber le tube dans un bain d'eau à 37 oC pendant 30-40 min. Vortex le mélange toutes les 5 min.
- Ajouter un volume égal de RPMI-1640 moyen (1x) complété par 10% FBS au tube. Vortex le mélange à fond.
- Transférer le mélange dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 ml par filtration lente à travers un filtre de 40 m.
REMARQUE : Utilisez des filtres de 40 m pour assurer un ratio plus élevé de cellules cancéreuses. Si nécessaire, des filtres de 100 m peuvent être utilisés pour préserver plus de types de cellules, telles que les cellules immunologiques. - Centrifugeles les filtrates à 113-163 x g pendant 5-7 min à RT. Soigneusement enlever le supernatant.
- Laver la pastille avec 5 ml de PBS, et retirer soigneusement le supernatant.
- Si la pastille est rouge, elle contient de nombreux érythrocytes. Resuspendre doucement la pastille avec 500 ll de tampon de lyse des globules rouges. Après une incubation de 5 min, ajouter 5 ml de PBS et retirer soigneusement le supernatant.
- Resuspendre la pastille avec le milieu de culture, et transférer le mélange dans un plat stérile de 10 cm.
- Remplacer le milieu par un milieu contenant du sérum tous les 2-3 jours.
- Passer les cellules primaires à l'aide de trypsine/ EDTA lorsqu'elles atteignent 50 % de confluence.
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Representative Results
Ici, les tissus tumoraux d'une opération ont été préservés dans la solution de stock jusqu'à l'étape suivante. Dans les 4 heures, les tissus tumoraux ont été coupés en petits morceaux et implantés dans les flancs dorsaux des souris DeNSQui avaient été anesthésiés à l'aide de coton imbibé d'isoflurane. Les tumeurs de plus de 1 cm3 pourraient être réséquées pour l'implantation chez de nouvelles souris (figure1) ou tranchées soigneusement et conservées dans de l'azote liquide suivant le protocole. Dans cette étude, les tumeurs de première génération se sont développées plus lentement que celles dans les générations postérieures, prenant 3 semaines ou plus pour atteindre la taille appropriée. Le taux de succès de la formation sous-cutanée de tumeur de première génération était supérieur à 80%. Nous avons confirmé l'identité des cellules cancéreuses des modèles PDX par la coloration de H et E sous un microscope (Figure 3C). Enfin, le taux de succès de la formation de tumeur du tissu de tumeur cryoconservé était approximativement 95%.
Les cellules cancéreuses primaires ont été isolées comme une autre manière d'étudier la tumeur individuelle. Les cellules ont été isolées des spécimens opératoires ou des modèles de PDX. Les tissus de tumeur ont été lavés avec DPBS et coupés en morceaux. Les fragments de tissu ont été digérés complètement avec le type 1 de collagène et de trypsine (1:14) avant filtration. Après avoir enlevé les érythrocytes, les cellules ont été cultivées de la même manière que les autres cellules cancéreuses. Les cellules mésenchymales survivantes meurent dans des passages ultérieurs (figure 2). Basé sur des différences dans la morphologie, nous pouvons facilement reconnaître des cellules de tumeur. Les cellules normales ont une forme et une taille uniformes, mais les cellules cancéreuses sont de différentes tailles et formes. En outre, dans les cellules cancéreuses, le noyau a des structures irrégulières et un cytoplasme relativement petit. Par conséquent, les cellules primaires ont été authentifiées indépendamment par deux pathologistes sous un microscope (Figure 3A). Pour plus de confirmation, la coloration de H et E a été employée pour observer la morphologie de cellules cancéreuses après fixation (figure 3B). Le taux d'isolement réussi des lignées cellulaires primaires était d'environ 40 %. Les cellules primaires doivent être passages 4 ou 5 fois après l'isolement, et l'authentification pathologique est nécessaire. Ces étapes peuvent prendre environ 20 jours.
Figure 1. Schéma pour l'établissement de modèles de xénogreffe dérivés du patient (PDX).
Pour établir avec succès des modèles de PDX, reséquez les masses de tumeur dans la salle d'opération pour le traitement immédiat. Diviser la tumeur en plusieurs petits morceaux. Mettre des boules de coton imbibées d'isoflurane dans un tube de 50 ml pour anesthésier les souris et couper les plaies sur les flancs dorsaux. Les tissus sous-cutanés émoussés avec des forceps, et emploient des forceps pour placer un morceau de la tumeur sous-cutané loin de la blessure. Suturer et stériliser les plaies. Le processus d'anesthésie nécessite une surveillance attentive des signes vitaux de la souris, tels que le taux de respiration. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Schéma pour l'isolement des cellules primaires.
Obtenir des échantillons tumoraux de la salle d'opération. Lavez rapidement les tissus tumoraux et coupez-les en morceaux. Dig les spécimens de tumeur avec la collagène de type 1 et la trypsine à 37 oC pendant 30-40 min, en mélangeant le tube toutes les 5 minutes. Ensuite, ajouter un volume égal de milieu avec 10% FBS, centrifuger le mélange, et placer le filtrate dans un nouveau tube. Retirez le supernatant et lavez la boulette. En fonction de la couleur de la pastille, décider s'il faut lyse les globules rouges. Transférer la pastille dans un nouveau plat stérile de 10 cm, et la culture des cellules pour plusieurs passages avant le dépistage des cellules cancéreuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Authentification des cellules cancéreuses primaires.
(A) Images cellulaires primaires de patients atteints de GC. Les cellules ont été isolées directement des tissus frais et ont été passages plus de 5 fois. Barres d'échelle : 200 m (à gauche), 100 m (au milieu) et 50 m (à droite). (B) Photos de cellules cancéreuses gastriques primaires tachées d'H et E. Barres d'échelle : 500 m (à gauche), 200 m (au milieu) et 100 m (à droite). (C) Photos de tumeurs PDX tachées de H et E. Barres d'échelle : 500 m (à gauche), 200 m (au milieu) et 100 m (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le cancer gastrique est une maladie agressive avec des options thérapeutiques limitées; ainsi, les modèles de cancer gastrique sont devenus une ressource essentielle pour permettre des études de recherche fonctionnelle avec la traduction directe à la clinique4,8,17. Ici, nous avons décrit les méthodes et le protocole d'établir des modèles gastriques de PDX de cancer et des lignées primaires de cellules. Fait important, les caractéristiques morphologiques et biologiques des échantillons de cancer gastrique ont été principalement conservées dans les modèles PDX.
Il y a quelques points critiques dans le protocole pour établir des modèles de PDX qui doivent être soulignés pour augmenter le taux d'engraftment. Les souris NSG (NOD-SCID-IL2rg) sont recommandées comme modèle de souris immunodéficiente parce que ces souris sont plus sévèrement immunosupprimées et sont déficientes en lymphocytes T, B et NK18,19,20,21. En outre, en raison de l'immunodéficience grave des souris, la stérilité doit être maintenue dans toutes les expériences. Tous les outils, y compris les forceps et les ciseaux, doivent être gardés stériles. Les souris NSG doivent être élevées à faible densité pour éviter l'infection. En outre, de nombreux facteurs pourraient également affecter la formation tumorale, comme la taille de l'échantillon, la proportion de cellules mésenchymales dans le spécimen, et le site d'implantation.
Un aspect clé dans l'établissement des cellules cancéreuses primaires est la stérilité. En outre, parce que les cellules mésenchymales se développent habituellement plus rapidement que les cellules cancéreuses primaires, les cellules peuvent devoir être passages pendant plusieurs générations jusqu'à ce que les cellules mésenchymales meurent. Enfin, les cellules cultivées doivent être authentifiées.
Nous avons utilisé la méthode de cryoconservation vitrifiée pour préserver les échantillons de tumeur de PDX. Les principaux mérites de cette méthode de conservation sont les suivants : 1) l'entreposage à long terme après congélation est possible (environ 10 ans); 2) la morphologie après le dégel est compatible avec celle du tissu frais ; 3) les cellules tumorales primaires peuvent encore être isolées après la décongélation ; 4) la capacité de tumeur-formation des PDXs reste fondamentalement inchangée avant et après cryoconservation ; 5) les tissus peuvent être employés pour faire des sections congelées et peuvent être fixés avec la paraffine ; 6) l'activité d'ADN, d'ARN et de protéine est préservée ; et 7) cette méthode s'applique aux spécimens chirurgicaux et aux tissus de biopsie.
La limitation majeure des modèles de PDX implique l'utilisation des souris immunocompromised, qui peuvent atténuer l'impact du microenvironnement de tumeur sur la croissance de tumeur et les réponses de drogue et limitent ainsi l'application des modèles de PDX dans des agents immunomodulatoires de criblage. En outre, il faut généralement 4-8 mois pour développer un modèle PDX, qui est plus long que la survie prévue de nombreux patients gastriques. Pour cette raison, l'établissement de lignées cellulaires cancéreuses primaires peut être une méthode complémentaire efficace pour les études de réponse médicamenteuse.
Les modèles PDX et les lignées cellulaires primaires font désormais partie intégrante du développement de médicaments et de l'initiation et de la progression de la recherche en biologie tumorale. Ces modèles offrent des représentations plus précises du cancer humain que les lignées traditionnelles de cellules cancéreuses et ont le potentiel d'améliorer l'évaluation préclinique de nouvelles thérapies anticancéreuses. En outre, ces modèles peuvent être utiles en comparant des caractéristiques moléculaires ou des signatures de tumeur entre différents sous-groupes de patients cancéreux. Il ne fait aucun doute que ces outils finiront par jouer un rôle plus large dans le développement de médicaments et la recherche en biologie du cancer.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81572392); le National Key Research and Development Program of China (2016YFC1201704); Conseils scientifiques et techniques des jeunes talents innovateurs du Programme de soutien spécial du Guangdong (2016TQ03R614).
Nous remercions particulièrement Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. pour son aide dans la préparation des chiffres.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Biologix, Shandong, China | 15-1040 | |
| Biological Microscope | OLYMPUS, Tokyo, Japan | OLYMPUS CKX41 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Mittelsachsen, Germany. | 5427R | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | HERACELL 150i | |
| DPBS | Basalmedia Technology, Shanghai, China | L40601 | |
| Electro-Thermostatic Water Cabinet | Yiheng, Shanghai, China | DK-8AXX | |
| Fetal bovine serum | Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada | 86150040 | |
| Isoflurane | Baxter, China | CN2L9100 | |
| Live Tissue Kit Cryo Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2601 | |
| Live Tissue Thaw Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2602 | |
| NSG | Biocytogen, Beijing, China | B-CM-002-4-5W | |
| Penicilin&streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 15140122 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, Beijing, China | R1010 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 8118367 | |
| Surgical Suture Needles with Thread | LingQiao, Ningbo, China | 3/8 arc 4×10 | |
| Tissue-processed molds and auxiliary blades | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2603 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 2003779 | |
| Type 1 collagenase | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 17100017 |
References
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