Summary
현재 프로토콜은 외과 위암 견본에서 환자 파생된 이종이식 (PDX) 모형 및 1 차적인 암 세포주를 설치하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 약물 개발 및 암 생물학 연구에 유용한 도구를 제공합니다.
Abstract
종양 생물학에 대한 이해를 증진하고 치료제의 효능을 조사하기 위해 전임상 모델을 사용하는 것이 암 연구의 핵심입니다. 전임상 연구를 위한 많은 확립된 위암 세포주 및 많은 전통적인 형질전환 마우스 모델이 있지만, 이러한 생체외 및 생체내 모델의 단점은 그들의 적용을 제한합니다. 이 모형의 특성이 문화에서 변경되었기 때문에, 그(것)들은 더 이상 종양 이질성을 모델링하지 않으며, 그들의 반응은 인간에 있는 반응을 예측할 수 없었습니다. 따라서, 종양 이질성을 더 잘 나타내는 대체 모델이 개발되고 있다. 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 암세포의 조직학적 외관을 보존하고 종양 내 이질성을 유지하며 종양 미세 환경의 관련 인간 성분을 더 잘 반영합니다. 그러나, 그것은 일반적으로 많은 위 환자의 예상된 생존 보다는 더 긴 PDX 모형을 개발하기 위하여 4-8 달이 걸립니다. 이러한 이유로, 1차 암 세포주를 확립하는 것은 약물 반응 연구를 위한 효과적인 상보적인 방법일 수 있다. 현재 프로토콜은 수술 위암 샘플에서 PDX 모델과 1 차적인 암 세포주를 설치하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법은 약물 개발 및 암 생물학 연구에 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
위암은 전 세계적으로 다섯 번째로 흔한 암이며 암 사망의 세 번째 주요 원인입니다. 2018년에는 1,000,000건 이상의 새로운 위암 사례가 전 세계적으로 진단되었으며, 약 783,000명이 이 질병으로 사망했습니다1. 위암의 발생률과 사망률은 동북아시아국가에서 매우 높게 남아 2,3. 암 치료 분야에서 상당한 진전에도 불구하고, 진행성 위암 환자의 예후는 약 25 % 4,5,6의 5 년 생존율로 가난한 상태로 남아 있습니다. 7,. 따라서, 위암에 대한 새로운 치료 전략의 개발이 절실히 요구되고 있다.
위암의 치료는 높은 이질성 때문에 도전이다8,9. 따라서 정밀 의학을 실현하기 위해 종양 이질성의 과제를 해결하는 방법에 대한 질문은 암 연구의 핵심입니다. 생체 외 및 생체 내 모델은 위암의 이기종 메커니즘과 생물학을 해명하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나, 전임상 연구를 위한 수많은 위암 세포주 및 많은 종래의 형질전환 마우스 모델이 있지만, 이들 모델의 단점은 그들의 적용을 제한한다10. 이러한 모델의 특성이 배양에서 변화했기 때문에, 그들은 더 이상 종양 이질성을 모델링하지 않으며, 그들의 반응은 인간11에서반응을 예측할 수 없었다. 이 문제점은 표적으로 한 약에 반응할 암 환자의 소집단을 확인하는 가능성을 가혹하게 제한합니다. 1 차적인 종양의 단기 문화는 아마 개인화한 암 처리의 특징일 것이다 항암 약리학적인 속성을 조사하는 상대적으로 급속하고 개인화한 쪽을 제공합니다.
환자 유래 이종이식(PDX)은 약물 반응 프로파일링(12)에 대한대체 전임상 모델로서 바람직하다. 또한, PDX 모델은 암의 개시 및 진행을 연구하기위한 강력한 도구를 제공합니다13,14. PDX 모델은 암세포의 조직학적 외관을 보존하고, 종양 내 이질성을 유지하고, 종양 미세환경(15,16)의관련 인간 성분을 더 잘 반영한다. 그러나, 널리 사용되는 PDX 모델의 한계는 인간 고형 종양을 확립하고 연속적으로 전파하기 위한 낮은 성공률이다. 이 연구에서는 PDX 모델 및 1 차 세포주를 확립하기위한 상당히 성공적인 방법이 설명되어 있습니다.
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Protocol
이 인간 적인 연구 결과는 Sun Yat-sen 대학 암 센터의 기관 윤리 검토 위원회에 의해 승인되었습니다 (SYSUCC, 광저우, 중국). 동물 연구는 선야센 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 참고: 모든 실험은 혈액 매개 병원균에 대한 직업 노출 보호를 위한 지침을 포함하여 관련 법률 및 기관 지침을 준수하여 수행되었습니다.
1. 견본 준비
- 수술에서 직접 위암 조직 (P0 = 통로 0)을 얻습니다. 종양 견본은 0.5 cm3보다 더 커야 합니다.
- 재고 용액의 3-4 mL을 준비하십시오 : 예를 들어, RPMI-1640 배지 (1x)는 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / mL 페니실린 및 0.1 mg / mL 연쇄상 구균으로 보충되었습니다.
- 신선한 종양 시편을 4°C에서 4°C에서 4시간 이상 스톡 용액에 넣는다.
2. PDX 모델의 설립 (그림 1)
- 멸균 수술 부위를 보장하기 위해 동물 실험실로 옮기기 전에 자외선으로 모든 물질을 30 분 이상 소독하십시오.
참고 : 수술실은 디클로로 이소야우리산 나트륨 소독제로 책상을 청소하기 전에 30 분 동안 자외선으로 소독해야합니다. 그런 다음 포비도 요오드가 피부를 소독하는 데 사용됩니다. - 집게와 가위를 사용하여 종양 조직을 조심스럽게 해부하고 멸균 조건하에서 여러 개의 작은 조각 (약 1mm3 큐브)으로 다듬습니다.
- 마취 기계로 1-1.5% 이소플루란에 노출시킴으로써 암컷 5-7주령 NOD-SCID-IL2rg(NSG) 마우스를 마취시킵니다.
- 마우스가 고군분투하는 것을 멈출 때까지 마우스를 마취하지만 호흡도 유지합니다.
참고 : 50 mL 튜브는 마취 기계와 유사한 기능을하는 간단한 장비입니다. 수의안구연은 수술 시간이 짧기 때문에 건조를 예방할 필요가 없습니다.
- 마우스가 고군분투하는 것을 멈출 때까지 마우스를 마취하지만 호흡도 유지합니다.
- 멸균 가위를 사용하여 양쪽 등측측면에 1cm 절개를 하고, 마우스의 각 측면에 종양 조각 하나를 삽입합니다.
- 종양 조각이 미끄러지지 않도록 멸균 집게를 사용하여 피하 조직을 방해하십시오. 그런 다음 종양 조직의 조각을 잘라 내고 깊은 부위에 넣습니다.
- 수술 봉합바늘로 피하 봉합사로 임플란트 부위를 닫고 마우스 귀를 귀 태그로 표시합니다.
- 요오드로 상처를 살균하십시오.
- 수술 후 마우스를 빈 케이지에 부드럽게 놓고 흉골의 탄력성을 유지합니다. 마우스의 상태에주의를 기울이십시오; 그들은 일어나서 약 3-4 분 후에 걷기 시작합니다. 수술을 받지 않은 쥐와 분리된 다른 새장에서 수술을 받은 마우스를 놓습니다.
- 이식 부위의 촉진에 의해 종양 크기를 평가합니다. 일주일에 두 번 버니어 캘리퍼로 종양을 측정하십시오.
- 종양이 직경이 10mm에 도달하면 동물 상태가 악화되면 종양 궤양이 악화되며 IRB 승인 방법으로 마우스를 안락사시합니다. 신선한 종양 단편을 2개의 새로운 마우스로 재이식하여 통과시키거나, 1차 세포주 분리를 위해 PBS에 시편을 일시적으로 얼음에 저장한다.
3. 조직 냉동 보존
참고 : 이 부분은 주로 라이브 티슈 키트 냉동 키트의 방법을 참조합니다. 주요 키트 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
- 종양이 직경이 10 mm 이상일 때 IRB 승인 방법으로 마우스를 안락사시.
- 멸균 집게와 가위를 사용하여 마우스에서 종양을 천천히 분리하십시오.
- 10cm 접시에 DPBS로 종양 조직을 씻으하십시오. 집게와 가위로 괴사 부위, 지방 조직, 혈전 및 결합 조직을 해부하고 제거하십시오.
- 종양 조직을 금형으로 최대 1mm 두께로 자른다.
- 10cm 접시에 DPBS로 슬라이스를 씻는다.
참고: 유리화 공정에는 3.6-3.8 단계에서 V1/V2/V3로 표시된 튜브를 사용하는 작업이 포함됩니다. 주요 성분은 DMSO와 자당입니다. - 포셉으로 튜브 V1로 슬라이스를 옮기고, 튜브를 4°C에서 4분 동안 인큐베이션하고 튜브를 짧게 반전시키고, 4°C에서 4°C로 또 다른 4분 동안 배양한다.
- V1 용액을 붓고 10cm 접시에 슬라이스합니다. 포셉으로 튜브 V2로 슬라이스를 옮기고, 4°C에서 V2를 4분 동안 롤및 반역하고, 4°C에서 4°C로 또 다른 4분 동안 배양한다.
- V2 용액을 붓고 10cm 접시에 슬라이스합니다. 포셉으로 튜브 V3로 슬라이스를 전송하고, 5 분 동안 4 °C에서 튜브를 인큐베이션. 롤과 튜브를 반역, 적어도 5 분 동안 4 °C에 배치.
- 여러 조각이 부동 상태로 남아 있으면 튜브를 짧게 굴리고 반전시키고 모든 조각이 완전히 가라 앉을 때까지 튜브를 다시 4 °C에 놓습니다. 필요한 경우 부동 슬라이스를 폐기하십시오.
- V3 용액을 붓고 10cm 접시에 슬라이스합니다.
- 티슈 홀더를 적절한 길이로 자르고 멸균 거즈에 놓습니다. 슬라이스를 홀더로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김에 대고 있습니다. 거즈로 홀더를 감싸고 집게를 사용하여 액체 질소에 넣은 다음 5 분 동안 배양합니다.
- 극저온 바이알에 조직 정보를 표시합니다.
- 액체 질소에 저장되는 극저온 바이알에 조직 조각으로 홀더를 옮김.
4. 1 차세포의 격리 (그림 2)
- 121 °C에서 고압 증기로 집게와 가위를 30 분 동안 살균하십시오.
- 절제된 표본 또는 수확된 PDX 조직에서 위암 샘플을 절제합니다. 얼음에 조직을 놓고, 다음, 10cm 멸균 문화 접시에 조직을 전송합니다.
- 집게와 가위로 괴사 부위, 지방 조직, 혈전 및 결합 조직을 해부하고 제거하십시오.
- 100 U/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스트렙토마이신을 함유한 DPBS로 종양 조직을 10cm 접시에 한 번 씻으시다.
- 접시뚜껑에 1mm3 조각으로 종양 조직을 잘라; 각 조각의 최대 두께는 1mm여야 합니다.
- 조직을 50 mL 원심분리기 튜브로 옮기고 약 7 mL의 콜라게나아제와 트립신(1:14) 용액을 사용한다. 혼합물을 간략하게 소용돌이.
- 37°C에서 수조에 튜브를 30-40분 동안 배양한다.
- 튜브에 10% FBS로 보충된 RPMI-1640 배지(1x)의 동일한 부피를 추가합니다. 혼합물을 철저히 소용돌이.
- 40 μm 필터를 통해 느린 여과에 의해 새로운 50 mL 원심 분리튜브로 혼합물을 옮니다.
참고: 40 μm 필터를 사용하여 암세포의 높은 비율을 보장하십시오. 필요한 경우, 100 μm 필터는 면역학 세포와 같은 더 많은 유형의 세포를 보존하는 데 사용될 수 있습니다. - RT에서 5-7 분 동안 113-163 x g의 여과액을 원심 분리하십시오.
- 5 mL의 PBS로 펠릿을 씻고 조심스럽게 상류제를 제거하십시오.
- 펠릿이 빨간색이면 많은 적혈구가 포함되어 있습니다. 적혈구 리시스 완충액 500 μL로 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다. 5 분 배양 후, PBS 5 mL을 추가하고 조심스럽게 상류를 제거하십시오.
- 배양 배지로 펠렛을 다시 중단하고 혼합물을 멸균 된 10cm 접시로 옮니다.
- 배지를 2-3일마다 혈청 함유 배지로 교체하십시오.
- 그들은 에 도달 할 때 트립신 / EDTA를 사용하여 기본 세포를 통과 50% 합류.
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Representative Results
여기서, 수술로부터종양 조직은 다음 단계까지 스톡 용액에 보존되었다. 4 시간 안에, 종양 조직은 작은 조각으로 절단하고 이소플루란 에 젖은 면화로 마취된 NSG 마우스의 등쪽 측방으로 이식되었습니다. 1 cm 3보다 큰 종양은 새로운 마우스에 이식하기 위해 절제될 수 있었다 (그림1)또는 신중하게 슬라이스하고 프로토콜에 따라 액체 질소에 보존. 이 연구에서는, 1 세대 종양은 적당한 크기에 도달하기 위하여 3 주 이상 걸리는 나중 세대에 그들 보다는 더 느리게 증가했습니다. 1 세대 피하 종양 형성의 성공률은 80 % 이상이었습니다. 우리는 현미경으로 H&E 염색에 의해 PDX 모델에서 암세포의 신원을확인하였다(그림 3C). 마지막으로, 저온 보존 종양 조직으로부터의 종양 형성의 성공률은 약 95%였다.
원발성 암세포는 개별 종양을 조사하는 또 다른 방법으로 단리되었다. 세포는 수술시편 또는 PDX 모델으로부터 분리되었다. 종양 조직을 DPBS로 세척하고 조각으로 잘라냈습니다. 조직 단편을 여과 전에 타입-1 콜라게나아제 및 트립신(1:14)으로 철저히 소화하였다. 적혈구를 제거 한 후, 세포는 다른 암세포와 동일한 방식으로 배양하였다. 살아남은 중간 엽 세포는 후속 대로 죽습니다(그림2). 형태학의 차이에 따라 종양 세포를 쉽게 인식 할 수 있습니다. 일반적인 세포는 균일한 모양 및 크기를 가지고 있습니다, 그러나 암세포는 각종 크기 및 모양에서 옵니다. 추가적으로, 암세포에서, 핵에는 불규칙한 구조물 및 상대적으로 작은 세포질이 있습니다. 따라서, 1차 세포는 현미경하에 2명의 병리학자에 의해 독립적으로인증되었다(도 3A). 추가 확인을 위해, H&E 염색은 고정 후 암세포형태를 관찰하기 위해 사용되었다(그림 3B). 1 차 적인 세포주 전의 성공적인 격리의 비율은 대략 40%이었습니다. 1 차 세포는 격리 후에 4 5 회 통과되어야 하고, 병리학적인 인증이 필요합니다. 이러한 단계는 약 20일이 걸릴 수 있습니다.
그림 1. 환자 유래 이종이식(PDX) 모델의 확립을 위한 스키마.
PDX 모델을 성공적으로 확립하려면 수술실에서 종양 덩어리를 절제하여 즉각적인 처리를 하십시오. 종양을 여러 개의 작은 조각으로 나눕니다. 이소플루란에 담근 면봉을 50 mL 튜브에 넣어 마우스를 마취시키고 등지 측면에 상처를 자릅니다. 무딘 집게로 피하 조직을 해부하고 집게를 사용하여 종양의 한 조각을 상처에서 피하적으로 놓습니다. 봉합사 및 상처를 살균. 마취 과정은 호흡 속도와 같은 마우스 활력 징후의 주의 깊은 모니터링을 필요로한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 기본 셀의 격리를 위한 스키마입니다.
수술실에서 종양 표본을 가져옵니다. 종양 조직을 빨리 씻고 조각으로 자릅니다. 종양 시편을 37°C에서 1형 콜라게나아제및 트립신으로 30-40분 동안 소화하고, 튜브를 5분마다 혼합한다. 그런 다음 10 % FBS로 동일한 부피를 추가하고 혼합물을 원심 분리하고 여과액을 새 튜브에 넣습니다. 상급제를 제거하고 펠릿을 씻습니다. 펠릿의 색상에 따라 적혈구를 채색할지 여부를 결정합니다. 펠릿을 새로운 10 cm 멸균 접시로 옮기고, 암세포 스크리닝 전에 여러 구절에 대해 세포를 배양한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 1 차적인 암세포의 인증.
(A) GC 환자로부터의 1차 세포 이미지. 세포를 신선한 조직으로부터 직접 분리하고 5회 이상 계통과시켰습니다. 축척 막대: 200 μm(왼쪽), 100 μm(가운데) 및 50 μm(오른쪽). (B) H&E 염색원발 위암세포의 사진. 축척 막대: 500 μm(왼쪽), 200 μm(가운데) 및 100 μm(오른쪽). (C) H&E 염색된 PDX 종양의 사진. 축척 막대: 500 μm(왼쪽), 200 μm(가운데) 및 100 μm(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위암은 제한된 치료 옵션을 가진 공격적인 질병입니다. 따라서, 위암의 모델은 클리닉 4,8,17에직접 번역하여 기능적 연구 연구를 가능하게하는 중요한 자원이되었다. 여기에서, 우리는 위암 PDX 모형 및 1 차적인 세포주를 설치하는 방법 그리고 프로토콜을 기술했습니다. 중요한 것은, 위암 견본의 형태학적 및 생물학적 특성 둘 다 PDX 모형에서 주로 유지되었다.
생착 속도를 높이기 위해 강조해야 하는 PDX 모델을 설정하기 위한 프로토콜에는 몇 가지 중요한 사항이 있습니다. NSG(NOD-SCID-IL2rg) 마우스는 면역결핍 마우스 모델로서 권장되는데, 이는 이들 마우스가 면역억제가 더 심각하고 T, B 및 NK 세포가 결핍되어 있기 때문에18,19,20,21이다. 추가적으로, 마우스의 가혹한 면역 결핍 때문에, 불임은 모든 실험에서 유지되어야 합니다. 집게와 가위를 포함한 모든 도구는 멸균 상태로 유지되어야 합니다. NSG 마우스는 감염을 피하기 위하여 낮은 조밀도에서 사육되어야 합니다. 추가적으로, 많은 요인은 또한 견본 크기, 견본에 있는 중간엽 세포의 비율 및 이식 부위와 같은 종양 대형에 영향을 미칠 수 있습니다.
1 차적인 암세포의 설치에 있는 1개의 중요한 양상은 불임입니다. 게다가, 중간엽 세포는 일반적으로 1 차적인 암세포 보다는 더 빨리 증가하기 때문에, 세포는 중간엽 세포가 죽을 때까지 몇몇 세대를 위해 통과될 필요가 있을 수 있습니다. 마지막으로, 배양된 세포는 인증될 필요가 있습니다.
우리는 PDX 종양 견본을 보존하기 위하여 유리화한 동결 보존 방법을 이용했습니다. 이 보존 방법의 주요 장점은 다음과 같습니다 : 1) 동결 후 장기 보관이 가능 (약 10 년); 2) 해동 후의 형태는 신선한 조직의 형태와 일치합니다. 3) 원발성 종양 세포는 해동 후에도 여전히 단리될 수 있다; 4) PDX의 종양 형성 능력은 동결 보존 전후에 기본적으로 변하지 않습니다. 5) 조직은 냉동 섹션을 만들기 위해 사용될 수 있으며 파라핀으로 고정 될 수있다; 6) DNA, RNA 및 단백질 활성이 보존되고; 및 7) 이 방법은 외과 적 표본 및 생검 조직 모두에 적용 가능하다.
PDX 모형의 중요한 제한은 종양 성장 및 약 반응에 종양 미세 환경의 충격을 감쇠하고 이렇게 면역 조절 에이전트를 검열에 있는 PDX 모형의 적용을 제한할 수 있는 면역 손상된 마우스의 사용을 관련시킵니다. 추가적으로, 많은 위 환자의 예상된 생존 보다는 더 긴 PDX 모형을 개발하기 위하여 전형적으로 4-8 달이 걸립니다. 이러한 이유로, 1차 암 세포주를 확립하는 것은 약물 반응 연구를 위한 효과적인 상보적인 방법일 수 있다.
PDX 모델과 1차 세포주들은 종양 생물학 연구의 약물 개발 및 개시 및 진행의 필수적인 부분이 되고 있습니다. 이 모형은 전통적인 암 세포주 보다는 인간적인 암의 더 정확한 표현을 제안하고 새로운 항암 치료의 전임상 평가를 향상하는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, 이들 모델은 암 환자의 상이한 하위군 들 사이의 분자 특성 또는 종양 시그니처를 비교하는데 유용할 수 있다. 의심의 여지가 이러한 도구는 결국 약물 개발 및 암 생물학 연구에 더 넓은 역할을 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (81572392); 중국 의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2016YFC1201704); 광동 특별 지원 프로그램 (2016TQ03R614)의 팁 탑 과학 기술 혁신 청소년 재능.
우리는 특히 수치의 준비에 도움을 광저우 새진 생명 공학 (주)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Biologix, Shandong, China | 15-1040 | |
| Biological Microscope | OLYMPUS, Tokyo, Japan | OLYMPUS CKX41 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Mittelsachsen, Germany. | 5427R | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | HERACELL 150i | |
| DPBS | Basalmedia Technology, Shanghai, China | L40601 | |
| Electro-Thermostatic Water Cabinet | Yiheng, Shanghai, China | DK-8AXX | |
| Fetal bovine serum | Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada | 86150040 | |
| Isoflurane | Baxter, China | CN2L9100 | |
| Live Tissue Kit Cryo Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2601 | |
| Live Tissue Thaw Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2602 | |
| NSG | Biocytogen, Beijing, China | B-CM-002-4-5W | |
| Penicilin&streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 15140122 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, Beijing, China | R1010 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 8118367 | |
| Surgical Suture Needles with Thread | LingQiao, Ningbo, China | 3/8 arc 4×10 | |
| Tissue-processed molds and auxiliary blades | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2603 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 2003779 | |
| Type 1 collagenase | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 17100017 |
References
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