Summary
現在のプロトコルは、外科的胃癌サンプルから患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび原発癌細胞株を確立する方法を説明する。この方法は、創薬やがん生物学の研究に役立つツールです。
Abstract
腫瘍生物学の理解を深め、治療薬の有効性を調べる前臨床モデルの使用は、がん研究の鍵です。前臨床研究のための多くの確立された胃癌細胞株および多くの従来のトランスジェニックマウスモデルがあるが、インビトロおよびインビボモデルの欠点は、その適用を制限する。これらのモデルの特性は培養において変化したため、腫瘍の不均一性をモデル化することはなくなり、その応答はヒトの応答を予測することができませんでした。したがって、腫瘍の不均一性をよりよく表す代替モデルが開発されている。患者由来異種移植片(PDX)モデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境の関連するヒト成分をよりよく反映する。しかし、通常、多くの胃患者の予想生存期間よりも長いPDXモデルの開発には4~8ヶ月かかります。このため、原発性癌細胞株の確立は、薬物応答研究のための効果的な補完的な方法である可能性がある。現在のプロトコルは、外科的胃癌サンプルからPDXモデルおよび原発癌細胞株を確立する方法を説明する。これらの方法は、創薬やがん生物学の研究に有用なツールを提供します。
Introduction
胃癌は、世界で5番目に一般的な癌であり、癌死の第3の主要な原因である。2018年には、世界的に100万人以上の新しい胃癌症例が診断され、推定783,000人がこの疾患1によって死亡した。胃癌の発生率と死亡率は、北東アジア諸国2、3で非常に高いままです。がん治療の分野で大きな進歩を遂げたにもかかわらず、進行性胃癌患者の予後は依然として乏しく、5年生存率は約25%4,5,6, 7,.したがって、胃癌に対する新たな治療戦略の開発が急務である。
胃癌の治療は、その高い不均一性8、9のために困難です。このように、精密医療を実現するために腫瘍の不均一性の課題にどう取り組むかという問題は、がん研究の中心です。インビトロおよびインビボモデルは、胃癌の異種メカニズムおよび生物学を解明する上で重要な役割を果たす。しかし、前臨床研究のための多数の胃癌細胞株および多くの従来のトランスジェニックマウスモデルがあるが、これらのモデルの欠点は、その用途を制限する10.これらのモデルの特性は培養において変化したため、腫瘍の不均一性をモデル化することはなくなり、その応答はヒト11における応答を予測できなかった。これらの問題は、標的薬に反応するがん患者のサブグループを特定する可能性を著しく制限する。原発性腫瘍の短期的な培養は、抗癌薬理学的特性を調査するための比較的迅速かつパーソナライズされた方法を提供し、これはおそらくパーソナライズされた癌治療の特徴となるでしょう。
患者由来異種移植片(PDX)は、薬物応答プロファイリング12の代替前臨床モデルとして好ましい。さらに、PDXモデルは癌13、14の開始および進行を研究するための強力な用具を提供する。PDXモデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境15、16の関連するヒト成分をよりよく反映する。しかし、広く使用されているPDXモデルの限界は、ヒト固形腫瘍を確立し、連続的に伝播するための低い成功率である。本研究では、PDXモデルおよび一次細胞株を確立するためのまともに成功した方法について述べる。
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Protocol
この人間の研究は、Sun Yatsen大学癌センター(SYSUCC、広州、中国)の機関倫理審査委員会によって承認されました。動物研究は、Sun Yatsen大学の機関動物ケア・使用委員会によって承認されました。注:すべての実験は、血液媒介性病原体に対する職業暴露保護ガイドラインを含む、関連する法律および制度ガイドラインに従って行われました。
1. サンプル調製
- 手術から直接胃癌組織(P0=通路0)を得る。腫瘍標本は0.5 cm3より大きくする必要があります。
- ストック溶液の3-4 mLを調製する:例えば、10%の胎児ウシ血清(FBS)、100 U/mLペニシリンおよび0.1mg/mLストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地(1x)。
- 新鮮な腫瘍標本を4°Cのストック溶液に4時間以下入れます。
2. PDXモデルの確立 (図1)
- 滅菌手術領域を確保するために、動物実験室に移る前に30分以上紫外線ですべての材料を消毒する。
注:手術室は、ジクロロイソシアヌリ酸坐剤消毒剤で机をきれいにする前に、30分間紫外線で消毒する必要があります。その後、ポビドネヨウ素は、皮膚を消毒するために使用されます。 - 鉗子とはさみを使用して、慎重に腫瘍組織を解剖し、無菌条件下でいくつかの小片(約1mm3キューブ)にそれらをトリミングします。
- 麻酔機で1-1.5%イソルランに曝露することにより、女性の5〜7週齢のNOD-SCID-IL2rg(NSG)マウスを麻酔する。
- それは苦労を停止するが、呼吸さえ維持するまで、マウスを麻酔します。
注:50 mLの管は麻酔機械と同様に機能する簡単な装置である。手術時間が短いため、乾燥を防ぐための獣医眼の目の欠損の使用は不要です。
- それは苦労を停止するが、呼吸さえ維持するまで、マウスを麻酔します。
- 無菌はさみを使用して両方の背中の側面に1 cmの切開を行い、マウスの各側面に1つの腫瘍片を移植する。
- 腫瘍片が抜けないようにするには、生殖不能鉗子を使用して皮下組織を破壊する。次に、腫瘍組織の一部をクリップし、深部位に配置します。
- 外科縫合針で皮下縫合によってインプラント領域を閉じ、ラベル付きの耳のタグでマウスの耳をマークする
- ヨウ素で創傷を殺菌する。
- 手術後は、胸骨の再発を維持しながら、マウスを空のケージに静かに置きます。マウスの状態に細心の注意を払う;彼らは目を覚ますと、約3-4分後に歩き始めます。手術を受けたマウスを別の新しいケージに置き、手術を受けていないマウスを分離します。
- 移植部位の触診によって腫瘍サイズを評価する。週に2回、バーニエキャリパーで腫瘍を測定する。
- 腫瘍が直径10mmに達すると、動物の状態が悪化するか、腫瘍が潰瘍化し、IRB承認法でマウスを安楽死させる。再インプラントは、通過のために2つの新しいマウスに新鮮な腫瘍断片を採取し、または一次細胞株の単離のために氷上のPBSに試料を一時的に保存する。
3. 組織凍結保存
注: この部分では、主にライブティッシュキットクライオキットの方法を参照しています。主なキットと機器は、材料の表に記載されています。
- 腫瘍の直径が直径が10mmを超える場合は、IRB承認法でマウスを安楽死させる。
- 無菌鉗子およびはさみを用いて、マウスから腫瘍をゆっくりと単離する。
- 腫瘍組織をDPBSで10cmの皿で洗います。壊死領域、脂肪組織、血栓、鉗子およびはさみで結合組織を解剖し、除去する。
- 腫瘍組織を金型で最大1mmの厚さに切る。
- DPBSでスライスを10cmの皿で洗います。
注:ガラス化プロセスでは、ステップ3.6-3.8でV1/V2/V3とラベル付けされたチューブを使用します。主な成分はDMSOとショ糖です。 - スライスを鉗子でチューブV1に移し、チューブを4°Cで4分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、さらに4分間4°Cに置きます。
- V1溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。スライスを鉗子でチューブV2に移し、チューブV2を4°Cで4分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、さらに4分間4°Cに置きます。
- V2溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。スライスを鉗子でチューブV3に移し、チューブを4°Cで5分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、少なくとも5分間4°Cに置きます。
- 複数のスライスが浮遊したままの場合は、チューブを一時的に転がして反転させ、すべてのスライスが完全に沈むまでチューブを再び4°Cに置きます。必要に応じて、フローティング スライスを破棄します。
- V3溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。
- 組織ホルダーを適切な長さに切り、滅菌ガーゼの上に置きます。スライスをホルダーに移します。ホルダーをガーゼで包み、鉗子を使って液体窒素に入れ、その後5分間インキュベーションを行います。
- 低温バイアルに組織情報をラベル付けします。
- 組織スライスを持つホルダーを液体窒素に貯蔵された低温バイアルに移します。
4. 一次細胞の分離 (図2)
- 121 °Cで高圧蒸気で鉗子およびはさみを殺菌する30分間。
- 切除標本または収穫されたPDX組織からの切除胃癌サンプル。氷の上にティッシュを置き、その後、10センチメートルの無菌培養皿に組織を転送します。
- 壊死領域、脂肪組織、血栓、鉗子およびはさみで結合組織を解剖し、除去する。
- 100 U/mLペニシリンと0.1 mg/mLストレプトマイシンを含むDPBSで腫瘍組織を10cm皿に1回洗浄します。
- 皿の蓋に腫瘍組織を1mm3に切ります。各部分の最大厚さは1ミリメートルでなければなりません。
- 1型コラゲナーゼおよびトリプシン(1:14)溶液の約7 mLを用いて50 mL遠心チューブに組織を移します。混合物を短時間渦にする。
- 37°Cの水浴でチューブを30〜40分間インキュベートし、5分ごとに混合物を渦します。
- チューブに10%FBSを補充したRPMI-1640培地(1x)を同量に加えます。混合物を徹底的に渦。
- 40 μm フィルターを通してろ過を遅くすることにより、混合物を新しい 50 mL 遠心分離管に移します。
注:40 μm フィルターを使用して、がん細胞の比率を高くします。必要に応じて、100 μm フィルターを使用して、免疫細胞などのより多くの種類の細胞を保存できます。 - RTで5-7分間113-163 x gで濾液を遠心分離します。
- 5mLのPBSでペレットを洗浄し、上清を慎重に取り除きます。
- ペレットが赤色の場合、多くの赤血球が含まれています。500 μLの赤血球リシスバッファーでペレットをゆっくりと再中断します。5分のインキュベーションの後、PBSの5 mLを追加し、慎重に上清を除去します。
- 培養培地でペレットを再懸濁し、無菌10cm皿に混合物を移す。
- 2~3日ごとに培地を血清含有培地に置き換えます。
- トリプシン/EDTAを用いて一次細胞を50%合流に達すると通過する。
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Representative Results
ここで、手術からの腫瘍組織は、次のステップまでストック溶液中に保存した。4時間以内に、腫瘍組織を小片に切断し、イソフルラン浸綿を用いて麻酔を行ったNSGマウスの後部側面に移植した。1cm3より大きい腫瘍は、新しいマウスへの移植のために切除することができる(図1)または慎重にスライスし、プロトコルに従って液体窒素中に保存することができる。この研究では、第一世代の腫瘍は後の世代の腫瘍よりもゆっくりと成長し、適切なサイズに達するまでに3週間以上をかかえた。第一世代皮下腫瘍形成の成功率は80%を超えた。顕微鏡下でH&E染色によりPDXモデルから癌細胞の同一性を確認した(図3C)。最後に、凍結保存された腫瘍組織からの腫瘍形成の成功率は約95%であった。
原発癌細胞は、個々の腫瘍を調べるための別の方法として単離された。細胞は、手術標本またはPDXモデルのいずれかから単離された。腫瘍組織をDPBSで洗浄し、断片的に切断した。組織断片を1型コラーゲナゼとトリプシン(1:14)で濾過する前に徹底的に消化した。赤血球を除去した後、細胞を他の癌細胞と同様に培養した。生き残った間葉系細胞は、その後の通路で死ぬ(図2)。形態の違いに基づいて、腫瘍細胞を容易に認識することができます。正常な細胞は均一な形と大きさを持っていますが、癌細胞は様々な大きさと形をしています。さらに、癌細胞では、核は不規則な構造と比較的小さな細胞質を有する。従って、一次細胞は、顕微鏡下で2人の病理学者によって独立して認証された(図3A)。さらなる確認のために、H&E染色を用いて、固定後の癌細胞形態を観察した(図3B)。一次細胞株の分離に成功した率は約40%であった。一次細胞は、単離後に4~5回通過する必要があり、病理学的認証が必要です。これらの手順には約 20 日かかる場合があります。
図 1.患者由来異種移植片(PDX)モデルの確立のためのスキーマ。
PDXモデルを正常に確立するには、手術室で腫瘍塊を切除して即時処理を行います。腫瘍をいくつかの小片に分割します。イソフルラン浸漬綿玉を50mLチューブに入れてマウスを麻酔し、後部の側面に傷を切る。鈍い鉗子で皮下組織を解剖し、鉗子を使用して腫瘍の1片を創傷から皮下に置く。縫合し、傷を殺菌します。麻酔プロセスは、呼吸速度などのマウスのバイタルサインを注意深く監視する必要があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.プライマリ セルを分離するためのスキーマ。
手術室から腫瘍標本を入手する。腫瘍組織を素早く洗い、切り分けます。1型のコラゲナーゼで腫瘍標本を消化し、トリプシンを37°Cで30〜40分間消化し、5分ごとにチューブを混合する。次に、10%FBSと同じ量の媒体を追加し、混合物を遠心分離し、新しいチューブに濾液を入れます。上清を取り出し、ペレットを洗います。ペレットの色に基づいて、赤血球をlyseするかどうかを決定します。ペレットを新しい10cm無菌皿に移し、癌細胞スクリーニングの前にいくつかの通路について細胞を培養する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.原発癌細胞の認証
(A) GC患者からの一次細胞画像。細胞を新鮮な組織から直接単離し、5回以上通過した。スケールバー:200 μm(左)、100 μm(中央)、50μm(右)。(B) H&E染色原発性胃癌細胞の写真スケールバー:500 μm(左)、200 μm(中央)、100 μm(右)。(C) H&E染色PDX腫瘍の写真スケールバー:500 μm(左)、200 μm(中央)、100 μm(右)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
胃癌は、限られた治療選択肢を持つ積極的な疾患です。したがって、胃癌のモデルは、クリニック4、8、17への直接翻訳で機能的研究を可能にする重要なリソースとなっています。ここでは、胃癌PDXモデル及び一次細胞株を確立する方法及びプロトコルについて述べた。重要なことに、胃癌標本の形態学的および生物学的特性の両方がPDXモデルにほとんど保持された。
PDX モデルを確立するためのプロトコルには、エングラフメント速度を高めるために強調する必要がある重要な点がいくつかあります。NSG(NOD-SCID-IL2rg)マウスは、これらのマウスがより重度の免疫抑制であり、T、BおよびNK細胞18、19、20、21において欠乏であるので、免疫欠損マウスモデルとして推奨される。さらに、マウスの重度の免疫不全のために、無菌性は、すべての実験で維持されなければならない。鉗子やはさみを含むすべてのツールは、無菌に保たなければなりません。NSGマウスは、感染を避けるために低密度で飼育する必要があります。さらに、多くの要因は、サンプルサイズ、試料中の間葉細胞の割合、および移植部位などの腫瘍形成に影響を与える可能性があります。
原発性癌細胞の確立における重要な側面の1つは、無菌性である。さらに、間葉細胞は通常原発癌細胞よりも早く増殖するため、間葉細胞が消滅するまで数世代にわたって細胞を通過させる必要があります。最後に、培養セルを認証する必要があります。
PDX腫瘍サンプルを保存するためにガラス化凍結保存法を用いた。この保存方法の主なメリットは、1)凍結後の長期保存が可能(約10年)です。2)解凍後の形態は、新鮮な組織の形態と一致している。3)原発性腫瘍細胞はまだ解凍後に単離することができます。4)PDXの腫瘍形成能は、凍結保存の前後に基本的に変わらない。5)組織は、凍結セクションを作るために使用することができ、パラフィンで固定することができます。6)DNA、RNAおよびタンパク質活性が保存されます。そして7)この方法は、外科標本および生検組織の両方に適用可能である。
PDXモデルの主な制限は、腫瘍の微小環境が腫瘍の増殖および薬物応答に及ぼす影響を減衰させ、したがって免疫調節剤のスクリーニングにおけるPDXモデルの適用を制限する免疫不全マウスの使用を含む。さらに、PDXモデルの開発には通常4~8ヶ月かかり、これは多くの胃患者の予想生存期間よりも長い。このため、原発性癌細胞株の確立は、薬物応答研究のための効果的な補完的な方法である可能性がある。
PDXモデルと一次細胞株は、薬剤開発と腫瘍生物学研究の開始と進行に不可欠な部分になりつつあります。これらのモデルは、従来の癌細胞株よりもヒト癌のより正確な表現を提供し、新規な抗癌治療の前臨床評価を改善する可能性を有する。さらに、これらのモデルは、癌患者の異なるサブグループ間の分子特性または腫瘍シグネチャを比較するのに有用である可能性がある。これらのツールは、最終的に薬剤開発とがん生物学の研究でより広い役割を果たすることは間違いありません.
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(81572392)によって支援されました。中国国家主要研究開発プログラム(2016YFC1201704);広東特別支援プログラムの先端科学と技術革新的な若者の才能(2016TQ03R614)。
我々は、特に数字の準備に役立つ広州サジェンバイオテック株式会社に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Biologix, Shandong, China | 15-1040 | |
| Biological Microscope | OLYMPUS, Tokyo, Japan | OLYMPUS CKX41 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Mittelsachsen, Germany. | 5427R | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | HERACELL 150i | |
| DPBS | Basalmedia Technology, Shanghai, China | L40601 | |
| Electro-Thermostatic Water Cabinet | Yiheng, Shanghai, China | DK-8AXX | |
| Fetal bovine serum | Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada | 86150040 | |
| Isoflurane | Baxter, China | CN2L9100 | |
| Live Tissue Kit Cryo Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2601 | |
| Live Tissue Thaw Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2602 | |
| NSG | Biocytogen, Beijing, China | B-CM-002-4-5W | |
| Penicilin&streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 15140122 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, Beijing, China | R1010 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 8118367 | |
| Surgical Suture Needles with Thread | LingQiao, Ningbo, China | 3/8 arc 4×10 | |
| Tissue-processed molds and auxiliary blades | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2603 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 2003779 | |
| Type 1 collagenase | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 17100017 |
References
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