Summary
目前的协议描述了从外科胃癌样本中建立患者衍生异种移植(PDX)模型和原发性癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。
Abstract
使用临床前模型来增进我们对肿瘤生物学的理解,并研究治疗剂的疗效是癌症研究的关键。虽然有许多既定的胃癌细胞系和许多传统的转基因小鼠模型用于临床前研究,但这些体外和体内模型的缺点限制了其应用。由于这些模型在文化中的特征已经改变,它们不再模拟肿瘤异质性,它们的反应也未能预测人类的反应。因此,正在开发更好地代表肿瘤异质性的替代模型。患者衍生的异种移植(PDX)模型保留了癌细胞的组织外观,保留了肿瘤内异质性,并更好地反映肿瘤微环境的相关人体成分。然而,开发PDX模型通常需要4-8个月,这比许多胃患者的预期存活时间更长。因此,建立原发性癌细胞系可能是药物反应研究的有效补充方法。目前的协议描述了从外科胃癌样本建立PDX模型和原发性癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。
Introduction
胃癌是全球第五大常见癌症,也是癌症死亡的第三大原因。2018年,全球新诊断出100万多例胃癌病例,估计有78.3万人死于此病。在东北亚国家,胃癌的发病率和死亡率仍然很高。尽管在癌症治疗领域取得了显著进展,但晚期胃癌患者的预后仍然很差,五年生存率约为25%4,5,6 7,.因此,迫切需要制定治疗胃癌的新策略
胃癌的治疗具有挑战性,因为它具有很高的异质性8,9。因此,如何解决肿瘤异质性的挑战,实现精密医学是癌症研究的核心。体外和体内模型在阐明胃癌的异质机制和生物学中起着至关重要的作用。然而,虽然有许多胃癌细胞系和许多传统的转基因小鼠模型用于临床前研究,这些模型的缺点限制了其应用10。由于这些模型在文化中的特征已经改变,它们不再模拟肿瘤异质性,它们的反应也未能预测人类的反应。这些问题严重限制了确定癌症患者对靶向药物作出反应的子组的可能性。原发性肿瘤的短期培养为研究抗癌药理特性提供了一种相对快速和个性化的方法,这可能是个性化癌症治疗的标志。
患者衍生的异种移植物(PDXs)是药物反应分析12的替代临床前模型的首选。此外,PDX模型为研究癌症的起始和进展提供了一个强大的工具13,14。PDX模型保留了癌细胞的组织外观,保留了肿瘤内异质性,并更好地反映肿瘤微环境的相关人体成分15、16。然而,广泛使用的PDX模型的局限性是建立和连续传播人类实体肿瘤的成功率较低。在这项研究中,描述了建立PDX模型和主细胞系的相当成功的方法。
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Protocol
这项研究得到了中山大学癌症中心(中国广州SYSUCC)的制度伦理审查委员会的批准。动物研究得到了中山大学动物护理与使用委员会的批准。注:所有实验均符合相关法律和机构准则,包括《防止血液传播病原体的职业接触指南》。
1. 样品制备
- 直接从手术中获得胃癌组织(P0 = 通道0)。肿瘤标本应大于0.5厘米3。
- 制备3-4 mL的库存溶液:例如,RPMI-1640介质(1x)辅以10%胎儿牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和0.1毫克/mL链霉素。
- 将新鲜肿瘤标本放入4°C的库存溶液中,时间不超过4小时。
2. 建立PDX模型(图1)
- 为确保无菌手术区,在转移到动物实验室之前,用紫外线对所有材料进行30分钟以上的消毒。
注:手术室需要用紫外线消毒30分钟,用二氯异氰酸钠消毒剂清洁办公桌。然后用小碘对皮肤进行消毒。 - 使用钳子和剪刀,仔细解剖肿瘤组织,并在无菌条件下将它们切成几个小块(约1毫米3立方)。
- 用麻醉机照射1-1.5%的极性胶合物,麻醉雌性5至7周大的NOD-SCID-IL2rg(NSG)小鼠。
- 麻醉鼠标,直到它停止挣扎,但保持均匀的呼吸。
注:50 mL 管是一种简单的设备,其功能类似于麻醉机。由于手术时间短,没有必要使用兽眼软膏来防止干燥。
- 麻醉鼠标,直到它停止挣扎,但保持均匀的呼吸。
- 使用无菌剪刀在两侧翼上切开1厘米,并将一块肿瘤植入小鼠的每个侧翼。
- 为了确保肿瘤片块不会滑出,使用无菌钳来破坏皮下组织。然后,夹住一块肿瘤组织,并将其放入深层部位。
- 用手术缝合针关闭下皮缝合,用标记的耳标标记小鼠耳朵。
- 用碘消毒伤口。
- 手术后,在保持胸腔恢复的同时,轻轻地将小鼠放在空笼子里。密切注意小鼠的状况;他们醒来,开始步行约3-4分钟后。把接受手术的老鼠放在另一个新笼子里,从那些没有接受手术的笼子里分离出来。
- 通过植入部位的触觉评估肿瘤大小。每周用Vernier卡钳测量肿瘤两次。
- 一旦肿瘤达到10毫米直径,动物状况恶化,或肿瘤溃疡,用IRB批准的方法安乐死小鼠。重新植入收获的新鲜肿瘤片段到2只新小鼠中进行传体内,或将标本暂时储存在PBS的冰上,以分离原细胞系。
3. 组织冷冻保存
注:此部分主要参考活组织套件冷冻套件的方法。主要套件和设备列在材料表中。
- 当肿瘤直径大于10毫米时,使用IRB批准的方法对小鼠实施安乐死。
- 使用无菌钳子和剪刀,慢慢从小鼠中分离出肿瘤。
- 在10厘米的菜盘中用DPBS清洗肿瘤组织。用钳子和剪刀解剖和去除坏死区、脂肪组织、血块和结缔组织。
- 用模具将肿瘤组织切割到最大1毫米厚度。
- 在 10 厘米的菜盘中用 DPBS 清洗切片。
注: 在步骤 3.6-3.8 中,Vitited 过程涉及使用标有 V1/V2/V3 的管。主要成分是DMSO和蔗糖。 - 将切片用钳子转移到管 V1 中,在 4°C 孵育管 4 分钟,滚动并短暂反转管,并将其置于 4°C 再放置 4 分钟。
- 将 V1 溶液倒入 10 厘米的盘中。将切片用钳子转移到管 V2 中,在 4°C 孵育管 V2 4 分钟,滚动并短暂反转管,并将其置于 4°C 再放置 4 分钟。
- 将 V2 溶液倒入 10 厘米的盘中。将切片用钳子转移到管V3中,在4°C下孵育管5分钟,滚动并短暂反转管,并将其置于4°C至少5分钟。确保切片全部沉入管底。
- 如果几个切片保持浮动,将管短暂滚动和反转,然后再次将管置于 4°C,直到所有切片完全下沉;如有必要,丢弃浮动切片。
- 将 V3 溶液倒入 10 厘米的盘中。
- 将组织支架切到适当的长度,并将其放在无菌纱布上。将切片转移到支架上。用纱布包裹支架,用钳子将其放入液氮中,然后孵育5分钟。
- 用组织信息标记低温小瓶。
- 将带有组织切片的支架转移到低温小瓶中,这些小瓶储存在液氮中。
4. 主细胞的隔离 (图2)
- 在121°C下用高压蒸汽消毒钳子和剪刀30分钟。
- 从切除的标本或收获的PDX组织中切除胃癌样本。将组织放在冰上,然后将组织转移到10厘米无菌培养皿中。
- 用钳子和剪刀解剖和去除坏死区、脂肪组织、血块和结缔组织。
- 在10厘米的菜盘中用含有100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的DPBS清洗肿瘤组织一次。
- 将肿瘤组织切成1毫米3片,放在盘子的盖子上;每块的最大厚度应为 1 mm。
- 将组织转移到50 mL离心管中,其中约7 mL为1型胶原酶和胰蛋白酶(1:14)溶液。短暂地涡旋混合物。
- 在37°C的水浴中孵育管子30-40分钟。涡流每5分钟孵化一次。
- 在管中加入相同体积的 RPMI-1640 介质 (1x), 并辅以 10% FBS。彻底涡旋混合物。
- 通过 40 μm 过滤器缓慢过滤,将混合物转移到新的 50 mL 离心管中。
注:使用40μm过滤器,以确保癌细胞的比例更高。如有必要,100 μm 过滤器可用于保留更多类型的细胞,如免疫细胞。 - 在 RT 处将滤液在 113-163 x g下离心 5-7 分钟,小心地去除上清液。
- 用 5 mL 的 PBS 清洗颗粒,并小心地去除上清液。
- 如果颗粒是红色的,它含有许多红细胞。用500μL红细胞赖沙缓冲液轻轻重新悬浮颗粒。孵育5分钟后,加入5mL的PBS,并小心地去除上清液。
- 用培养基重新悬浮颗粒,并将混合物转移到无菌的10厘米盘中。
- 每2-3天用含血清的培养基替换培养基。
- 当原细胞达到50%汇合时,使用胰蛋白酶/EDTA传递原细胞。
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Representative Results
在这里,肿瘤组织从手术被保存在库存溶液,直到下一步。在4小时内,肿瘤组织被切成小块,植入NSG小鼠的背侧,这些小鼠使用松草浸泡的棉花进行麻醉。大于1cm3的肿瘤可以被切除,植入新小鼠(图1),或按照协议小心切片并保存在液氮中。在这项研究中,第一代肿瘤的生长速度比后世的要慢,需要3周或更长时间才能达到适当的大小。第一代皮下肿瘤形成成功率大于80%。我们在显微镜下通过H&E染色确认了PDX模型中癌细胞的身份(图3C)。最后,冷冻保存肿瘤组织肿瘤形成成功率约为95%。
原发性癌细胞被分离为研究单个肿瘤的另一种方法。这些细胞是从手术标本或PDX模型中分离出来的。肿瘤组织用DPBS洗涤,切成碎片。在过滤前,用1型胶原酶和胰蛋白酶(1:14)彻底消化组织片段。去除红细胞后,细胞培养的方式与其他癌细胞相同。存活的中生细胞在随后的段落中死亡(图2)。根据形态的差异,我们可以很容易地识别肿瘤细胞。正常细胞的形状和大小是一致的,但癌细胞有各种大小和形状。此外,在癌细胞中,细胞核有不规则的结构和相对较小的细胞质。因此,主细胞由两名病理学家在显微镜下独立验证(图3A)。为进一步确认,H&E染色用于观察固定后的癌细胞形态(图3B)。原细胞系成功分离率约为40%。分离后,主细胞必须通过4或5次,并且需要病理认证。这些步骤可能需要大约 20 天。
图 1.建立患者衍生异种移植 (PDX) 模型的架构。
要成功建立PDX模型,在手术室中切除肿瘤质量,以便立即处理。把肿瘤分成几个小块。将用无氟浸泡的棉球放入50 mL管中,对小鼠进行麻醉,并切伤在背侧侧。用钳子解剖皮下组织,用钳子将肿瘤的一块放在离伤口远的地方。缝合和消毒伤口。麻醉过程需要仔细监测小鼠生命体征,如呼吸速率。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.用于隔离主单元的架构。
从手术室获取肿瘤标本。快速清洗肿瘤组织,并切成碎片。用1型胶原酶和胰蛋白酶在37°C下消化肿瘤标本30-40分钟,每5分钟混合一次管。然后,加入与10%FBS的中等体积的介质,将混合物离心,并将滤液放入新管中。取出上清液,然后清洗颗粒。根据颗粒的颜色,决定是否对红血球进行分型。将颗粒转移到新的10厘米无菌盘中,在癌细胞筛选之前培养多个通道的细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.原发性癌细胞的认证。
(A)来自GC患者的初级细胞图像。细胞直接从新鲜组织中分离,通过超过5次。刻度条:200 μm(左)、100 μm(中间)和 50 μm(右)。(B) H&E染色原发性胃癌细胞的图片。刻度条:500 μm(左)、200 μm(中间)和 100 μm(右)。(C) H&E 染色 PDX 肿瘤的图片。刻度条:500 μm(左)、200 μm(中间)和 100 μm(右)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
胃癌是一种具有攻击性的疾病,治疗选择有限;因此,胃癌模型已成为一个关键资源,使功能研究直接翻译到诊所4,8,17。在这里,我们描述了建立胃癌PDX模型和原细胞系的方法和协议。重要的是,胃癌标本的形态和生物学特征大多保留在PDX模型中。
在建立PDX模型的协议中,需要强调一些要点,以提高移植率。NSG(NOD-SCID-IL2rg)小鼠被推荐为免疫缺陷小鼠模型,因为这些小鼠的免疫抑制更为严重,并且缺乏T、B和NK细胞18、19、20、21。此外,由于小鼠的严重免疫缺陷,必须在所有实验中保持无菌。所有工具,包括钳子和剪刀,必须保持无菌。NSG小鼠应低密度繁殖,以避免感染。此外,许多因素也可能影响肿瘤的形成,如样本大小、标本中等位细胞的比例和植入部位。
原发性癌细胞的一个关键方面是无菌。此外,由于中位细胞通常比原发癌细胞生长更快,细胞可能需要经过几代,直到中质细胞死亡。最后,对培养的单元进行身份验证。
我们使用玻璃化冷冻保存法来保存PDX肿瘤样本。这种保存方法的主要优点如下:1)冷冻后可长期储存(约10年);2)解冻后的形态与新鲜组织的形态一致;3)原发性肿瘤细胞解冻后仍可分离;4)PDX的肿瘤形成能力在冷冻保存前后基本保持不变;5) 组织可用于制作冷冻部分,并可用石蜡固定;6) DNA、RNA和蛋白质活性得以保存;7) 该方法适用于手术标本和活检组织。
PDX模型的主要局限性在于使用免疫功能低下小鼠,这可以减轻肿瘤微环境对肿瘤生长和药物反应的影响,从而限制PDX模型在免疫调节剂筛选中的应用。此外,开发PDX模型通常需要4-8个月,这比许多胃患者的预期存活时间更长。因此,建立原发性癌细胞系可能是药物反应研究的有效补充方法。
PDX模型和原细胞系正在成为药物开发以及肿瘤生物学研究的启动和进展的一个组成部分。这些模型提供了比传统癌细胞系更准确的人类癌症表现,并有可能改进新型抗癌疗法的临床前评估。此外,这些模型可能有助于比较癌症患者的不同子组之间的分子特征或肿瘤特征。毫无疑问,这些工具最终将在药物开发和癌症生物学研究中发挥更大的作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金(81572392)的支持;国家重点研究与开发计划(2016YFC1201704);广东省科技创新青年人才专项扶持计划(2016TQ03R614)。
我们特别感谢广州萨金生物科技有限公司在编制数字方面提供的援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Biologix, Shandong, China | 15-1040 | |
| Biological Microscope | OLYMPUS, Tokyo, Japan | OLYMPUS CKX41 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Mittelsachsen, Germany. | 5427R | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | HERACELL 150i | |
| DPBS | Basalmedia Technology, Shanghai, China | L40601 | |
| Electro-Thermostatic Water Cabinet | Yiheng, Shanghai, China | DK-8AXX | |
| Fetal bovine serum | Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada | 86150040 | |
| Isoflurane | Baxter, China | CN2L9100 | |
| Live Tissue Kit Cryo Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2601 | |
| Live Tissue Thaw Kit | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2602 | |
| NSG | Biocytogen, Beijing, China | B-CM-002-4-5W | |
| Penicilin&streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 15140122 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, Beijing, China | R1010 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 8118367 | |
| Surgical Suture Needles with Thread | LingQiao, Ningbo, China | 3/8 arc 4×10 | |
| Tissue-processed molds and auxiliary blades | Celliver Biotechnology, Shanghai, China | LT2603 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 2003779 | |
| Type 1 collagenase | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA | 17100017 |
References
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