Summary
Cette étude décrit l'hydratation classique utilisant la méthode mince de film de lipide pour la préparation de nanoliposome suivie de la caractérisation de nanoparticules. Une protéine 47 kDa-hydrophile et globulaire, la tarine, est avec succès encapsulée comme stratégie pour améliorer la stabilité, éviter le dégagement rapide, et favoriser la libération contrôlée. La méthode peut être adaptée à l'encapsulation des molécules hydrophobes.
Abstract
Les nanocapsules liposome ont été appliquées à de nombreuses fins dans les industries pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. Les attributs des liposomes incluent leur biocompatibilité, biodégradabilité, non-immunogénicité, non-toxicité, et capacité de piéger les composés hydrophiles et hydrophobes. L'hydratation classique des couches lipidiques minces dans un solvant organique est appliquée ici comme technique pour encapsuler la tarine, une lectine végétale, dans les nanoliposomes. La taille nanoliposome, la stabilité, l'efficacité de piégeage, et la caractérisation morphologique sont décrites en détail. Les nanoliposomes sont préparés à l'aide de 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium; DSPE-MPEG 2000), et le cholesterylhemisuccinate (CHEMS) en tant que constituants principaux. Les lipides sont d'abord dissous dans le chloroforme pour obtenir un film lipidique mince qui est ensuite réhydraté dans la solution de sulfate d'ammonium contenant la protéine à piéger et incubé pendant la nuit. Ensuite, des techniques de sonication et d'extrusion sont appliquées pour générer des vésicules unilamellar nanométriques. La taille et l'indice de polydispersité des nanovésicules sont déterminés par la diffusion dynamique de la lumière, tandis que la morphologie des nanovésicules est évaluée par microscopie électronique à balayage. L'efficacité du piégeage est déterminée par le rapport entre la quantité de protéines non encapsulées et la quantité originale de protéines initialement chargées. Les liposomes homogènes sont obtenus avec une taille moyenne de 155 nm et la valeur de l'indice de polydispersity de 0,168. Une efficacité de piégeage élevée de 83% est atteinte.
Introduction
Le nombre d'études portant sur des systèmes efficaces d'administration de médicaments a augmenté au cours des dernières années. Cependant, des limitations telles que le dégagement rapide, la biodistribution pauvre, et la solubilité au pH physiologique et l'utilisation cellulaire insuffisante doivent encore être dépassées. L'utilisation des nanosystèmes a émergé comme progrès récents dans la thérapeutique du cancer, appliquée pour augmenter la concentration intracellulaire de médicaments à l'intérieur des cellules cancéreuses tout en minimisant la toxicité dans les cellules saines. En outre, des nanoparticules obtenues à partir d'une gamme différente de matériaux (c.-à-d. polymères, dendrimères, liposomes, virus, nanotubes de carbone et métaux tels que l'oxyde de fer et l'or) sont actuellement appliquées pour améliorer les effets anticancéreux et réduire les toxicité1. Les nanocapsules liposome en particulier ont été appliquées à de nombreuses fins dans les industries pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. Ces dernières années, divers produits nutraceutiques tels que les vitamines, les enzymes et les extraits de plantes à base de plantes ont été formulés à l'aide de la technologie liposome2.
Les liposomes sont des vésicules sphériques composées d'un ou plusieurs bicouches lipidiques concentriques spontanément formées par la dispersion des phospholipides dans les médias aqueux3,4. Les têtes polaires des phospholipides sont situées sur les surfaces extérieures et intérieures des membranes, en contact avec l'environnement aqueux. En revanche, les chaînes d'acides gras forment le noyau hydrophobe des membranes et sont protégées de l'eau5. Certains attributs des liposomes qui en font des systèmes attrayants d'administration de médicaments incluent leur biocompatibilité, biodégradabilité, non-immunogénicité, non-toxicité, et capacité de piéger les composés hydrophiles et hydrophobes6.
Les liposomes peuvent être préparés à l'aide de diverses étapes de processus telles que l'agitation, la sonication, l'extrusion, la lyophilisation, la congélation et la décongélation. Les méthodes classiques incluent l'évaporation de phase inverse, l'injection de solvant, et la dialyse de détergent. La méthode la plus appliquée est l'hydratation mince de film lipidique, également connu sous le nom de méthode de Bangham, qui est employé pour obtenir les formes vésiculaires-lipidiques7,8,9,10,11. La lamillarité (le nombre de bicouches phospholipides) et la taille des particules sont des paramètres classiques utilisés pour caractériser les liposomes comme 1) vésicules unilamellar (ULV), formé par un bilayer phospholipid unique et de taille variable comme suit: i) petit unilamellar vésicules (VUS, 0,02-0,20 m), ii) de grandes vésicules unilamellar (VJ, 0,2 à 1,0 m) et iii) de vésicules unilamellar géantes (VGU, 1 m) ; ou 2) vésicules multilamellar (MLV, '0.1 'm)3,12. La taille de la vésicule est un paramètre important lors de l'examen d'une utilisation thérapeutique, comme dans le traitement du cancer, dans lequel les tailles de 200 nm sont idéales pour permettre aux nanovésicules de traverser la barrière endothéliale et d'atteindre les tissus tumoraux4.
Ici, la procédure d'encapsulation suivant l'hydratation classique d'une technique mince de film de lipide7 a été décrite utilisant la tarine, une lectine végétale caractérisée comme protéine globulaire hydrophile13,14,15 . Les vésicules nanométriques sont produites en incluant des étapes de sonication et d'extrusion dans la technique principale, résultant en nanovésicules liposomiques stables avec une efficacité de piégeage élevée16.
Protocol
1. Préparation de nanocapsules liposomiques de tarin16
REMARQUE : Toutes les préparations doivent être préparées en triple afin d'obtenir un volume plus important (7 ml) et de permettre à l'échantillon d'être centrifugé dans un ultracentrifuge (voir détails ci-dessous).
- Peser les composants liposome à l'aide d'un équilibre analytique, comme le montre le tableau 1.
- Dissoudre les composants lipidiques dans le chloroforme à l'aide d'un flacon volumétrique de 250 ml qui s'insère dans un évaporateur rotatif pour éviter la perte de matière.
- Remuer le mélange à 150 tr/min pendant 15 min.
- Retirez le chloroforme à l'aide d'un évaporateur rotatif dans les conditions suivantes :
- Ajuster la bouche triturérienne à la position standard (25 degrés) pour une efficacité optimale, en contact avec l'eau du bain chauffant.
REMARQUE : Le bras de l'équipement doit être incliné à 25 degrés pour maintenir le contact entre le flacon volumétrique et le bain d'eau, tout en n'affectant pas l'efficacité de l'évaporation ou endommageant l'échantillon. La position standard peut varier en fonction de la marque de l'équipement. - Fixer la température du condenseur à un minimum de 3 oC.
- Fixer la température du bain chauffant à 40 o1 oC.
- Définir la rotation à 120 tr/min.
- Ajuster le vide à 207 mbar et le point d'ébullition à 20 oC.
- Après 25 min, retirer le flacon et jeter le solvant évaporé, en restant dans le condenseur, de façon appropriée.
REMARQUE : Un film mince et opaque, composé des composants liposome, est formé dans cette étape et peut être facilement visualisé. Le solvant évaporé restant dans le condenseur doit être stocké dans des destinataires d'élimination (chlorés) pour être manipulé par une entreprise spécialisée pour un rejet approprié.
- Ajuster la bouche triturérienne à la position standard (25 degrés) pour une efficacité optimale, en contact avec l'eau du bain chauffant.
- Hydratez le film lipidique pour atteindre une concentration lipidique de 0,01 M dans une solution de sulfate d'ammonium de 0,3 M (pH à 7,4) contenant de la tarine à 1 mg/ml à un volume final de 10 ml.
- Remuer le mélange pendant 40 min et couver toute la nuit à 4 oC.
REMARQUE : Cette étape peut être considérée comme un point d'arrêt. L'incubation de nuit n'est pas obligatoire.
- Remuer le mélange pendant 40 min et couver toute la nuit à 4 oC.
- Après l'incubation, sonicate la suspension pendant 1 min à 25 oC (température ambiante; RT) pour réduire la taille de la vésicule et éviter l'agrégation.
REMARQUE : La réduction de taille a été exécutée dans un sonicator ultrasonique dans les conditions suivantes : 130 W et 40 kHz. - Effectuez une extrusion de 12 cycles à travers une membrane de pores en polycarbonate de 0,2 m.
REMARQUE : Avant le processus d'extrusion, testez l'assemblage mini-extrudeur à l'aide d'eau pour éviter les fuites d'échantillons. Une membrane de 0,1 m de pores est également appropriée. Dans ce cas, préchauffez le support de mini-extrudeur au-dessus de la température de transition de lipide pour faciliter l'extrusion, tout en maintenant les caractéristiques physicochimiques des lipides et des protéines.- Adéquation zetonnez les pièces du mini extrudeur, tel que décrit dans le manuel du fabricant.
- Placez la membrane de polycarbonate entre deux supports de filtre pré-humides et placez-la dans le support.
- Insérez une seringue vide de 1 ml dans l'appareil, remplissez l'autre seringue à son volume total avec la suspension liposomique et insérez-la sur le côté opposé.
- Effectuez une extrusion de 12 cycles à travers une membrane de pores en polycarbonate de 0,2 m. Poussez l'échantillon d'une seringue à l'autre, lentement. Recueillir la suspension extrudée dans un tube pré-réfrigéré.
REMARQUE : La membrane de polycarbonate ne doit être remplacée que lorsque le transfert de l'échantillon d'une seringue à une autre devient difficile. La suspension liposomique devrait devenir claire pendant le processus d'extrusion en raison de la réduction de taille due à la formation des VUS. Environ 0,2 ml de l'échantillon peut être perdu au cours de cette étape.
- Séparer les liposomes par ultracentrifugation.
REMARQUE : Maintenez les échantillons dans un bain de glace jusqu'à ce que l'ultracentrifugere soit prête à être utilisée. Séparer les VUS des composants restants et du sulfate d'ammonium par ultracentrifugation à l'aide d'une ultracentrifugeuse avec un rotor à balançoire (voir les détails ci-dessous).- Peser l'échantillon dans le tube de titane qui s'adapte au rotor et équilibrer les tubes. Vérifiez le volume minimum requis en fonction du rotor utilisé pour éviter d'endommager les tubes, et ajustez le volume de suspension liposomique avec du sulfate d'ammonium, si nécessaire.
REMARQUE : Le seau à balançoire doit toujours être soutenu sur le support lorsqu'il est à l'extérieur de la centrifugeuse pour éviter de rayer les « rayures zébrées » (c.-à-d. les rayures noires et blanches sur le fond), qui sont utilisées par la centrifugeuse pour déterminer la vitesse de rotation. - Allumer le vide avant d'utiliser la centrifugeuse pour qu'elle se réfrigérer.
- Mettre les tubes de titane dans le seau à balançoire.
REMARQUE : Soulevez les tubes à la position qu'ils assument lors de la course pour s'assurer qu'ils sont parfaitement ajustés. - Relâchez le vide, ouvrez la porte de centrifugeuse et placez le rotor à l'intérieur.
REMARQUE : Faites attention à la marque de cercle sur le fond du rotor, qui doit s'adapter dans la direction opposée de la même marque de cercle dans la centrifugeuse elle-même. - Fermez la porte de centrifugeuse, appuyez sur Vide et attendez que le vide atteigne de 200 à 20 microns ou de 26 Pa à 3 Pa.
- Ajuster les paramètres de l'écran d'ultracentrifuge à 150 000 x g (l'équivalent de 29 600 tr/min pour le seau à balançoire susmentionné) pendant 90 min à 4 oC (accélération : max, décélération : max).
REMARQUE : Convertissez toujours la vitesse en x g si la centrifugeuse spécifique est fixée en régime rpm. Utilisez le site Web de centrifugeuse pour convertir l'unité en fonction du rotor utilisé. - Appuyez sur Rappel, vérifiez les conditions et appuyez sur Démarrer pour courir.
REMARQUE : Attendez que la centrifugeuse atteigne la vitesse désirée. - Après 90 min, relâchez le vide en appuyant sur le bouton Vacuum et ouvrez la porte de la centrifugeuse lorsque le vide atteint 200-700 microns (équivalent à 26-93 Pa).
- Éteignez la centrifugeuse, retirez le rotor de l'intérieur et laissez-le sécher sur le banc avec les seaux à sécher.
- Maintenir les échantillons ultracentrifuges sur la glace.
- Peser l'échantillon dans le tube de titane qui s'adapte au rotor et équilibrer les tubes. Vérifiez le volume minimum requis en fonction du rotor utilisé pour éviter d'endommager les tubes, et ajustez le volume de suspension liposomique avec du sulfate d'ammonium, si nécessaire.
- Soigneusement, séparer le supernatant de la pastille en tournant le tube à l'envers en un tube jetable de centrifugeuse de 15 ml pour séparer le supernatant et le granule.
REMARQUE : Conserver le supernatant contenant la protéine non encapsulée à 4 oC. Il sera utilisé pour déterminer l'efficacité de l'encapsulation. La pastille apparaît comme une gelée translucide. - Suspendre la pastille contenant la protéine encapsulée dans hePES tamponné saline (3 ml de 1x HBS).
REMARQUE : Le HBS 2x (solution de stock) est préparé en diluant les quantités suivantes de réactifs dans de l'eau distillée : 140 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES, puis ajustant le pH à 7,4 et volume final à 100 ml. Na2HPO4 peut être remplacé par NaHCO3ou omis pour éviter les interférences si l'on veut déterminer la concentration de liposome. La solution de stock HBS 2x doit être diluée dans de l'eau distillée pour obtenir HBS 1x avant utilisation.
2. Efficacité d'encapsulation
REMARQUE : Déterminez l'efficacité d'encapsulation en utilisant le protocole17de Peterson afin d'éviter l'interférence de lipide dans la quantification de protéine. Tous les échantillons (normes BSA et supernatant liposome) doivent être analysés en triple. Préparez également un tube blanc.
- Préparation des réactifs de stock et des solutions de travail17
- Pour les réactifs de stock, préparer le cuivre-tartrate-carbonate (CTC) en mélangeant 10 ml de carbonate de sodium à 20 %, 200 l de sulfate de cuivre de 0,1 %, 200 oL de tartrate de potassium de 0,2 % avec 9,6 ml d'eau distillée. Préparer 100 ml de sulfate de dodecyl de 10 % de sodium (SDS) et 0,8 N d'hydroxyde de sodium (NaOH).
- Pour les solutions de travail, préparer 10 ml de 0,15 % de désoxycholate de sodium (DOC) et 72 % d'acide trichloroacétique (TCA). Dissoudre 10 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) dans 10 ml d'eau distillée pour obtenir une solution standard de 1 mg/ml. Préparer le réactif A en ajoutant des parties égales de CTC, NaOH, SDS et H2O. Préparer le réactif B en diluant le phenol Folin-Ciocalteu 1:5 dans de l'eau distillée.
REMARQUE : Le réactif A nécessite 1 ml pour chaque tube de réaction, tandis que le réactif B nécessite 0,5 mL. Pour déterminer les volumes finaux des réactifs A et B, définissez d'abord le nombre de tubes de réaction à utiliser, en tenant compte de trois concentrations distinctes de BSA, de blanc et d'échantillons en triple. Le réactif A doit être bien homogénéisé avant utilisation et peut être stocké à 25 oC (RT) pendant 2 semaines. Le réactif B est également stable à 25 oC (RT) s'il est entreposé dans une bouteille d'ambre.
- précipitation
REMARQUE : Cette étape est effectuée dans des tubes de microcentrifuge.- Diluer le supernatant liposome avec de l'eau à un volume final de 1 ml contenant 5-100 g de protéines.
REMARQUE : Le tube blanc doit être rempli de 1 ml d'eau distillée. - Ajouter 0,1 ml de 0,15% DOC, homogénéiser par vortex, et incuber pendant 10 min à RT.
- Ajouter 0,1 ml de TCA à 72 %, bien mélanger et centrifugeuseà 3 000 x g et RT pendant 15 min.
REMARQUE : Le DOC-TCA favorise la précipitation protéique, formant deux phases distinctes. La protéine cible peut être récupérée par centrifugation, évitant ainsi les interférences lipidiques. - Jetez soigneusement le supernatant en versant le tube vers le bas et en le posant sur un papier absorbant. Enregistrer la pastille pour l'étape suivante.
REMARQUE : Le granule peut être très difficile à voir, mais le tube doit être retourné même s'il n'est pas visible.
- Diluer le supernatant liposome avec de l'eau à un volume final de 1 ml contenant 5-100 g de protéines.
- Spectrophotométrie
- Suspendre le granule obtenu à partir de l'étape 2.2.4 dans 1 ml d'eau distillée. Mélanger soigneusement pour s'assurer que le granule est dissous et transférer l'échantillon dans un nouveau tube à essai.
- Préparer des dilutions des normes d'albumine (BSA) à un volume final de 1 ml.
REMARQUE : Les normes protéiques doivent être préparées entre 5 et 100 g/mL. - Ajouter 1 ml de réactif A aux tubes de l'étape 2.3.1 et 2.3.2 sans exception, bien mélanger, et couver pendant 10 min à RT.
REMARQUE : Le SDS peut soulager d'éventuelles interférences lipidiques tout en facilitant la solubilité des protéines. - Ajouter 0,5 ml de réactif B aux tubes de l'étape 2.3.1 et 2.3.2, bien mélanger, et couver pendant 30 min à RT tout en se protéger de la lumière.
REMARQUE : Le réactif au phénol Follin-Ciocalteu est un mélange de phosphomolybdate et de phosphotungstate utilisé pour les essais colorimétriques de certains composés contenant de l'azote, comme les protéines. La complexation du cuivre augmente la réactivité des phénols vers ce réactif, produisant un complexe bleu/violet selon la concentration en protéines. - Déterminer les absorptions à 750 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Calculez la concentration protéique dans le supernatant en fonction de la courbe standard comme suit.
- Valeur d'absorption de parcelle (Abs) contre concentration de BSA (mg/mL) pour obtenir le coefficient angulaire (k) considérant une ligne linéaire de tendance.
- Déterminer la concentration de protéines supernatants (C) par le rapport entre la valeur absorbante et le coefficient angulaire (k), puis multiplier par le volume total comme suit:
- Déterminer l'efficacité de l'encapsulation selon la formule suivante :
- où la protéine chargée 10 mg, protéine non encapsulée - valeur de C obtenue à l'étape 2.3.6.2.
REMARQUE: Dans ce cas, un total de 10 mg de tarin dissous dans la solution de sulfate d'ammonium (1 mg/mL) est utilisé pour effectuer la procédure d'encapsulation, puisque cette concentration est suffisante pour obtenir des effets in vitro satisfaisants13,16, 18.
3. Détermination de la taille et de la stabilité
REMARQUE : L'indice de distribution de taille et de polidispersity (PdI) des préparations liposomiques est évalué par diffusion dynamique de lumière (DLS). Un PdI proche de 0,1 indique une préparation homogène. Pour la détermination de la stabilité, entreposez les liposomes à 4 oC et vérifiez régulièrement la distribution et la taille de la taille.
- Allumez l'équipement DLS 30 min avant de l'utiliser pour réchauffer la lampe laser.
- Transférer la préparation liposomique obtenue à l'étape 1.10 dans une cuvette de dimensionnement jetable.
- Définir les paramètres de l'équipement comme suit : type de dispersant et eau (RI 1,33); matières matérielles et lipides (RI 1,45); et RT.
- Appuyez sur Commencez et attendez pendant que l'équipement termine sa lecture.
- Retirez la cuvette et éteignez l'équipement.
REMARQUE : Transférez l'échantillon de la cuvette vers le tube jetable de centrifugeuse de 15 mL pour des analyses ultérieures, ou jetez-le s'il y a une quantité suffisante pour de nouvelles lectures.
4. Caractérisation morphologique
REMARQUE: La caractérisation Liposome est effectuée selon Murtey et Ramasamy19. Les échantillons contenant des nanoliposomes obtenus à l'étape 1.10 sont préparés en triple.
- Fixer les couvercles en verre (13 mm de diamètre) au fond d'un plat Petri avec du ruban adhésif recto-verso. Couper le ruban en petits morceaux (taille appropriée pour fixer les couvercles), retirer le papier protecteur en dessous, et le fixer sur le fond du plat Petri. À l'aide d'une pince à épiler, retirer le papier protecteur sur le dessus de la bande et fixer les résilles.
REMARQUE : Soyez prudent dans les étapes suivantes pour ne pas libérer les couvertures, et utilisez un ruban adhésif solide. - Enrober les couvertures de poly-L-lysine. Placer les papiers filtres humides à l'intérieur du plat Petri pour maintenir l'humidité et incuber pendant 1 h à RT (25 oC).
- Après le revêtement, rincer les couvercles avec de l'eau distillée.
- Remplissez les couvertures avec une goutte de l'échantillon à partir de l'étape 1.10 et laissez-les sécher pendant 1 h à RT.
- Pour fixer les échantillons, couvrez-les de 4 % de glutaraldéhyde préparé dans un tampon de phosphate de 0,1 M, pH à 7,2. Placer les papiers filtres humides à l'intérieur du plat Petri et sceller le plat pour maintenir les niveaux d'humidité. Incuber à 4 oC pendant 48 h.
- Rincer les couvercles 3x pendant 5 min avec le même tampon de phosphate.
- Déshydrater les échantillons comme suit : 35 % d'éthanol 1x pour 15 min, 50 % d'éthanol 1x pour 15 min, 75 % d'éthanol 1x pour 15 min, 95 % d'éthanol 2x pour 15 min et éthanol absolu 3x pour 20 min.
- Sécher chimiquement les échantillons par immersion 2x dans 1/2 ml d'hexamethyldisilazane (HMDS) pendant 10 min.
REMARQUE : Le HMDS doit être manipulé avec soin à l'intérieur d'une hotte de fumée. Les échantillons doivent être laissés sécher toute la nuit à l'intérieur d'un dessiccateur ou à l'intérieur du capot de fumée à RT. - Monter les échantillons séchés sur un talon avec un ruban adhésif conducteur en carbone.
- Cracher la surface de la couverture dans un vide avec une couche conductrice électrique (20 nm d'épaisseur) d'or-palladium.
- Enregistrez les images à l'échographie au microscope électronique (SEM) en mode basse aspiration et sous basse tension (20 kV).
Representative Results
La figure 1 décrit la préparation nanoliposome16,20,21. Phospholipids, 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyéthyl glycol)-2000] (sel d'ammonium; DSPE-MPEG 2000), et le cholesterylhemisuccinate (CHEMS), les principaux constituants liposome, ont d'abord été dissous dans le chloroforme pour obtenir le film lipidique. Le film lipidique a ensuite été réhydraté dans la solution de sulfate d'ammonium contenant la protéine hydrophile (tarine) à piéger, et l'incubation a été effectuée pendant la nuit. Ensuite, des techniques de sonication et d'extrusion ont été appliquées pour générer de petites vésicules unilamellar. L'étape d'ultracentrifugation a séparé la préparation liposomique des lipides libres et de la protéine non encapsulée, alors que le supernatant a été employé pour la détermination de l'efficacité de piégeage.
Les nanoliposomes produits selon la méthodologie susmentionnée présentaient une distribution de taille allant de 51 à 396 nm et une taille moyenne de 155 nm (tableau2). La préparation a été homogène, puisque l'indice de polydispersity était de 0,168. Une efficacité de piégeage élevée de 83 % peut être atteinte si les liposomes sont extrudés par une membrane de taille de pores de 0,2 m (tableau 2).
Les caractéristiques des nanoliposomes morphologiques ont été évaluées par SEM. Figure 2A,B présente des vésicules liposomiques rondes de l'ordre de 121 nm et analysées à 20 kV, tandis que la figure 2C,D affiche des affichages insuffisamment préparés Échantillons. Les nanoliposomes ont simplement été séchés à l'air sans fixation préalable ou tout autre traitement décrit dans cette étude. En conséquence, des vésicules plus grandes et endommagées de l'ordre de 332 m et analysées à 5 kV ont été observées.
Figure 1 : Représentation schématique de la préparation des nanoliposomes. DOPE, PEG et CHEMS, les principaux constituants liposome, ont d'abord été dissous dans le chloroforme pour obtenir le film lipidique (1, 2, 3). Le film lipidique a ensuite été réhydraté dans un tampon salin contenant la protéine hydrophile (tarine) à piéger, et l'incubation a été effectuée pendant la nuit (4). Ensuite, des techniques de sonication et d'extrusion ont été appliquées pour générer des VUS (5, 6). L'étape d'ultracentrifugation séparait la préparation liposomique des lipides libres et des protéines non encapsulées, tandis que le supernatant était utilisé pour la détermination de l'efficacité du piégeage (7). Ce chiffre a été modifié à partir de Correa et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Photomicroscopie nanoliposome par SEM. (A,B) Images de vésicules liposomiques rondes de l'ordre de 121 nm et analysées à 20 kV. (C,D) Images d'échantillons mal préparés. Des échantillons mal traités ont permis l'observation de vésicules plus grandes et/ou endommagées, qui ne peuvent résister à des conditions de vide et/ou de tension à 5 kV. Ce chiffre a été modifié à partir de Correa et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Composants Liposome | Poids (g) | Concentration (mM) | Volume final |
| drogue | 0.0420 | 5.7 | 10 ml |
| MPEG 2000-DSPE | 0.1059 | 3.8 | |
| CHEMS (EN) | 0.0024 | 0.5 |
DOPE - 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine); MPEG 2000-DSPE - 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium); CHEMS - cholesterylhemisuccinate.
Tableau 1 : Préparation de nanocapsules liposomiques tarines.
| Taille des pores de membrane (m) | Distribution de taille (nm) | Taille moyenne (nm) | Indice de polydispersité (PdI) | Pic (nm) | Efficacité de piégeage |
| 0.2 | 51 - 396 | 155 | 0. 168 | 94 à 39 ans | 0.83 |
L'indice de taille et de polydispersity a été évalué par diffusion dynamique de lumière, tandis que l'efficacité d'encapsulation a été déterminée selon Peterson17.
Tableau 2 : Taille, indice de polidispersity, et efficacité de piégeage de la préparation de nanoliposome.
Discussion
Le protocole décrit ci-temps a été testé par Correa et coll.16 pour encapsuler la tarine, une lectine immunomodulatrice et antitumorale purifiée de Colocasia esculenta22. La méthodologie a donné des résultats réussis, permettant la production de nanoliposomes stables de taille appropriée pour des applications thérapeutiques. La formulation présente la libération contrôlée à différents niveaux de pH dans des conditions physiologiques. Il potentialise également les propriétés pharmacologiques de tarin, telles que l'inhibition du glioblastome humain U-87 MG et du cancer du sein MDA-MB-231 lignes cellulaires et la stimulation des cellules de moelle osseuse de souris. La préparation liposomique n'a montré aucun effet toxique dans les cellules saines de souris16.
La méthode classique, décrite pour la première fois par Bangham et al.7, permet la production de grandes vésicules multilamellar liposome, hétérogènes dans la taille et la forme. Les adaptations de cette méthode, telles que rapportées dans la présente étude, sont appliquées avec succès en incluant des étapes supplémentaires telles que la sonication et l'extrusion à travers une membrane de polycarbonate de 0,2 m. Cela permet la production d'une dispersion plus homogène en ce qui concerne la taille dans la gamme nanométrique16,23,24. Par conséquent, pour assurer des résultats réussis, le protocole d'encapsulation et la formulation liposomique décrite ici devraient être strictement suivis.
La composition nanoliposome a été soigneusement sélectionnée afin d'assurer la formation d'une membrane bicouche avec DOPE, MPEG 2000-DSPE, et CHEMS comme constituants principaux. Il s'agit de constituants naturels de la membrane animale et ces derniers peuvent conférer de fluidité à l'architecture nanoliposome, assurant une large application pour la livraison de composés bioactifs chez les êtres humains.
La pegylation nanoliposome est essentielle pour garantir la stabilité de la structure liposome. L'absence de PEG conduit à l'élargissement de taille, à un indice de polydispersity élevé, et à une faible efficacité de piégeage. Des résultats optimaux peuvent être obtenus avec DOPE comme principal composant liposome. Cependant, il s'agit d'un phospholipide coûteux. Les coûts financiers de la production de nanoliposomes peuvent être atteints en remplaçant DOPE par d'autres lipides similaires tels que DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). CHEMS est une molécule de cholestérol naturellement trouvée dans les membranes cellulaires animales, qui ne doit pas être exclue de la formulation, car il est important d'assurer la fluidité et la malléabilité des lipides bicouches16.
D'autres aspects du protocole d'encapsulation peuvent également être adaptés. Le chloroforme utilisé pour dissoudre les composants liposomiques peut facilement être remplacé par du méthanol sans effets sur la moyenne de taille, l'homogénéité et l'efficacité de piégeage. Cependant, certaines fuites de protéines peuvent se produire au stockage en dessous de 4 oC16. L'étape d'incubation de nuit avec la solution de sulfate d'ammonium contenant de la tarine n'est pas obligatoire; cependant, pour plus de commodité, il peut être effectué sans endommager les caractéristiques biophysiques nanoliposomiques, l'encapsulation, ou les pertes d'efficacité de stabilité, comme démontré par Correa et autres16. L'étape d'extrusion est effectuée à température ambiante, ce qui peut diminuer le débit entre les seringues si une membrane de taille de 0,1 m de pore est utilisée.
Pour surmonter ce problème, il faut envisager l'utilisation d'une membrane de taille pore de 0,2 m ou d'un chauffage du support extrudeur au-dessus de la température de transition lipidique. L'analyste doit faire attention à ne pas endommager les lipides ou les protéines qui peuvent être inactivés et perdre l'activité biologique. Alternativement, la préparation liposomique peut être dialysée contre HBS au lieu de l'ultracentrifugation, en utilisant une membrane de coupure en fonction du poids moléculaire des protéines. Le choix de la nature chimique du tampon dans lequel les nanoliposomes sont suspendus après l'ultracentrifugation est directement lié à son application ultérieure. Puisque les perspectives de cette étude incluent in vivo et in vitro des essais, la suspension dans la saline tamponnée de HEPES était suffisante pour assurer aucun effet cytotoxique et une gamme de pH proche des conditions physiologiques.
Les liposomes doivent être finement traités, semblables aux cellules vivantes, pour obtenir des images SEM de meilleure qualité. Les procédures de fixation et de séchage sont importantes pour assurer la visualisation de vésicules intactes plus petites qui supportent des valeurs supérieures à 20 kV dans des conditions de vide. Figure 2 A,B affiche des vésicules nanométriques compatibles avec la procédure d'extrusion. La visualisation des vésicules allant de 51-396 nm est possible si la préparation adéquate d'échantillon suivant cette procédure est exécutée. Les étapes comprennent la fixation, le séchage par l'augmentation des concentrations d'éthanol, et la déshydratation chimique pour éviter la formation d'agrégats et de vésicules rompues causées par le vide et le faisceau d'électrons. D'autre part, la figure 2C,D montre des vésicules liposome séchées sous la température ambiante et non soumises à aucun traitement décrit ici, ce qui signifie qu'elles ont été mal préparées. À la suite de la procédure inadéquate, des vésicules géantes sont formées, même après l'extrusion à travers une membrane de taille de 0,2 m pore. Des vésicules rompues sont également observées dans les deux panneaux en raison de dommages causés par le vide et le faisceau d'électrons.
Les vésicules nanoliposome ont été explorées comme système d'encapsulation et de livraison pour les molécules hydrophobes, y compris le resvératrol (3,5,4'-trihydroxystilbene), un composé bioactif contre les cellules cancéreuses colorectales. La procédure d'encapsulation peut surmonter la faible solubilité des composés lipophiles en plus de fournir la biocompatibilité, la biodégradabilité, la non-immunogénicité, et les caractéristiques de non-toxicité inhérentes aux nanocapsules liposome25. Les adaptations du protocole doivent être prises en considération en fonction de l'itinéraire administratif et de l'objectif, tels que le développement de nouvelles formulations liposome pour l'administration orale.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants envers les installations du COPPE/UFRJ, du Laboratoire de microscopie électronique et du Laboratoire de caractérisation des matériaux multiutilisateurs; au Dr Adalberto Vieyra, au Dr Jennifer Lowe et à Rafael Lindoso, professeurs à l'Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l'utilisation de l'ultracentrifuge; au Dr Alexandre Guedes Torres et Daniel Perrone, professeurs à l'Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l'utilisation de l'évaporateur rotatif; au professeur Roland Bodmeier et au Dr Andriy Dashevskiy de l'Université Freie de Berlin, qui ont aidé avec des ressources, fourni de nouvelles méthodologies et supervisé l'ACNTF au cours d'une bourse ErasmusMD de 6 mois en Allemagne; à Dr Rossana Thiré et Aline Fernandes, professeure et technicienne à l'Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l'utilisation du Zetasizer Malvern; à Bluma Guenther et Taissa Rodrigues, professeur et technicien à l'Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l'utilisation de la SEM; à la Dre Rachel Ann Hauser Davis, chercheuse à Fundaçao Oswaldo Cruz, pour la narration. Cette étude a été financée en partie par le Coordenaço de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nvel Superior, Brasil (CAPES) - Code des finances 001 (subvention no 1627392; 1811605); par Fundaçao Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (subvention No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 et E-26/202.860/2016); par Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient-fico e Tecnolàgico (CNPq) (subvention no 406601/2018-6), et Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
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