Optimierung, Design und Vermeidung von Fallstricken in der manuellen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie
Summary
Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine neue Technologie, die die Visualisierung mehrerer Zelltypen innerhalb intakten formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeermöglicht. Präsentiert werden Richtlinien zur Sicherstellung eines erfolgreichen 7-Farben-Multiplex mit Anweisungen zur Optimierung von Antikörpern und Reagenzien, zur Vorbereitung von Dias, Design und Tipps zur Vermeidung von häufigauftretenden Problemen.
Abstract
Die Mikroumweltbewertung von intaktem Gewebe zur Analyse der Zellinfiltration und räumlichen Organisation ist für das Verständnis der Komplexität von Krankheitsprozessen von entscheidender Bedeutung. Zu den in der Vergangenheit verwendeten Prinziptechniken gehören Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF), die die Visualisierung von Zellen als Momentaufnahme in der Zeit mit 1 bis 4 Markern ermöglichen. Beide Techniken weisen Mängel auf, darunter Schwierigkeiten bei der Färbung schlecht anogener Ziele und Einschränkungen im Zusammenhang mit der artenübergreifenden Reaktivität. IHC ist zuverlässig und reproduzierbar, aber die Art der Chemie und die Abhängigkeit vom sichtbaren Lichtspektrum ermöglicht nur wenige Marker und macht die Kolokalisierung schwierig. Die Verwendung von IF erweitert potenzielle Marker, beruht aber aufgrund der umfangreichen Gewebe-Autofluoreszenz nach formaler Fixierung in der Regel auf gefrorenes Gewebe. Durchflusszytometrie, eine Technik, die die gleichzeitige Etikettierung mehrerer Epitope ermöglicht, beseitigt viele der Mängel von IF und IHC, jedoch verliert die Notwendigkeit, Zellen als einzelzellige Suspension zu untersuchen, den räumlichen Kontext von Zellen, die wichtige biologische Beziehungen. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) überbrückt diese Technologien, die eine multiepitopzelluläre Phänotypisierung in formalin fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe ermöglichen und gleichzeitig die gesamte Mikroumgebungsarchitektur und die räumliche Beziehung der Zellen innerhalb intakten, ungestörten Gewebes. Fluorophore mit hoher fluoreszierender Intensität, die kovalent mit dem Gewebeepitop verbunden sind, ermöglichen mehrere Anwendungen primärer Antikörper, ohne sich um eine artspezifische Kreuzreaktivität durch sekundäre Antikörper zu kümmern. Obwohl sich diese Technologie als zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten erwiesen hat, kann der Prozess der Erstellung einer nützlichen mfIHC-Färbestrategie aufgrund umfangreicher Optimierung und Design zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Um robuste Bilder zu erstellen, die genaue zelluläre Interaktionen vor Ort darstellen, und um den Optimierungszeitraum für die manuelle Analyse zu mildern, werden hier Methoden zur Folienvorbereitung, Optimierung von Antikörpern, Multiplex-Design sowie Fehler vorgestellt. häufig während des Färbevorgangs auftreten.
Introduction
Die Visualisierung einer intakten Tumormikroumgebung (TME) ist wichtig, um nicht nur die zelluläre Infiltration bei festen Malignomen, sondern auch bei Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu bewerten. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) hat sich als wirksames Werkzeug für Multi-Antigen-Phänotypisierung von Zellen in der Untersuchung von Krebs und assoziierten Krankheiten1,2,3,4, 5,6,7. Dies ermöglicht in Kombination mit neuartigen Software und Programmen zur Analyse großer Datensätze die Beobachtung komplexer Interaktionen zwischen den Zellen1,2,4. Der Ratenbegrenzungsfaktor bei der Datenerfassung ist oft die Qualität des gebeizten Gewebes vor der Analyse.
Frühere Techniken, die zur Phänotyp-Zelle in der TME verwendet wurden, umfassen Immunhistochemie (IHC), Immunfluoreszenz (IF) und Durchflusszytometrie, die alle signifikante Einschränkungen aufweisen. IHC verwendet formalin fixiertes Paraffin eingebettet (FFPE) Gewebeabschnitte, die deparaffiniert und rehydriert werden, bevor sie von den meisten von einem Antikörper gefärbt werden. Die Verwendung eines meerrettichperoxidase (HRP) gebundenen Sekundärantikörpers und einer chemischen Reaktion ermöglicht die Visualisierung eines einzelnen antigenen Epitops8. Während IHC zuverlässig ist und auf FFPE-Gewebe durchgeführt wird, das einfach zu arbeiten ist, bedeutet die Begrenzung des sichtbaren Lichtspektrums, dass nur ein oder zwei Marker zuverlässig unterschieden und die Kolokalisierung von Antigenen ziemlich schwierig ist8. Eine Möglichkeit, verfügbare Marker und damit Antigene zu erweitern, die auf einem einzigen Abschnitt untersucht werden können, besteht darin, auf Fluoreszenz umzustellen, was die Verwendung eines breiteren Spektrums des visuellen Spektrums ermöglicht. Für IF wird gefrorenes oder FFPE-Gewebe auf Dias und Antikörper übertragen, die zu verschiedenen Fluorophoren konjugiert sind. Während dies die Anzahl der Antigene erhöht, die untersucht werden können, Gibt es mehrere wichtige Einschränkungen. Erstens, da jeder Antikörper in der Regel nur ein Fluorophor befestigt hat, ist die Helligkeit oft nicht stark genug, um die Gewebeautofluoreszenz zu überwinden. Es ist aus diesem Grund, die meisten IF wird auf gefrorenem Gewebe durchgeführt, die teuer zu lagern und schwierig zu arbeiten ist. Eine begrenzte Anzahl von fluoreszierenden Tags steht aufgrund von Spektralüberlappungen und artenübergreifender Reaktivität zur Verfügung, insbesondere wenn nicht konjugierte Antikörper verwendet werden. Die Durchflusszytometrie, die aus der Verarbeitung von frischem Gewebe zu einer Einzelzellsuspension und der Etikettierung mit fluoreszierenden Antikörpern besteht, ist seit Jahrzehnten der Goldstandard für Dieimmunphenotypisierung9,10. Ein Vorteil der Durchflusszytometrie ist die Fähigkeit, mehrere Antikörper ohne Sorge um die Kreuzreaktivität der Arten zu kennzeichnen, da die meisten konjugiert sind. Da die Zellen von einer Maschine “visualisiert” werden und nicht von menschlichen Augen, gibt es viel mehr Fluorophore zur Verfügung, aber dies hat seinen Preis. Die Kompensation muss manuell erfolgen, was die Ergebnisse, die zu falschen positiven und negativen Populationen führen, erheblich verändern kann. Die bedeutendste Einschränkung der Durchflusszytometrie ist, dass die Gewebearchitektur und anschließend alle räumlichen Informationen durch die Notwendigkeit der Suspension einzelner Zellen verloren gehen.
Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit neuartiger Software kombiniert die Vorteile der IHC-, IF- und Durchflusszytometrie, indem multiantigene Gewebefärbung mit Signalverstärkung und Beibehaltung räumlicher Beziehungen ohne Entschädigung. FFPE-Gewebe wird auf geladenen Dias platziert, die nach dem Antigen-Retrieval eine Runde primärer Antikörperanwendung auf das Zielantigen von Interesse durchlaufen, gefolgt von einem sekundären Antikörper mit einem HRP-Chemikalien-Tag, ähnlich wie IHC. Nach der Platzierung des sekundären Antikörpers führt eine HRP-spezifische Reaktion zu einem Fluorophor, das kovalent an das Epitop von Interesse bindet11. Sobald das Gewebe beschriftet ist, wird eine weitere Runde der Erwärmung der Dias abgeschlossen, um den zuvor angewendeten primären und sekundären Antikörperkomplex zu entfernen, so dass nur das fluoreszierende Tag an das Gewebeepitop11gebunden ist. Dies ermöglicht die wiederanwendung von mehreren Antikörpern jeder Art ohne Bedenken bei der Kreuzreaktivität11,12. Um jeglichen Bedarf an manueller Kompensation mehrerer fluoreszierender Farbstoffe zu minimieren, wird eine Ansammlung von Fluorophoren mit geringer spektraler Überlappung einschließlich eines nuklearen Zählerflecks verwendet, um den mfIHC zu vervollständigen. Um die Mitfluoreszenz mit FFPE-Gewebe zu berücksichtigen, subtrahiert die Software die Autofluoreszenz vom endgültigen Bild mit einem Bild von einem leeren Dia, was aufgrund der Stärke der antigenspezifischen Fluoreszenz nach Fluorophor möglich ist. Signalverstärkung. Mit neuartigen Programmen, die für große Datensätze entwickelt wurden, können Zellpositionen identifiziert und für den räumlichen Kontext1,2,4analysiert werden. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist die Optimierungszeit. Eine detaillierte Methodik mit Anleitungen für experimentelles Design und Färbe- und Bildgebungsstrategie finden Sie hier. mfIHC wird für Laboratorien nützlich sein, die derzeit nicht über ein optimiertes automatisiertes Färbesystem verfügen, das den räumlichen Kontext von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen in intaktem FFPE-Gewebe mit der manuellen Technik besser verstehen möchte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intakte Gewebeproben aus der soliden Tumorbiopsie und der chirurgischen Resektion bleiben wichtige diagnostische und prädiktive Werkzeuge für die Krankheitsanalyse sowie patientenprognose. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) ist eine neuartige Technik, die die Vorteile der Immunhistochemie (IHC), der Immunfluoreszenz (IF) und der Durchflusszytometrie kombiniert. Frühere Methoden zur Untersuchung von Zellen vor Ort haben die Auswertung der Zell-zu-Zell-Anordnungen in einer Gewebeumgebung<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Ed Stack, zuvor von Perkin Elmer, für seine Unterstützung bei der Einrichtung und Optimierung der originalen Multiplexfärbung. Die Autoren danken auch Kristen Schmidt von Akoya Biosciences für Tipps mit der Analysesoftware. Die in dieser Publikation berichteten Forschungsergebnisse wurden von den National Cancer Institutes of Health unter der Award-Nummer P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Weitere Unterstützung wurde von Jeffery A. Colby Colon Cancer und Tom Liu Memorial Research Funds geleistet.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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