Otimização, design e evitando armadilhas em manual multiplex fluorescente imuno-histoquímica

Summary

Multiplex fluorescente imunoistoquímica é uma tecnologia emergente que permite a visualização de vários tipos de células dentro de formalina intacta-fixo, parafina incorporado (FFPE) tecido. Apresentados são diretrizes para garantir um multiplex de 7 cores bem sucedido com instruções para otimizar anticorpos e reagentes, preparando slides, design e dicas para evitar problemas comuns.

Abstract

A avaliação do microambiente do tecido intacto para análise da infiltração celular e da organização espacial é essencial para a compreensão da complexidade dos processos da doença. As técnicas do princípio usadas no passado incluem immunohistochemistry (IHC) e imunofluorescência (se) que permitem o visualização das pilhas como um instantâneo a tempo usando entre 1 e 4 marcadores. Ambas as técnicas têm deficiências, incluindo dificuldade em manchar alvos pouco antigênicos e limitações relacionadas à reatividade entre espécies. IHC é confiável e reprodutível, mas a natureza da química e dependência do espectro de luz visível permite que apenas alguns marcadores para ser usado e faz colocalização desafiador. O uso de IF amplia os marcadores potenciais, mas tipicamente depende do tecido congelado devido à extensa autofluorescência tecidual após fixação de formalina. A citometria de fluxo, uma técnica que permite a rotulagem simultânea de múltiplos Epitopes, AB roga muitas das deficiências de If e de IHC, entretanto, a necessidade de examinar pilhas como uma única suspensão da pilha perde o contexto espacial das pilhas que descartam importante biológico Relações. Multiplex fluorescente imunoistoquímica (mfIHC) pontes estas tecnologias permitindo multi-epitope fenotipagem celular em formalina fixa parafina incorporado (FFPE) tecido, preservando a arquitetura global do microambiente e espacial relação de células dentro do tecido intacto ininterrompido. Os fluoróforos fluorescentes elevados da intensidade que lig covalentemente ao epítopo mapeado do tecido permitem aplicações múltiplas de anticorpos preliminares sem preocupação da Cruz-reactividade específica da espécie por anticorpos secundários. Embora esta tecnologia tenha sido comprovada para produzir imagens confiáveis e precisas para o estudo da doença, o processo de criação de uma estratégia de coloração útil mfIHC pode ser demorado e exigente devido à extensa otimização e design. Para fazer imagens robustas que representem interações celulares precisas in situ e para mitigar o período de otimização para a análise manual, apresentamos aqui métodos para preparação de slides, otimização de anticorpos, design multiplex, bem como erros comumente encontrados durante o processo de coloração.

Introduction

O visualização de um microambiente intacto do tumor (TME) é essencial em avaliar não somente a infiltração celular em malignidades contínuas mas a pilha às interações da pilha também. O multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfihc) emergiu como uma ferramenta eficaz para o fenotipagem do multi-antígeno das pilhas no estudo do cancro e das doenças associadas^{1,2,3,4, 5,6,7}. Isso, em combinação com novos softwares e programas projetados para analisar grandes conjuntos de dados, possibilita a observação de interações complexas entre as células^1,2,4. O fator limitante da taxa na aquisição de dados é muitas vezes a qualidade do tecido manchado antes da análise.

As técnicas precedentes usadas às pilhas do phenotype no TME incluem immunohistochemistry (IHC), imunofluorescência (se) e citometria do fluxo todos que apresentam limitações significativas. IHC usa a parafina fixa do formalina encaixou seções do tecido (FFPE) que são desparaffinized e rehidratado antes de ser manchada por a maioria frequentemente de um anticorpo. O uso de um anticorpo secundário encadernado de peroxidase de rábano (HRP) e uma reação química permite a visualização de um único epítopo antigênico⁸. Quando IHC for de confiança e executado no tecido de FFPE que é fácil de trabalhar com, as limitações ao espectro claro visível significam que somente um ou dois marcadores podem ser ilustres de confiança e colocalization dos antígenos completamente difíceis⁸. Uma maneira de expandir os marcadores disponíveis e, portanto, antígenos que podem ser sonados em uma única seção é mudar para a fluorescência que permite o uso de uma gama mais ampla do espectro visual. Para se, o tecido congelado ou de FFPE é transferido nas corrediças e nos anticorpos usados que são conjugados aos vários Fluorophores. Enquanto isso aumenta o número de antígenos que podem ser sonados, existem várias limitações importantes. Primeiramente, porque cada anticorpo tem tipicamente somente um fluoróforo Unido, o brilho é frequentemente não forte bastante superar o autofluorescence do tecido. É por esta razão, a maioria se é realizada em tecido congelado que é caro para armazenar e difícil de trabalhar. Um número limitado de etiquetas fluorescentes está disponível para o uso devido à sobreposição espectral e à reactividade transversal da espécie particularmente quando os anticorpos non-conjugated são usados. A citometria de fluxo, que consiste em processamento de tecido fresco em uma única suspensão celular e rotulagem com anticorpos fluorescentes tem sido o padrão-ouro para imunofenotipagem por décadas^9,10. Um benefício da citometria de fluxo é a capacidade de rotular múltiplos anticorpos sem preocupação com a reatividade cruzada das espécies, pois a maioria é conjugada. Porque as células são “visualizadas” por uma máquina e não olhos humanos, há muito mais fluoróforos disponíveis, mas isso vem com um custo. A compensação deve ser feita manualmente, o que pode alterar significativamente os resultados produzindo falsas populações positivas e negativas. A limitação a mais significativa da citometria do fluxo é que a arquitetura do tecido e subseqüentemente toda a informação espacial é perdida pela necessidade para a única suspensão das pilhas.

Immunohistochemistry fluorescente Multiplex (mfihc) usando um microscópio fluorescente automatizado em combinação com o software novo combina os benefícios de IHC, de se e de citometria do fluxo permitindo o tecido do multi-antígeno que mancha com amplificação do sinal e retenção de relacionamentos espaciais sem a necessidade de compensação. O tecido de FFPE é coloc em corrediças carregadas que, após a recuperação do antígeno, submete-se a uma rodada da aplicação preliminar do anticorpo ao antígeno do alvo do interesse seguido por um anticorpo secundário com um tag químico de HRP, similar ao IHC. Após a colocação do anticorpo secundário, uma reação específica de HRP conduz a uma ligação covalentemente do fluoróforo ao epítopo de interesse¹¹. Uma vez que o tecido é rotulado, outra rodada de aquecimento das lâminas é concluída removendo o complexo de anticorpos primários e secundários previamente aplicados deixando apenas a marca fluorescente ligada ao epítopo do tecido¹¹. Isso permite que múltiplos anticorpos de qualquer espécie sejam reaplicados sem preocupação com a reatividade cruzada^11,12. Para minimizar toda a necessidade para a compensação manual de tinturas fluorescentes múltiplas, uma coleção dos fluoróforos com pouca sobreposição espectral que inclui uma mancha contrária nuclear é usada para terminar o mfihc. Para dar conta da autofluorescência encontrada com o tecido FFPE, o software subtrai a autofluorescência da imagem final usando uma imagem de um slide em branco que é possível devido à resistência da fluorescência específica do antígeno após fluoróforo amplificação do sinal. Usando novos programas projetados para grandes conjuntos de dados, os locais das células podem ser identificados e analisados para o contexto espacial^1,2,4. A limitação mais significativa dessa técnica é o tempo de otimização. Uma metodologia detalhada com instruções para o projeto experimental e A coloração e a estratégia da imagem latente são encontradas aqui. o mfIHC será útil para laboratórios que atualmente não possuem um sistema de coloração automatizado otimizado que gostaria de entender melhor o contexto espacial das interações célula a célula no tecido de FFPE intacto usando a técnica manual.

Protocol

Todo o trabalho foi aprovado pelo Conselho de revisão interno da Universidade de Michigan. 1. otimizando os anticorpos primários e a preparação de slides Determine a concentração ideal de anticorpos para multiplex usando o IHC convencional. Teste os anticorpos para o multiplex pelo immunohistochemistry convencional manual (IHC)13. Use tecidos específicos que têm um tipo abundante da pilha para cada anticorpo testado tal como o uso do t…

Representative Results

O processo geral de obtenção de um ensaio multiplex de 7 cores segue um padrão repetitivo. A Figura 1 descreve o processo em um formulário diagramático. Uma vez que os slides são cortados e secos ou são recebidos do laboratório e cozido em um forno de hibridação a 60 ° c para 1 h, em seguida, proceder à desparaffinização e reidratação, fixar as lâminas em formalina novamente seguido pela recuperação do antígeno. Cada rodada de multiplexação começa na recuperação do a…

Discussion

Os espécimes intactos do tecido da biópsia contínua do tumor e do resection cirúrgico permanecem ferramentas diagnósticas e preditivas importantes para a análise da doença assim como o prognóstico paciente. Multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfIHC) é uma técnica nova que combine os benefícios do immunohistochemistry (IHC), da imunofluorescência (se) e do fluxo cytometry. Métodos prévios para sondar as células in situ permitiram a avaliação de arranjos célula a célula em um ambiente tecidual<s…

Materials

100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL