Summary
Multiplex fluorescente imunoistoquímica é uma tecnologia emergente que permite a visualização de vários tipos de células dentro de formalina intacta-fixo, parafina incorporado (FFPE) tecido. Apresentados são diretrizes para garantir um multiplex de 7 cores bem sucedido com instruções para otimizar anticorpos e reagentes, preparando slides, design e dicas para evitar problemas comuns.
Abstract
A avaliação do microambiente do tecido intacto para análise da infiltração celular e da organização espacial é essencial para a compreensão da complexidade dos processos da doença. As técnicas do princípio usadas no passado incluem immunohistochemistry (IHC) e imunofluorescência (se) que permitem o visualização das pilhas como um instantâneo a tempo usando entre 1 e 4 marcadores. Ambas as técnicas têm deficiências, incluindo dificuldade em manchar alvos pouco antigênicos e limitações relacionadas à reatividade entre espécies. IHC é confiável e reprodutível, mas a natureza da química e dependência do espectro de luz visível permite que apenas alguns marcadores para ser usado e faz colocalização desafiador. O uso de IF amplia os marcadores potenciais, mas tipicamente depende do tecido congelado devido à extensa autofluorescência tecidual após fixação de formalina. A citometria de fluxo, uma técnica que permite a rotulagem simultânea de múltiplos Epitopes, AB roga muitas das deficiências de If e de IHC, entretanto, a necessidade de examinar pilhas como uma única suspensão da pilha perde o contexto espacial das pilhas que descartam importante biológico Relações. Multiplex fluorescente imunoistoquímica (mfIHC) pontes estas tecnologias permitindo multi-epitope fenotipagem celular em formalina fixa parafina incorporado (FFPE) tecido, preservando a arquitetura global do microambiente e espacial relação de células dentro do tecido intacto ininterrompido. Os fluoróforos fluorescentes elevados da intensidade que lig covalentemente ao epítopo mapeado do tecido permitem aplicações múltiplas de anticorpos preliminares sem preocupação da Cruz-reactividade específica da espécie por anticorpos secundários. Embora esta tecnologia tenha sido comprovada para produzir imagens confiáveis e precisas para o estudo da doença, o processo de criação de uma estratégia de coloração útil mfIHC pode ser demorado e exigente devido à extensa otimização e design. Para fazer imagens robustas que representem interações celulares precisas in situ e para mitigar o período de otimização para a análise manual, apresentamos aqui métodos para preparação de slides, otimização de anticorpos, design multiplex, bem como erros comumente encontrados durante o processo de coloração.
Introduction
O visualização de um microambiente intacto do tumor (TME) é essencial em avaliar não somente a infiltração celular em malignidades contínuas mas a pilha às interações da pilha também. O multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfihc) emergiu como uma ferramenta eficaz para o fenotipagem do multi-antígeno das pilhas no estudo do cancro e das doenças associadas1,2,3,4, 5,6,7. Isso, em combinação com novos softwares e programas projetados para analisar grandes conjuntos de dados, possibilita a observação de interações complexas entre as células1,2,4. O fator limitante da taxa na aquisição de dados é muitas vezes a qualidade do tecido manchado antes da análise.
As técnicas precedentes usadas às pilhas do phenotype no TME incluem immunohistochemistry (IHC), imunofluorescência (se) e citometria do fluxo todos que apresentam limitações significativas. IHC usa a parafina fixa do formalina encaixou seções do tecido (FFPE) que são desparaffinized e rehidratado antes de ser manchada por a maioria frequentemente de um anticorpo. O uso de um anticorpo secundário encadernado de peroxidase de rábano (HRP) e uma reação química permite a visualização de um único epítopo antigênico8. Quando IHC for de confiança e executado no tecido de FFPE que é fácil de trabalhar com, as limitações ao espectro claro visível significam que somente um ou dois marcadores podem ser ilustres de confiança e colocalization dos antígenos completamente difíceis8. Uma maneira de expandir os marcadores disponíveis e, portanto, antígenos que podem ser sonados em uma única seção é mudar para a fluorescência que permite o uso de uma gama mais ampla do espectro visual. Para se, o tecido congelado ou de FFPE é transferido nas corrediças e nos anticorpos usados que são conjugados aos vários Fluorophores. Enquanto isso aumenta o número de antígenos que podem ser sonados, existem várias limitações importantes. Primeiramente, porque cada anticorpo tem tipicamente somente um fluoróforo Unido, o brilho é frequentemente não forte bastante superar o autofluorescence do tecido. É por esta razão, a maioria se é realizada em tecido congelado que é caro para armazenar e difícil de trabalhar. Um número limitado de etiquetas fluorescentes está disponível para o uso devido à sobreposição espectral e à reactividade transversal da espécie particularmente quando os anticorpos non-conjugated são usados. A citometria de fluxo, que consiste em processamento de tecido fresco em uma única suspensão celular e rotulagem com anticorpos fluorescentes tem sido o padrão-ouro para imunofenotipagem por décadas9,10. Um benefício da citometria de fluxo é a capacidade de rotular múltiplos anticorpos sem preocupação com a reatividade cruzada das espécies, pois a maioria é conjugada. Porque as células são "visualizadas" por uma máquina e não olhos humanos, há muito mais fluoróforos disponíveis, mas isso vem com um custo. A compensação deve ser feita manualmente, o que pode alterar significativamente os resultados produzindo falsas populações positivas e negativas. A limitação a mais significativa da citometria do fluxo é que a arquitetura do tecido e subseqüentemente toda a informação espacial é perdida pela necessidade para a única suspensão das pilhas.
Immunohistochemistry fluorescente Multiplex (mfihc) usando um microscópio fluorescente automatizado em combinação com o software novo combina os benefícios de IHC, de se e de citometria do fluxo permitindo o tecido do multi-antígeno que mancha com amplificação do sinal e retenção de relacionamentos espaciais sem a necessidade de compensação. O tecido de FFPE é coloc em corrediças carregadas que, após a recuperação do antígeno, submete-se a uma rodada da aplicação preliminar do anticorpo ao antígeno do alvo do interesse seguido por um anticorpo secundário com um tag químico de HRP, similar ao IHC. Após a colocação do anticorpo secundário, uma reação específica de HRP conduz a uma ligação covalentemente do fluoróforo ao epítopo de interesse11. Uma vez que o tecido é rotulado, outra rodada de aquecimento das lâminas é concluída removendo o complexo de anticorpos primários e secundários previamente aplicados deixando apenas a marca fluorescente ligada ao epítopo do tecido11. Isso permite que múltiplos anticorpos de qualquer espécie sejam reaplicados sem preocupação com a reatividade cruzada11,12. Para minimizar toda a necessidade para a compensação manual de tinturas fluorescentes múltiplas, uma coleção dos fluoróforos com pouca sobreposição espectral que inclui uma mancha contrária nuclear é usada para terminar o mfihc. Para dar conta da autofluorescência encontrada com o tecido FFPE, o software subtrai a autofluorescência da imagem final usando uma imagem de um slide em branco que é possível devido à resistência da fluorescência específica do antígeno após fluoróforo amplificação do sinal. Usando novos programas projetados para grandes conjuntos de dados, os locais das células podem ser identificados e analisados para o contexto espacial1,2,4. A limitação mais significativa dessa técnica é o tempo de otimização. Uma metodologia detalhada com instruções para o projeto experimental e A coloração e a estratégia da imagem latente são encontradas aqui. o mfIHC será útil para laboratórios que atualmente não possuem um sistema de coloração automatizado otimizado que gostaria de entender melhor o contexto espacial das interações célula a célula no tecido de FFPE intacto usando a técnica manual.
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Protocol
Todo o trabalho foi aprovado pelo Conselho de revisão interno da Universidade de Michigan.
1. otimizando os anticorpos primários e a preparação de slides
- Determine a concentração ideal de anticorpos para multiplex usando o IHC convencional.
- Teste os anticorpos para o multiplex pelo immunohistochemistry convencional manual (IHC)13.
- Use tecidos específicos que têm um tipo abundante da pilha para cada anticorpo testado tal como o uso do tecido da amígdala para o teste do anticorpo CD3.
- Use a concentração de referência para o IHC recomendado pela empresa e, em seguida, complete o IHC com concentrações de anticorpos nas concentrações recomendadas, bem como concentrações acima e abaixo da concentração recomendada.
- Prepare o tecido de parafina fixa em formalina para lâminas.
- Usando um micrótomo, corte blocos de tecido FFPE a uma espessura entre 4 e 6 μm e aplicar a slides carregados.
Nota: a utilização de água destilada assegura a correcta montagem e aderência do tecido em todo o multiplex. - Coloque as lâminas planas, lado do tecido para cima, e deixe secar a 37 ° c durante a noite.
- Armazene slides em uma caixa de slides longe da temperatura extrema até estar pronto para completar o multiplex.
- Usando um micrótomo, corte blocos de tecido FFPE a uma espessura entre 4 e 6 μm e aplicar a slides carregados.
2. método de coloração geral
- Preparação de soluções de lavagem e de extração de antígenos
- Prepare a solução de lavagem de 0,1% TBST misturando 9 L de água desionizada, 1 L de soro fisiológico tamponado com tris (TBS) e 10 mL de polissorbato 20.
- Prepare ambas as soluções de recuperação de antígeno (pH 6 e pH 9; Tabela de materiais) diluindo a 1x com água deionizada.
- Desparaffinização e reidratação
- Cozer corrediças, deitado horizontalmente, lado do tecido acima em 60 ° c para 1 h em um forno da hibridação1. Retire os slides do forno e deixe esfriar por pelo menos 5 − 10 min e depois coloque em um rack de slides vertical.
- Trate os slides nas seguintes soluções sequencialmente: xileno em triplicado, seguido por um único tratamento de 100% de etanol, 95% de etanol e, por último, 70% de etanol por 10 min cada um usando um conjunto de coloração de slides1.
- Lave a cremalheira das corrediças por 2 minutos com água deionizada pela submersão em uma caixa plástica da corrediça seguida pela fixação pela submersão em uma caixa plástica da corrediça enchida com o formalina tamponado neutro por 30 minutos13. Lave as lâminas em água deionizada por 2 min e depois prossiga para a recuperação do antígeno.
- Recuperação do antígeno
- Coloque o rack de slides em uma caixa resistente ao calor preenchida para a linha interna (aproximadamente 300 mL) com pH 6 ou pH 9 buffer de recuperação de antígeno.
Nota: o tampão da recuperação do antígeno pode ser pH 6 ou pH 9 que pode precisar de ser aperfeiçoado por o epítopo. No entanto, comece usando pH 9 para anticorpos que se ligam a resumos nucleares e pH 6 para todos os outros anticorpos. - Cubra a caixa com o envoltório plástico e use uma faixa de borracha para fixar. Coloque a caixa no microondas na borda da placa rotativa (microondas deve ser equipado com tecnologia de inversor para aquecimento mesmo). Aqueça as lâminas para 45 s a 100% de potência seguida de 15 min a 20% de potência13.
Nota: o tratamento com microondas pode necessitar de optimização dependendo do microondas utilizado. - Deixe os slides esfriar por aproximadamente 15 − 20 min.
- Coloque o rack de slides em uma caixa resistente ao calor preenchida para a linha interna (aproximadamente 300 mL) com pH 6 ou pH 9 buffer de recuperação de antígeno.
- Prepare soluções de trabalho de anticorpos e fluoróforos enquanto desliza fresco.
- Prepare o diluente primário de anticorpos dissolvendo 0,5 g de grânulos de albumina sérica bovina em 50 mL de TBST. Alternativamente, use 50 mL de 1x fosfato tampão salina (PBS) para dissolver os grânulos.
- Torne cada solução de trabalho de anticorpo primário para a concentração otimizada determinada na seção 1, no diluente de anticorpo primário. Estimar aproximadamente 200 μL por slide.
- Prepare a solução de trabalho do fluoróforo diluindo cada fluoróforo no solvente do fluoróforo em uma concentração de 1:100.
Nota: isto pode necessitar de ser optimizado dependendo do anticorpo. Estimar aproximadamente 100 μL por slide. - No último dia de coloração, prepare a solução de trabalho 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) adicionando 3 gotas de DAPI em 1 mL de TBST.
- Coloração da corrediça (lavagem e bloqueio)
- Retire a caixa do microondas após o resfriamento e retire o envoltório de plástico, lave as lâminas com água deionizada por 2 min seguido por uma lavagem de 2 min em uma caixa de slides de plástico preenchido TBST13.
- Depois de secar cada slide em torno do tecido com uma tarefa delicada limpe cuidado para não deixar o tecido secar, traço em torno do exterior do tecido usando uma barreira hidrofóbica caneta. Não toque no tecido com a delicada tarefa de limpeza ou caneta.
- Coloc cada corrediça na câmara humidificada e adicione a solução de obstrução (aproximadamente 4 gotas) ao tecido. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente (RT).
- Coloração da corrediça (aplicação preliminar do anticorpo)
- Pegue cada slide e remova a solução de bloqueio tocando no lado do slide em uma pilha de toalhas de papel e usando uma tarefa delicada limpe para remover o excesso de agente de bloqueio de todo o tecido.
- Coloque o slide de volta na câmara humidificada e adicione aproximadamente 200 μL do anticorpo primário de trabalho. Incubar na câmara humidificada durante 1 h na RT.
- Lave com TBST por 2 min por submersão em triplicado13.
Nota: após cada etapa de lavagem, a mudança do TBST ajudará a garantir uma imagem mais limpa.
- Coloração da corrediça (aplicação secundária do anticorpo)
- DAB fora do TBST restante de cada corrediça e aplique aproximadamente 3 a 4 gotas do anticorpo secundário (mistura de anticorpos conjugados secundários da HRP do coelho e do rato). Incubar por 10 min na câmara umidificada na RT13.
Nota: se planear usar um anticorpo preliminar que exija um anticorpo secundário à excepção do rato ou do coelho ou de escolher usar um anticorpo secundário alternativo, aplique o conjugado apropriado HRP secundário às corrediças e incubar em RT para 45 min. otimização de o tempo de incubação pode ser necessário para o secundário alternativo14. - Após a incubação, lave com TBST durante 2 min em triplicado13.
- DAB fora do TBST restante de cada corrediça e aplique aproximadamente 3 a 4 gotas do anticorpo secundário (mistura de anticorpos conjugados secundários da HRP do coelho e do rato). Incubar por 10 min na câmara umidificada na RT13.
- Mancha da corrediça (aplicação do fluorophore)
- Aplique aproximadamente 100 μL da solução de trabalho do fluoróforo e incubar na câmara humidificada em RT por 10 min13.
- Lave com TBST durante 2 min em triplicado13.
- Remoção de anticorpos
- Corrediças da microonda (45 s em 100% então 15 minutos em 20%) na caixa resistente ao calor (ver passo 2.3.2) para a remoção de anticorpos13,14.
Observação: isso conclui uma rodada do multiplex. Este é o único ponto em que o protocolo pode ser pausado. Para pausar o protocolo, deixe os slides submersos no buffer de recuperação do antígeno durante a noite à temperatura ambiente.
- Corrediças da microonda (45 s em 100% então 15 minutos em 20%) na caixa resistente ao calor (ver passo 2.3.2) para a remoção de anticorpos13,14.
- Continuar rodadas adicionais de coloração. Repita etapas 2.5.1 − 2.9.1 para o descanso dos pares do anticorpo-fluorophore. Uma vez utilizados todos os anticorpos e fluoróforos, proceder à secção 2,11.
- Aplicação DAPI e montagem
- Após a última rodada de coloração no multiplex, retire a última aplicação de anticorpos com solução de recuperação de antígeno pH 613. Lave com água desionizada seguida de TBST durante 2 min cada13.
- Aplique aproximadamente 150 μL da solução DAPI de trabalho a lâminas e incubar na câmara humidificada durante 10 min em RT1.
- Lave com TBST por aproximadamente 30 s e monte os COVERSLIP com um MOUNTANT do Antifade. Aplique o lustrador de unha desobstruído nos quatro cantos do lamela uma vez que a mídia de montagem secou para fixar o lamela (opcional).
3. detalhes para a biblioteca, monoplexes, e Multiplex
- Escolha slides para a construção de uma biblioteca de fluoróforo.
- Para uma 7-cor multiplex reunir 7 células imunes de tecido rico slides (ou seja, tonsila, baço, etc.) para a biblioteca.
Nota: escolha os slides de controle a serem usados para uma biblioteca de fluoróforo com cada slide representando cada fluoróforo exclusivo que será usado no multiplex. As corrediças de controle devem ter um epítopo abundante da escolha e podem ser o mesmo tipo de tecido para cada fluorophore.
- Para uma 7-cor multiplex reunir 7 células imunes de tecido rico slides (ou seja, tonsila, baço, etc.) para a biblioteca.
- A mancha e a biblioteca de imagens deslizam para o uso com monoplexes e multiplexes.
- Siga as etapas 2.1 − 2.9.1 usando os slides de controle e controle slides de tecido de escolha. Coloc um fluoróforo diferente em cada corrediça em uma concentração de 1:100; um slide deve conter apenas DAPI.
- Prossiga para a seção 2,11 exceto omitir a coloração DAPI e, em vez disso, use TBST e monte conforme descrito.
- Depois de deixar slides secos durante a noite, a imagem com todos os canais DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, semicondutores Quantum dots, e fluoresceina isotiocianato (FITC) definindo a exposição a 250 MS com o recurso de proteção de saturação1.
Nota: os tempos de exposição podem ser fixados a 50 − 250 MS13. - Faça o upload das imagens da biblioteca para o software e use na análise dos monoplexes e multiplex.
- Escolha slides para monoplexes.
- Escolha os slides de controle que têm um epítopo abundante de escolha com base em anticorpos otimizados (seção 1). Para cada rodada de coloração a ser feito no multiplex, selecione esse número de slides de controle para criar monoplexes.
Nota: a finalidade do conteúdos é determinar a melhor posição (ordem) para cada anticorpo a ser usado no multiplex.
- Escolha os slides de controle que têm um epítopo abundante de escolha com base em anticorpos otimizados (seção 1). Para cada rodada de coloração a ser feito no multiplex, selecione esse número de slides de controle para criar monoplexes.
- Monoplexes da mancha.
- Siga as seções 2.1 − 2.11 usando o anticorpo preliminar em uma ordem diferente (posição) para cada um dos slides. Cada slide deve ter apenas um anticorpo primário aplicado em uma ordem (posição) diferente dos outros slides.
Nota: para cada diapositivo em que a ronda não requer nenhum anticorpo primário ou fluoróforo, utilize diluente de anticorpos primários e diluentes de fluoróforo13.
- Siga as seções 2.1 − 2.11 usando o anticorpo preliminar em uma ordem diferente (posição) para cada um dos slides. Cada slide deve ter apenas um anticorpo primário aplicado em uma ordem (posição) diferente dos outros slides.
- Slides de imagem e analisar o Monoplex.
- Usando o microscópio e definindo o tempo de exposição para 250 MS para todos os canais capturar cada imagem utilizando DAPI para focar.
Nota: os tempos de exposição podem ser fixados a 50 − 250 MS14. - O uso do software de análise avalia cada slide conteúdos observando a intensidade fluorescente do marcador manchado.
- Compare essa intensidade com o plano de fundo. Se for pelo menos 5 − 10 vezes maior do que o plano de fundo, a posição desse slide é uma posição ideal para usar no multiplex final.
- Usando o microscópio e definindo o tempo de exposição para 250 MS para todos os canais capturar cada imagem utilizando DAPI para focar.
- Escolha slides para o multiplex.
- Escolha os slides de interesse e adicione um slide extra para ser usado como um slide em branco para subtração de autofluorescência após a coloração e imagem.
- Mancha o multiplex.
- Com base nos resultados conteúdos, escolha a ordem apropriada (posições) para cada anticorpo com base no passo 3.5.3. Atribua cada fluoróforo a um anticorpo.
Observação: isso pode precisar de otimização; Entretanto, planeie usar anticorpos brilhantes para uns marcadores menos abundantes1, os anticorpos co-Localizing devem ser combinados com os fluoróforos em espectros distantes de se13, e os fluoróforos com o espectro 540 e 570 não devem ser colocalizados devido a problemas de sobreposição espectral1. - Prossiga com as seções 2.1 − 2.11 assegurando que o slide em branco não receba anticorpos primários, fluoróforo ou DAPI, em vez disso, use diluente de anticorpos, diluente de fluoróforo e TBST, respectivamente, em seu lugar.
- Com base nos resultados conteúdos, escolha a ordem apropriada (posições) para cada anticorpo com base no passo 3.5.3. Atribua cada fluoróforo a um anticorpo.
- Imagem multiplex e analisar para a integridade da coloração
- Usando o microscópio e definindo o tempo de exposição para 250 MS para todos os canais, Capture cada imagem utilizando DAPI para focar.
- Usando o software de análise (tabela de materiais), avalie cada multiplex pela cor falsa fluorescente.
Nota: uma imagem nítida deve demonstrar claramente cada marcador. Se um marcador parece difuso e granulado ou inexistente, é provável que o marcador não funcionou e precisa ser reotimizado. - Usando o software de análise, avalie cada multiplex pela visão patológica. A visão patológica confirmará a especificidade de cada marcador. Compare com o IHC previamente otimizado (seção 1).
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Representative Results
O processo geral de obtenção de um ensaio multiplex de 7 cores segue um padrão repetitivo. A Figura 1 descreve o processo em um formulário diagramático. Uma vez que os slides são cortados e secos ou são recebidos do laboratório e cozido em um forno de hibridação a 60 ° c para 1 h, em seguida, proceder à desparaffinização e reidratação, fixar as lâminas em formalina novamente seguido pela recuperação do antígeno. Cada rodada de multiplexação começa na recuperação do antígeno e termina na remoção de anticorpos (Figura 1).
A otimização de cada etapa no processo é primordial para alcançar uma imagem clara e utilizável. Os anticorpos devem ser testados pelo IHC primeiramente usando tampões da recuperação do antígeno com pH 6 e pH 9 para que cada anticorpo visualize que o amortecedor da recuperação do antígeno trabalha melhor com esse anticorpo particular. Geralmente, alvos nucleares respondem à recuperação do antígeno com pH de tampão 9. Por exemplo, FOXP3 funciona melhor quando buffer de recuperação de antígeno de pH 9 é usado em oposição a CD3 que funciona melhor com buffer de recuperação de antígeno de pH 6. As imagens retiradas do processo de IHC devem ser usadas para validar a especificidade da análise multiplex.
Um conteúdos é necessário para determinar a ordem de cada anticorpo no multiplex. Ao usar um 4-ou um kit de 7 cores, cada anticorpo terá uma ordem preferida na matriz. Para o número de anticorpos que serão usados, reúna os slides de controle apropriados (ou seja, para um multiplex de 7 cores, onde uma cor é DAPI, selecione 6 lâminas de controle de representante específico do tecido para os outros 6 fluoróforos). Figura 2 A-C é uma representação esquemática de um ensaio conteúdos usando 3 lâminas com tecido de câncer de cólon ffpe. Cada slide tem FOXP3 em uma posição diferente na matriz usando fluoróforo 570 como sua marca. DAPI é usado como uma mancha contrária para visualizar adequadamente núcleos. Na Figura 3, são mostradas imagens representativas de um conteúdos e um multiplex com uma posição FOXP3 variável. Na Figura 3a, B onde FOXP3 está na terceira posição (correspondente à ordem mostrada na Figura 2C), coloração específica e robusta de FOXP3 (vermelho) é visto como demonstrado pela coloração nuclear brilhante Figura 3a e colocalização com a Figura 3Bdo CD3. A intensidade do sinal de fluoróforo confirma a especificidade de FOXP3 sem coloração inespecífica em outro lugar na Figura 3ado tecido. Na Figura 3C, onde FOXP3 está na primeira posição (correspondendo à ordem na Figura 2a), há coloração não específica de FOXP3. As áreas difusas granuladas da tampa vermelha a maioria da corrediça e da intensidade fluorescente nestas áreas são menos de 1. Tentar fazer um multiplex sem completar um conteúdos primeiro para testar a ordem dos resultados de coloração em um resultado semelhante e irá resíduos de reagentes. Outra etapa crítica que não pode ser negligenciada no processo multiplex é a coloração DAPI. Uma contratura DAPI de trabalho é a base para a identificação de células e posterior análise espacial usando o software de análise. Um contraste importante pode ser visto na imagem composta com DAPI de trabalho (azul) na Figura 3E e na DAPI não-trabalho na Figura 3F. A imagem na Figura 3F não pôde ser usada para identificar células no software de análise. Uma tentativa de resgatar o multiplex e a análise do tecido, a lamínula talvez removida por imersão do slide em TBST seguido por uma etapa de microondulação em pH 6 buffer de recuperação de antígeno com uma aplicação adicional de DAPI.
Uma vez que o ensaio conteúdos foi terminado e a ordem óptima do anticorpo confirmou, uma estratégia multiplex pode ser construída Figura 4. Para cada alvo um fluoróforo diferente deve ser escolhido. O número associado a cada fluoróforo representa aproximadamente o comprimento de onda fluorescente espectral emitido após a excitação, semelhante à citometria de fluxo. Deve-se tomar cuidado ao combinar anticorpos propostos com fluoróforos para limitar a sobreposição espectral e o potencial sangramento de marcadores. Uma boa estratégia é escolher comprimentos de onda longe uns dos outros para colocalização de anticorpos para reduzir o excesso de sobreposição espectral proporcionando uma imagem nítida e mais confiável fenotipagem13. Por exemplo, na estratégia multiplex exibida (Figura 4), CD8 é emparelhado com fluoróforo 570 enquanto CD3 é emparelhado com fluoróforo 520. Deve-se evitar o uso de fluoróforo 540 e 570 em alvos colocalizados, uma vez que estes tendem a ser os mais indiscriminantes e podem prejudicar os resultados. Fluorophore 620 tende a ser muito brilhante e deve ser usado para anticorpos que não são abundantes no tecido. Uma biblioteca recente usada como referência para cada fluoróforo também auxilia na redução da sobreposição espectral de fluorofores. Um slide em branco que passa por todas as rodadas de recuperação de antígeno é necessário para garantir a extração de autofluorescência da imagem composta. Este slide em branco será submetido ao mesmo tratamento que os slides multiplex, exceto no lugar de um anticorpo primário de trabalho e fluoróforo, o diluente de anticorpos e diluente de fluoróforo será usado respectivamente Figura 4B.
Para garantir que o design multiplex funcionou corretamente e os marcadores observados na imagem composta são específicos, use a "imagem de patologia" em combinação com a opção de configuração "brightfield" usando o software de microscópio que cria uma imagem IHC falso que pode ser em comparação com os ensaios anteriores do IHC discutidos na secção 1. Infelizmente, belas imagens compostas podem não necessariamente refletir uma mancha exata e este é um passo importante para controlar a qualidade do processo e evitar resultados falsos positivos. A Figura 5a demonstra uma imagem composta sem preocupação inicial. O CD3 é visualizado e mostra coloração específica (verde) e é confirmado pela imagem do brightfield da patologia na Figura 5b. CD163 (laranja) é visto na imagem composta (Figura 5a); Entretanto, na avaliação da visão do brightfield da patologia de CD163 (Figura 5C), o anticorpo é Nonspecific. Um exemplo de uma imagem multiplex ideal com coloração específica é demonstrado em uma imagem composta (Figura 5D). A especificidade CD3 e CD163 é confirmada usando a visão do brightfield da patologia (Figura 5E e Figura 5F, respectivamente) e compara favoràvel aos ensaios precedentes de IHC executados usando estes anticorpos (não mostrados).
Figura 1: diagrama de fluxo de trabalho de coloração.
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: desenvolvimento Monoplex.
(A) corrediça do cancro do cólon com FOXP3 na posição 1. (B) corrediça do cancro do cólon com FOXP3 na posição 2. (C) corrediça do cancro do cólon com FOXP3 na posição 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: sucessos e armadilhas do conteúdos e multiplex.
(A) ensaio Monoplex de câncer de cólon primário com FOXP3 na posição 3, rótulo de intensidade fluorescente mostrado. (B) ensaio multiplex do cancro do cólon primário com FOXP3 na posição 3 e CD3 na posição 2. (C) ensaio Monoplex de câncer de cólon primário com FOXP3 na posição 1, rótulo de intensidade fluorescente mostrado. (D) ensaio multiplex do cancro do cólon primário com FOXP3 na posição 1 e CD3 na posição 2. (E) ensaio multiplex do cancro do cólon primário com a ordem dos anticorpos da seguinte forma: CD8 (amarelo), CD3 (verde), CD163 (laranja), pancytokeratin (branco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (vermelho), trabalho DAPI (azul). (F) ensaio multiplex do cancro do cólon primário com a ordem dos anticorpos da seguinte forma: CD8 (amarelo), CD3 (verde), CD163 (laranja), pancytokeratin (branco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (vermelho), não-trabalho DAPI (azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: desenvolvimento multiplex.
(A) slide multiplex de câncer de cólon em um multiplex de 7 cores. (B) slide em branco em um multiplex de 7 cores usando tecido de câncer de cólon. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: analisando a especificidade de um multiplex de 7 cores.
(A) imagem composta multiplex com anticorpos da seguinte forma: CD8 (amarelo), CD3 (verde), CD163 (laranja), pancytokeratin (branco), 67 (vermelho), DAPI (azul). (B) opinião do brightfield da patologia da imagem no painel a na vista do CD3 somente. (C) opinião do brightfield da patologia da imagem no painel a na vista CD163 somente. (D) imagem composta multiplex com anticorpos da seguinte forma: CD8 (amarelo), CD3 (verde), CD163 (laranja), pancytokeratin (branco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (vermelho), DAPI (azul). (E) opinião do brightfield da patologia da imagem no painel D na vista do CD3 somente. (F) opinião do brightfield da patologia da imagem no painel D na vista CD163 somente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os espécimes intactos do tecido da biópsia contínua do tumor e do resection cirúrgico permanecem ferramentas diagnósticas e preditivas importantes para a análise da doença assim como o prognóstico paciente. Multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfIHC) é uma técnica nova que combine os benefícios do immunohistochemistry (IHC), da imunofluorescência (se) e do fluxo cytometry. Métodos prévios para sondar as células in situ permitiram a avaliação de arranjos célula a célula em um ambiente tecidual8, no entanto, o baixo número de epítopos que podem ser sondado limita a análise complexa. A citometria de fluxo, embora útil na análise de muitos tipos de células em um espécime, perde o contexto espacial em virtude da preparação de amostras como uma única suspensão celular9,10. mfIHC pontes estas técnicas, mantendo o contexto espacial do microambiente celular e aumentando o número de epítopos que podem ser rotulados enquanto amplificando o sinal por epítopo rotulado11. Pesquisas anteriores utilizaram mfihc para fenotipagem do infiltrado celular em espécimes de câncer e de tecido não oncológico1,2,3,4,5,15. A análise pós-imagem também tem sido utilizada para analisar as relações espaciais de células e estruturas dentro do microambiente tecidual1,2,4. Para uma análise fiável, deve primeiro ser produzida uma imagem específica e precisa. A técnica de coloração manual, ao contrário de um sistema de coloração automatizado, permite que os laboratórios menores e com custo-consciente acessem esta tecnologia. Tempo de otimização e tempo de coloração estão entre as maiores barreiras para alcançar uma imagem confiável para posterior análise espacial.
Várias regras gerais aumentam a probabilidade de geração bem-sucedida de uma imagem multiplex composta confiável e economizarão tempo e recursos. Os anticorpos a serem usados no multiplex devem ser escolhidos com base no sucesso com o IHC convencional manual. Os bufferes da recuperação do antígeno com pH 6 e pH 9 devem ser usados para o IHC a fim investigar a recuperação apropriada do antígeno para o uso no multiplex. O desenvolvimento Monoplex é necessário para identificar a colocação de anticorpos dentro do protocolo de multiplexação. A justificativa para isso é complicada e varia entre espécimes de tecido e epítopos. Em alguns casos, o epítopo pode degradar com múltiplas etapas de microondulação e a visualização do marcador é perdida, como é frequentemente o caso com CD3. FOXP3, no entanto, torna-se mais brilhante com mais passos de microondulação e é pouco visível se colocado na primeira ou segunda rodada de multiplex13,14.
O processo de coloração começa com o corte do tecido de FFPE em corrediças carregadas. O primeiro problema que pode ser encontrado é o tecido caindo do slide após a microondulação. Quando as lâminas carregadas não são usadas, a aderência do tecido à superfície de vidro é limitada e o tecido terá uma dobradura excessiva ou pode deslizar fora inteiramente. Para garantir ainda mais o tecido adere às lâminas durante o processo de coloração, várias técnicas são executadas. Primeiramente ao cortar os blocos em corrediças, a forma a mais pura da água trabalha melhor. Para alguns laboratórios, a água desionizada pode ser suficiente, mas a água destilada funcionou melhor. As lâminas devem ser secas planas imediatamente após o corte em 37 ° c durante a noite. Para garantir ainda mais a aderência, as lâminas são então colocadas em um forno de hibridação e cozido deitado em 60 ° c por uma hora antes de usar. Embora a fixação do formalina já ocorra durante o processo inicial da preparação do tecido, coloc as corrediças no formalina tamponado neutro por 30 minutos depois que o processo do desparafinização e da reidratação realça a integridade estrutural do montado tecido1,13.
O processo de coloração manual pode demorar até três, 8 horas dias, dependendo do número de anticorpos utilizados. Evitar armadilhas é essencial na economia de tempo e poupando reagentes. O primeiro erro comum ocorre frequentemente na preparação do reagente. A água difere entre os laboratórios e pode ser a única diferença nos resultados de um laboratório para o próximo. Usar o mesmo assim como uma fonte de água limpa para todas as reações e reagentes assegura um resultado consistente. Os anticorpos, a solução de bloqueio e os fluoróforos funcionam melhor à temperatura ambiente. Para evitar armadilhas no reagente e na preparação da solução de trabalho, use a mesma água para todos os reagentes. Utilize também todas as soluções de trabalho e reagentes à temperatura ambiente.
A solução de problemas de mfIHC é importante e a aderência a rigorosas diretrizes laboratoriais cruciais para limitar a contaminação dos componentes e/ou erro do operador. A produção de imagens suboptimal irá distorcer os resultados e levar a populações de células falsas positivas e negativas que podem impactar negativamente os dados. Como a análise final normalmente inclui fenótipos gerados por computador com base no aprendizado de máquina, pequenos erros na coloração podem ser ampliados para afetar todo o conjunto de dados. Por exemplo, embora todas as manchas possam funcionar perfeitamente, um erro ou omissão de DAPI impedirá a segmentação futura de células e contando a renderização da experiência inútil. Software de análise usa DAPI coloração não só para identificar células, mas atribui x e y coordenadas para cada célula e se o multiplex tem Dim, mal circunscrito, ou difusa DAPI coloração, a imagem não pode ser mais utilizado e o multiplex deve ser refeito ou tentado resgate e Recoloração de DAPI. O uso de componentes de software, como as visões de patologia e brightfield, aumentará a confiança na sensibilidade e especificidade no início do processo de otimização e evitará erros no início do processo multiplex.
Os aspectos modificadoras do processo de imagem também podem auxiliar na otimização de imagens. Por exemplo, tirar uma imagem usando DAPI como o auxílio visual para focar ajuda a evitar imagens borradas. Adicionando a recém-feita biblioteca de fluoróforo para o software irá garantir uma imagem limpa e menos sobreposição espectral de cada fluoróforo durante a fase de análise e usando o slide em branco para extrair a autofluorescência intensifica os marcadores e aumenta a imagem Qualidade.
O uso de espécimes de tecido tem e permanecerá como uma ferramenta essencial na investigação da fisiopatologia da doença. A tecnologia emergente aumentou nossa compreensão das interações Cell-to-Cell e o mfIHC é um novo jogador promissor. Otimização e precisão durante o processo de coloração nesta técnica é primordial para a utilização adequada e posterior análise das interações célula-célula.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por sua assistência com a configuração e otimização da coloração multiplex original. Os autores também gostariam de agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por dicas usando o software de análise. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelos institutos nacionais de câncer de saúde o prêmio número P30CA046592, K08CA201581 (Tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC), CA170568 (HC). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde. Apoio adicional foi fornecido por Jeffery A. Colby Colon Cancer e Tom Liu Memorial Research fundos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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