Summary
والهدف من البروتوكول هو توضيح الاختبارات المختلفة المتعلقة بالدخول الفيروسي التي يمكن استخدامها لتحديد مثبطات دخول الفيروس المرشح.
Abstract
الاختبارات المضادة للفيروسات التي تفحص ميكانيكيا دخول الفيروسية هي ذات الصلة لتحديد في أي خطوة العوامل التي تم تقييمها هي الأكثر فعالية، والسماح لتحديد مثبطات دخول الفيروسية المرشح. هنا، نقدم النهج التجريبية لتحديد الجزيئات الصغيرة القادرة على منع العدوى من قبل فيروس كوكساكي A16 غير المغلفة (CVA16) من خلال استهداف جزيئات الفيروس أو خطوات محددة في دخول الفيروس في وقت مبكر. وتشمل الاختبارات تحليل وقت إضافة المخدرات، والتدفق القائم على قياس السيتومتري اختبار ملزم الفيروسية، والتنبؤ بالتعطيل الفيروسي. كما نقدم بروتوكول الإرساء الجزيئي باستخدام بروتينات كابسيد الفيروس للتنبؤ بالمخلفات المحتملة التي تستهدفها المركبات المضادة للفيروسات. وينبغي أن تساعد هذه الاختبارات في تحديد العوامل المضادة للفيروسات المرشحة التي تعمل على دخول الفيروسية. ويمكن للاتجاهات المستقبلية أن تستكشف هذه المثبطات الممكنة لمزيد من تطوير العقاقير.
Introduction
أمراض اليد والقدم والفم (HFMD) هو المرض الأكثر شيوعا الناجمة عن فيروس كوكساكي A16 (CVA16) والفيروس المعوي 71 (EV71) في الأطفال الصغار. وفي الآونة الأخيرة في جميع أنحاء منطقة آسيا والمحيط الهادئ، حدث ارتفاع كبير في HFMD الذي يسببه CVA16. في حين يمكن أن تكون الأعراض خفيفة، يمكن أن تحدث مضاعفات شديدة تؤثر على الدماغ والقلب، مع احتمال الوفاة1،2. في الوقت الحاضر، لا توجد علاجات مضادة للفيروسات مرخصة أو التطعيمات المتاحة لCVA16، وبالتالي هناك حاجة ملحة لوضع استراتيجيات مضادة للفيروسات للحد من تفشي الأمراض في المستقبل والمضاعفات المرتبطة بها.
CVA16 هو فيروس غير مغلف الذي يحتوي على capsid icosahedral تجميعها من pentamers أن كل تحتوي على 4 البروتينات الهيكلية وهي VP1، VP2، VP3، و VP4. تطويق كل محور خمسة أضعاف في الخماسي هو منطقة 'الوادي' التي تظهر كالاكتئاب ويلاحظ لدورها في مستقبلات ملزمة3. في الجزء السفلي من هذا الوادي يكمن جيب الكاره للماء في منطقة VP1 التي تحتوي على الرباط الدهنية الطبيعية المسماة sphingosine (SPH). مستقبلات الخلوية، مثل الإنسان P selectin غليكوزيبروتين ليكاند 1 (PSGL-1) ومستقبلات الزبال فئة B عضو 2 (SCARB2)، وقد اقترح للعب دور في الربط الفيروسي عن طريق إزاحة هذا الرباط الذي يؤدي إلى تغييرات المطابقة إلى كابسيد و طرد لاحق من الجينوم الفيروسي في الخلية المضيفة4،5،6. تحديد مثبطات المحتملة التي تمنع الأحداث المتعاقبة في عملية دخول الفيروسية يمكن أن توفر استراتيجيات علاجية محتملة ضد عدوى CVA16.
ويمكن تشريح الخطوات في دورة حياة الفيروس من خلال النهج التجريبية كأهداف للمساعدة في تحديد العوامل المضادة للفيروسات الخاصة بالوضع. تحليل وقت إضافة المخدرات يفحص تأثير العلاج من المخدرات في أوقات مختلفة خلال العدوى الفيروسية، بما في ذلك ما قبل الدخول (أضيف قبل العدوى بالفيروس)، والدخول (إضافة متزامنة إلى عدوى الفيروس)، وبعد الدخول (أضيفت بعد دخول عدوى الفيروس)7. يمكن تقييم التأثير باستخدام فحص البلاك القياسي عن طريق تحديد عدد اللويحات الفيروسية التي تشكلت في كل حالة من شروط العلاج. يحدد فحص الربط الفيروسي القائم على قياس الخلايا ما إذا كان الدواء يمنع التعلق الفيروسي بالخلايا المضيفة. ويتحقق ذلك عن طريق تحويل درجة الحرارة من 37 درجة مئوية، التي تحدث فيها غالبية عدوى الفيروس البشري، إلى 4 درجة مئوية، حيث تكون virions قادرة على ربط سطح الخلية المضيفة ولكنها غير قادرة على دخول الخلايا7. ثم يتم قياس جزيئات الفيروس المرتبطة بغشاء الخلية كمياً من خلال التلطيخ المناعي ضد المستضدات الفيروسية وتقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي. اختبار التعطيل الفيروسي من ناحية أخرى يساعد على تقييم التفاعلات المادية المحتملة للدواء مع جزيئات الفيروس الحرة، إما حماية أو تحييد virions، أو التسبب في التجمعات أو التغيرات المطابقة التي تجعلها غير نشطة ل التفاعلات اللاحقة مع سطح الخلية المضيفة أثناء العدوى8،9. في هذه التجربة ، يسمح للابوتان الفيروسي باحتضان الدواء لأول مرة قبل تخفيفه لمعايرة الدواء قبل إصابة الخلية المضيفة أحادية الطبقة وإجراء فحص البلاك القياسي8. وأخيرا، الإرساء الجزيئي هو أداة قوية للتنبؤ مواقع التفاعل المخدرات المحتملة على سطح فيريون، بما في ذلك البروتينات السكرية الفيروسية من الفيروسات المغلفة والبروتينات كابسيد الفيروسية من الفيروسات غير المغلفة، وذلك باستخدام الحسابية خوارزميات. وهذا يساعد على تحديد الأهداف الآلية لطريقة عمل الدواء وتوفير معلومات مفيدة يمكن التحقق من صحتها من خلال الاختبارات النهائية.
لقد استخدمنا مؤخرا الأساليب المذكورة أعلاه لتحديد المركبات المضادة للفيروسات التي منعت بكفاءة العدوى من قبل CVA169غير مغلفة . هنا، يتم وصف البروتوكولات التفصيلية التي تم استخدامها ومناقشتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: ويجب إجراء جميع حالات زراعة الخلايا والعدوى بالفيروس في أغطية معتمدة للسلامة الأحيائية تكون مناسبة لمستوى السلامة الأحيائية للعينات التي يجري التعامل معها. يتم استخدام اثنين من فئة التانين من الجزيئات الصغيرة حمض الشابولاجيك (CHLA) وpunicalagin (PUG)، التي لوحظت لمنع Efficiently CVA16 العدوى9، كأمثلة على العوامل المثبطة المرشح. للمبادئ الأساسية في تقنيات علم الفيروسات، وانتشار الفيروس، وتحديد titer الفيروس، ومفاهيم وحدات تشكيل البلاك (PFU) أو تعدد العدوى (MOI)، يشار إلى القارئ إلى المرجع10.
1. خلية الثقافة، وإعداد الفيروسات، وإعداد مركب، والسمية الخلوية المركبة
- خلايا الساركوما الروماتيزمية البشرية (RD) هي الخلايا المضيفة المتساهلة للعدوى CVA1611. تنمو خلايا RD في 10 مل من دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 200 U / مل البنسلين G، 200 ميكروغرام / مل العقديات، و 0.5 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين B في T-75 قوارير في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪.
- إعداد CVA16 عن طريق نشر الفيروس في خلايا RD وتحديد titer الفيروسية في PFU / مل. للحصول على بروتوكول محسّن، يرجى الرجوع إلى المرجع11.
- إعداد مركبات الاختبار والضوابط باستخدام المذيبات الخاصة بكل منها: على سبيل المثال، حل CHLA وPUG في كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO). لجميع خطوات العدوى، تألفت الوسط القاعدية من DMEM بالإضافة إلى 2٪ FBS والمضادات الحيوية.
ملاحظة: التركيز النهائي للDMSO في العلاجات المركبة الاختبار يساوي أو أقل من 0.25٪ في التجارب؛ يتم تضمين 0.25٪ DMSO كعلاج التحكم السلبي في الاختبارات للمقارنة. - إجراء فحص السمية الخلوية لمركبات الاختبار على خلايا RD باستخدام قدرة الخلية على تحديد الكاشف مثل XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium هيدروكسيد). للاطلاع على بروتوكول مفصل، يرجى الرجوع إلى المرجع12. تحديد تركيزات السمية الخلوية لمركبات الاختبار باستخدام برنامج تحليلي مثل GraphPad Prism وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تركيزات المخدرات التي لا تؤثر بشكل كبير على بقاء الخلية (≥ 95٪ الخلايا القابلة للحياة) تستخدم لبقية الدراسة.
2- اختبار وقت إضافة المخدرات
-
تقييم تأثير الأدوية على الخلايا المضيفة قبل العدوى الفيروسية (المعالجة المسبقة)
- خلايا RD البذور في لوحات 12 جيدا في كثافة البذر من 2 × 105 خلايا / جيدا. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ للحصول على طبقة واحدة.
- علاج خلايا RD مع مركبات الاختبار في تركيزات غير سامة للخلايا (تحدد من الخطوة 1.4) في 1 مل من حجم الوسائط القاعدية لمدة 1 ساعة أو 4 ساعة.
- غسل الخلايا مع 1-2 مل من PBS قبل إضافة 50 PFU / جيدا من الفيروس في الوسط القاعدية (الحجم النهائي للتلقيح هو 300 درجة مئوية) لمدة 1 ح. صخرة لوحة كل 15 دقيقة.
- بعد العدوى، وغسل الطبقات الأحادية مرة أخرى باستخدام PBS، ثم تراكب مع 1 مل من وسائل الإعلام القاعدية التي تحتوي على 0.8٪ ميثيل سيلولوز لمزيد من الحضانة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪.
- بعد 72 ساعة من الحضانة، وإزالة وسائل الإعلام تراكب وغسل الآبار باستخدام 2 مل من PBS.
- إصلاح الآبار باستخدام 0.5 مل من 37٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة.
- إزالة supernatant وغسل مرة أخرى باستخدام PBS.
- وصمة عار الآبار باستخدام 0.5 مل من 0.5٪ الكريستال البنفسجي الحل. ثم إزالة محلول وصمة عار في غضون 2 دقيقة وغسل الآبار مع تيار لطيف من الماء قبل تجفيف الهواء.
- عد اللويحات الفيروسية عن طريق وضع لوحة على مربع الضوء الأبيض. حساب النسبة المئوية (٪) CVA16 العدوى على النحو التالي: (متوسط # من فيروس البلاك + المخدرات / متوسط # من فيروس البلاك + DMSOالسيطرة) × 100٪.
-
تقييم تأثير إضافة الأدوية والفيروس في وقت واحد (إضافة مشتركة)
- خلايا RD البذور في لوحات 12 جيدا في كثافة البذر من 2 × 105 خلايا / جيدا. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ للحصول على طبقة واحدة.
- علاج خلايا RD مع مركبات الاختبار في تركيزات مناسبة و 50 PFU / جيدا من CVA16 (الحجم النهائي للتلقيح هو 300 درجة مئوية) في وقت واحد لمدة 1 ح. صخرة لوحة كل 15 دقيقة.
- غسل الخلايا مع 1 مل من PBS ومن ثم تراكب مع 1-2 مل من وسائل الإعلام القاعدية التي تحتوي على 0.8٪ ميثيل سيلولوز لمزيد من الحضانة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪.
- وصمة عار لويحات الفيروسية مع الكريستال البنفسجي بعد 72 ح بعد العدوى وتحديد ٪ CVA16 العدوى كما هو موضح أعلاه.
-
تقييم تأثير العلاج الدوائي بعد الدخول الفيروسي (بعد العدوى)
- خلايا RD البذور في لوحات 12 جيدا في كثافة البذر من 2 × 105 خلايا / جيدا. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ للحصول على طبقة واحدة.
- تلقيح خلايا RD مع 50 PFU / جيدا من CVA16 (المجلد النهائي من inoculum هو 300 درجة مئوية) لمدة 1 ح. صخرة لوحة كل 15 دقيقة.
- غسل الآبار مع 1-2 مل من PBS وتراكب الخلايا مع وسائل الإعلام القاعدية التي تحتوي على 0.8٪ ميثيل سيلولوز وتركيزات مناسبة من مركبات الاختبار.
- وصمة عار لويحات الفيروسية مع البنفسج الكريستال العد بعد 72 ح بعد العدوى وتحديد٪ CVA16 حضانة العدوى المذكورة أعلاه.
ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات السُمع PBS برفق لتجنب رفع الخلايا.
3. تدفق قياس السيتومتري القائم على ملزمة
- خلايا RD البذور في لوحات 12 جيدا في كثافة البذر من 2 × 105 خلايا / جيدا. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ لتحقيق طبقة واحدة.
- قبل تبريد الخلية أحادية الطبقة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- إصابة خلايا RD مع CVA16 (MOI = 100) في وجود وعدم وجود مركبات الاختبار لمدة 3 ح عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: إجراء التطعيم الفيروسي على الجليد وما يترتب على ذلك من حضانة في ثلاجة 4 درجة مئوية للحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجة مئوية، مما يسمح بالربط الفيروسي ولكن ليس الدخول. - إزالة التلقيح الفيروس وغسل مرة واحدة مع 1-2 مل من الجليد الباردة PBS.
- رفع الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من الجليد الباردة التفكك العازلة إلى الآبار على الجليد لمدة 3 دقائق، قبل جمع الخلايا وإعادة تعليقها في الجليد الباردة تدفق التخزين المؤقت للخلايا (1X PBS زائد 2٪ FBS).
- غسل الخلايا مرتين باستخدام الجليد الباردة تدفق الستوميومترية العازلة وإصلاح الخلايا مع 0.5 مل من 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 20 دقيقة على الجليد.
- غسل الخلايا باستخدام PBS لإزالة أي فيروسات غير مقيدة أو ضعيفة، ومن ثم وصمة عار الخلايا مع 1 مل من الأجسام المضادة VP1 (1:2000؛ المخففة في PBS تحتوي على 3٪ BSA) على الجليد لمدة 1 ساعة، تليها الحضانة مع الثانوية اليكسا 488-مترافقالمضادة للماوس IgG (1:250; مخففة في PBS تحتوي على 3٪ BSA) على الجليد لمدة 1 ح. أداء الغسول PBS (3 مرات) بعد كل علاج الأجسام المضادة.
- إعادة تعليق الخلايا في 0.5 مل من المخزن المؤقت قياس الخلايا تدفق الجليد الباردوإجراء تحليل قياس التدفق على مقياس التدفق باستخدام الإجراءات القياسية. تقديم البيانات في الرسوم البيانية باستخدام البرامج المرتبطة بها وquantitate لتمثيل الرسم البياني شريط.
4. فيروسي ّة تعطيل إنقابية
-
إجراء عملية تحديد التعطيل الفيروسي كما سبق وصفها12 باستخدام الشروط التالية:
- تركيز يبدأ من 106 PFU / مل من CVA16.
- الطبقات الأحادية للخلايا RD في لوحات 12-well من كثافة البذر من 2 × 105 خلايا / جيدا.
- تخفيف 50 أضعاف لمعايرة مركبات المخدرات مما أدى إلى تركيز الفيروس النهائي من 50 PFU / جيدا.
- غسل الخطوات باستخدام 1-2 مل من PBS.
- تراكب وسائل الإعلام التي تحتوي على 0.8٪ ميثيل سيلولوز. - إجراء القراءة النهائية للعدوى الفيروسية باستخدام تلطيخ البنفسج الكريستالي من إجراء لويحات الفيروسية كما هو مفصل أعلاه.
5. تحليل الإرساء الجزيئي
- تحميل جزيئات 3D من مركبات الاختبار من PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). إذا لم يكن لدى الجزيئات بنية ثلاثية الأبعاد تم تحميلها، قم بتنزيل الهياكل ثنائية الأبعاد أو استخدم تسلسل سلسلة SMILES وتحوّل إلى جزيئات ثلاثية الأبعاد عبر برنامج جزيئي (مثل CORINA).
- تحميل وحدة التجميع البيولوجي الفيروسي من بنك بيانات البروتين RCSB (https://www.rcsb.org/) وإعداد نموذج الهيكل الفيروسي باستخدام برنامج الحوسبة الحيوية (على سبيل المثال UCSF Chimera). على سبيل المثال، في حالة CVA16 ناضجة هيكل الكريستال virion(PDB: 5C4W) 3، حذف المذيبات من ملف PDB، واستبدال السلاسل الجانبية غير مكتملة باستخدام البيانات من مكتبة دنبراش 2010 Rotamer، وإضافة الهيدروجين والرسوم إلى هيكل كما ذكرت سابقا13. أهداف الإرساء يمكن أن تكون أي بروتينات فيروسية ذات صلة للتحليل المقصود مع معلومات التجميع البيولوجي (بروتين بنك البيانات).
-
قفص الاتهام اختبار المركبات على وحدة الفيروس المعدة باستخدام على سبيل المثال UCSF Chimera، وتحليل ملفات الإخراج مع برنامج التصور (على سبيل المثال، أوتودوك فينا، PyMol):
- تحميل ملف مركب اختبار في UCSF Chimera كما 'ligand' وأداء الإرساء أعمى عن طريق اختيار البروتين الفيروسي أعدت كله كما 'مستقبلات'. استخدم ماوس الكمبيوتر أو لوحة التعقب لتغيير حجم حجم البحث إلى "المستقبل" بأكمله. في "خيارات متقدمة"، السماح لعدد أوضاع الربط أن يكون عند الحد الأقصى. سيتم ترتيب إطارات الإرساء تلقائيًا من أعلى طاقة إلى أدنى طاقة ملزمة.
- (اختياري) بالإضافة إلى الالتحام الأعمى، حصر موقع الإرساء على البروتين الفيروسي في المناطق ذات الأهمية المستمدة من نتائج الإرساء الأعمى باستخدام الماوس أو لوحة التتبع مرة أخرى لتقليل حجم البحث (على سبيل المثال، 100 Å x 100 Å x 100 Å). تساعد هذه الخطوة على تأكيد نتائج الإرساء العمياء وتزيد من الخصوصية.
- استخدم نظام رسومات جزيئية (على سبيل المثال، PyMol) لتحليل مواضع أوضاع الربط عن طريق تحميل ملف الإرساء. العثور على الاتصالات القطبية من المجمع إلى البروتين الفيروسي عن طريق اختيار 'ligand' وتحديد الاتصالات القطبية مع خيار 'إلى أي ذرات'؛ فحص النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يشار إلى اختبار وقت إضافة المخدرات في الشكل 1 ويظهر تأثير العلاج باستخدام الجزيئات الصغيرة CHLA وPUG على عدوى CVA16 إما قبل دخول الفيروسية (المعالجة المسبقة)، أثناء الدخول الفيروسي (إضافة مشتركة)، أو دخول ما بعد الفيروسية ( ما بعد العدوى). كلا الجزيئات الصغيرة تنتج فقط تأثير هامشي ضد CVA16 العدوى سواء في المعالجة المسبقة للخلايا المضيفة قبل العدوى الفيروسية (الشكل1A)أو في العلاج بعد العدوى (الشكل1C). وعلى النقيض من ذلك، ألغت CHLA وPUG بكفاءة العدوى CVA16 بنسبة > 80٪ في العلاج بالإضافة المشتركة (الشكل1B). ولذلك تشير هذه الملاحظات إلى أن المركبين يكونان أكثر فعالية عندما يكونان موجودين في الوقت نفسه مع جزيئات الفيروس على سطح الخلية المضيفة أثناء العدوى.
في الشكل 2، يؤكد تحليل الربط القائم على قياس الخلايا (الموضح في الشكل 2A)أن العفصين يمنعان إدخال CVA16 عن طريق منع ربط الجسيمات الفيروسية بالخلايا المضيفة. تظهر بيانات القياس الكمي في الشكل 2B أن كمية الفيروس المكتشفة على سطح الخلية RD في وجود الدواءين، أقل من 10٪، على غرار السيطرة الإيجابية الهيبارين الذي يعرف لمنع CVA16 المرفق14. الشكل 2C، 2D،و 2E تصور الرسوم البيانية تدفق قياس الخلايا المرتبطة حيث يتم تقليل تحول الفرقة بسبب الكشف عن CVA16 على سطح الخلية RD بشكل كبير عندما CHLA وPUG موجودة.
الشكل 3A يصور كيفية إجراء تجربة التعطيل الفيروسي. وكان مركب المخدرات إما مختلطة مع جزيئات فيروس CVA16 واحتضنت لمدة 1 ساعة (على المدى الطويل) قبل خطوة التخفيف، أو مختلطة ومخففة على الفور (على المدى القصير) قبل العدوى. كما هو مبين في الشكل 3B، أدى حضانة ما قبل جزيئات CV16 مع عوامل الاختبار لمدة 1 ساعة إلى حماية شبه كاملة من خلايا RD ضد العدوى الفيروسية مقارنة بالحضانة قصيرة الأجل والسيطرة DMSO. ولذلك تشير النتائج إلى أن كلا من CHLA وPUG تتفاعل مع جزيئات CVA16 وقادرة على جعلها غير نشطة في العدوى اللاحقة.
وبما أن بياناتنا تشير إلى أن مركبات المخدرات يمكن أن تعطل مباشرة جزيئات CVA16، وبالتالي تحديد فيريون نفسها كهدف معقول لنشاطها المضاد للفيروسات، استخدمنا الإرساء الجزيئي للتنبؤ بالتفاعل المحتمل (التفاعلات المحتملة) بين هذه وكلاء وCVA16 كابسيد الخماسي. ويبين الشكل 4A إسقاط سطح خماسي CVA16 الذي يشكل الكابسيد icosahedral من virion CVA16. الإرساء الجزيئي للعفص CHLA (الشكل4B؛ الأخضر) وPUG (الشكل4C؛ الأزرق) تشير إلى أن كلاهما من المتوقع أن ربط في منطقة الوادي من الخماسي CVA16. على وجه التحديد، كل من الجزيئات الصغيرة ملزمة فقط فوق مدخل الجيب (الشكل4B و 4C، لوحات التكبير)، الذي يحمل عامل الجيب ويلعب دورا هاما للتوسط CVA16 ملزمة والدخول في الخلية المضيفة. ولذلك يبدو أن كلا من CHLA وPUG لإخفاء منطقة مدخل الجيب، والتي من شأنها نظريا عرقلة التفاعلات بين جزيئات الفيروس ومستقبلات الخلية المضيفة. الشكل 4D و 4E تشير إلى المخلفات الفريدة المتوقعة من الاتصالات القطبية CHLA وPUG، على التوالي، حول مدخل الجيب، مع معظم هذه التفاعلات التي تحدث مع VP1 لكل من المركبات والأحماض الأمينية 3 Asn85 ، Lys257، وAsn417 يجري مشتركة بين العفصين اثنين.
الشكل 1: تأثير وقت إضافة المخدرات من CHLA وPUG ضد CVA16 العدوى. تم التعامل مع خلايا RD مع CHLA (20 درجة مئوية) أو PUG (25 درجة مئوية) في أوقات مختلفة من تلقيح CVA16 (50 PFU / جيدا). إدارة الشؤون الإدارية (0.25 في المائة) تم تضمين العلاج كمراقبة سلبية وتم تحليل جميع الاختبارات عن طريق فحص البلاك باستخدام الكريستال البنفسجي تلطيخ 72 ساعة بعد الحضانة. (أ) للعلاج المسبق، تم احتضان الخلايا مع مركبات الاختبار لمدة ساعة أو 4 ساعة ثم تم غسلها قبل الإصابة CVA16. (ب) لاختبارات الإضافة المشتركة، تم إعطاء الخلايا مع الأدوية والفيروسات في وقت واحد لمدة ساعة واحدة ثم غسلها. (ج) في مرحلة ما بعد العدوى، أصيبت الخلايا بـ CVA16 لمدة ساعة واحدة، وغسلها، ثم عولجت بمركبات الاختبار. البيانات المعروضة هي الوسيلة ± الانحراف المعياري (SD) من ثلاث تجارب مستقلة. *p < 0.05 مقارنة مع مجموعة 'فيروس فقط' المعنية. وقد أُجري تحليل إحصائي باستخدام تحليل التباين في اتجاه واحد. وقد تم تكييف هذا الرقم من المرجع9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إلغاء CHLA وPUG CVA16 ملزمة للخلية المضيفة. (أ) مخطط للتدفق قياس السيتومتري المستندة إلى التنبؤ الملزم. (B) تم إصابة خلايا RD (2 × 105 خلايا / بئر) مع CVA16 (وزارة الداخلية = 100) في وجود أو غياب CHLA (20 μM)، PUG (25 μM)، الهيبارين القابل للذوبان (500 ميكروغرام / مل، السيطرة الإيجابية)، أو DMSO (0.25٪، السيطرة السلبية) لمدة 3 ساعة في 4 درجة مئوية. تم جمع إينوكولا من الآبار في أنابيب، وغسلها مع PBS مرتين، ثابتة، وملطخة المضادة VP1 تليها اليكسا 488-المترافق الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن تدفق قياس الخلايا من الفيروسات المرتبطة بالسطح. وقد تم رسم البيانات الكمية من إشارات الفلورة المكتشفة كوسيلة ± SD من ثلاث تجارب مستقلة في الرسم البياني الشريطي بأنها 'ملزمة للفيروس (%). *p < 0.05 بالمقارنة مع علاج التحكم 'DMSO'. وقد أُجري تحليل إحصائي باستخدام تحليل التباين في اتجاه واحد. يتم عرض المخططات الشعاعية للتدفقالتمثيلي للCHLA (C) وPUG (D) والهيبارين (E). وقد تم تكييف هذا الرقم من المرجع9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كل من الكلا وبوج يعطلان جزيئات فيروس CVA16 الخالية من الخلايا. (أ) مخطط من التأنيب الفيروسي. (B) CVA16 (106 PFU/well) تم التعامل مع CHLA (20 μM) أو PUG (25 μM) ومختلطة على الفور للتعطيل على المدى القصير أو احتضنت لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية للتعطيل على المدى الطويل قبل أن تضعف 50 أضعاف إلى تركيز غير فعال من الاختبار المركبات قبل تلقيح على خلايا RD (تركيز الفيروس النهائي = 50 PFU / جيدا). إدارة الشؤون الإدارية (0.25 في المائة) تم استخدامه كتحكم سلبي. تم تحليل التجارب عن طريق فحص البلاك باستخدام البنفسج الكريستال يلطّخ 72 ح بعد العدوى. البيانات المعروضة هي الوسائل ± SD من ثلاث تجارب مستقلة. *p < 0.05 مقارنة مع مجموعة 'فيروس فقط' المعنية. وقد أُجري تحليل إحصائي باستخدام تحليل التباين في اتجاه واحد. وقد تم تكييف هذا الرقم من المرجع9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يستهدف كل من الجيش الكلاوجي والبوق والكاب كابسيد CVA16 بالقرب من مدخل الجيب. إسقاط سطح الجسيمات virion CVA16 مع الخماسي الهيكلي الأحادي ةالتي تحددها الخطوط الحمراء (A). وتظهر خماسية إضافية على virion في سماوي، أرجواني، النيلي، البرونزية، والأخضر. تحليل الإرساء الجزيئي للCHLA (B، الأخضر) وPUG (C، الأزرق) على خماسي CVA16 (PDB: 5C4W)؛ يتم رسم لوحات التكبير في باللون الأصفر. VP1 = البرتقالي، VP2 = رمادي، VP3 = أبيض؛ يتم عرض الاتصالات القطبية كشرطات سوداء. بقايا أن ّ [كب-وب] جيب مدخل يلوّن أحمر ([إيل]94, [أسب]95, [غلين]207, يلتقي212, يلتقي213, [ليس]257, [ثر]258). D, E. عرض جانبي عن قرب في الوادي حيث يقع مدخل الجيبوحيث CHLA (D) وPUG (E) ربط. يتم تسمية المخلفات الفريدة التي هي جهات الاتصال القطبية من الاتصالات القطبية للمركبات على الخماسي باللون الأصفر (VP1)، والأبيض (VP2)، والأسود (VP3) الخطوط. يشير الخط الأبيض المتقطع إلى منطقة مدخل الجيب. وقد تم تكييف هذا الرقم من المرجع9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير، وصفنا البروتوكولات التي هي مفيدة لتحديد المرشحين المضادة للفيروسات التي تستهدف دخول الفيروسية، ولا سيما ضد CVA16 غير مغلفة. تم تصميم الاختبارات بطرق لتشريح الأحداث المبكرة أثناء الدخول الفيروسي، وهو أمر مفيد لتوضيح آلية (آليات) العمل والأهداف المحتملة للنشاط المضاد للفيروسات لوكلاء الاختبار. يسمح "اختبار وقت إضافة المخدرات" لتحديد الهدف المحتمل لمركبات الاختبار بشكل عام، على سبيل المثال الخلايا المضيفة غير المصابة (تحليل المعالجة المسبقة)، وجزيئات الفيروس أو تفاعلاته مع سطح الخلية المضيفة (تحليل الإضافة المشتركة ) ، أو الخلية المضيفة المصابة بالفيروس أثناء مرحلة النسخ المتماثل الفيروسي (تحليل ما بعد العدوى). هذا الفحص وحده يمكن أن يحدد طريقة التفاعل من المركبات (على سبيل المثال، الإضافة المشتركة) التي تؤدي إلى الاختبارات اللاحقة الموصوفة في هذا البروتوكول (على سبيل المثال، اختبار التعطيل الفيروسي والتحليل الملزم). خطوات غسل حاسمة لضمان أن طريقة العلاج فحص محددة لتلك التي تم تحليلها. يساعد استخدام "قياس التدفق الخلوي الملزم" على تقييم تأثير المركبات على وجه التحديد على ربط الفيروس بالخلية المضيفة. الحفاظ على درجة حرارة التجربة في 4 درجة مئوية مهم للكشف النهائي عن virions على سطح الخلية، وهذه درجة الحرارة يسمح الربط الفيروسية ولكن ليس الدخول. ويمكن أن يساعد "اختبار التعطيل الفيروسي" في تحديد التفاعل المادي المحتمل لمركبات المخدرات مع جزيئات الفيروس الخالية من الخلايا. الخطوة الحاسمة هي التخفيف لمعايرة مركبات المخدرات بعد الحضانة مع التلقيح الفيروسي ، لأن هذا ضروري لمنع أي تفاعل ذي مغزى من المخدرات مع سطح الخلية المضيفة في الخطوة اللاحقة العدوى12.
وبما أن الدخول الفيروسي هو حدث متعدد الخطوات، فإن فئة مثبطات دخول الفيروس من العوامل المضادة للفيروسات يمكن أن تمارس عدة أنواع من الآليات، بما في ذلك: (1) تعديل عوامل/مستقبلات دخول سطح الخلية أو مسارات الإشارة المرتبطة بها؛ (2) تعديل عوامل/مستقبلات دخول سطح الخلية؛ (3) تعديل عوامل/مستقبلات دخول سطح الخلية؛ (3) تعديل عوامل/مستقبلات دخول سطح الخلية؛ (3) تعديل عوامل/مستقبلات دخول سطح الخلية. (2) تؤثر على سيولة غشاء الخلية أو سلامة؛ (3) استهداف التفاعلات الكهروستاتيكية أو الفان دير والز بين جزيئات الفيروس وسطح الخلية المضيفة؛ (4) إحداث تغييرات مادية في الفيرونات مثل كسر الجسيمات أو التجميع؛ (5) ملزمة للبروتينات السكرية الفيروسية أو البروتينات كابسيد ومنع وظائفها أو التغيرات المطابقة؛ (6) حجب الآليات المرتبطة الانصهار؛ و(7) منع إطلاق الجينوم الفيروسي داخل الخلية المضيفة. ولذلك فإن التحليلات الموصوفة في هذا التقرير يمكن أن تساعد في الإشارة إلى أساليب العمل المحتملة المذكورة أعلاه التي يمكن التحقق من صحتها بمزيد من التجارب الإضافية. وأخيرا، فإن "تحليل الإرساء الجزيئي" الموصوف هنا مفيد للتنبؤ بمناطق التفاعل المحتملة بين مركبات المخدرات وجزيئات الفيروس، وعلى هذا النحو يمكن أن تساعد في تحديد القبعات الفيروسية المرشحة أو الموثقات البروتين السكري والمستهدفة بقايا على جزيئات الفيروس. ومع ذلك، تعتمد هذه التنبؤات على برنامج الإرساء، ودقة ودقة هياكل الكريستال البروتين الفيروسي. من المهم أن نلاحظ أن طريقة الإرساء المحصورة الاختيارية في الخطوة 5.3.2 أضيفت لأنه في كثير من الأحيان عند استخدام البروتينات الهيكلية الفيروسية كجزيء 'مستقبلات'، يمكن ربط الرباط ربما إلى المناطق التي عادة لا يمكن الوصول إليها أو يتعرض على السطح ( على سبيل المثال، تحت سطح غطاء الفيرة التي تواجه داخل فيريون، والمناطق عبر الغشاء من البروتينات السكرية المغلف، وما إلى ذلك). حصر مربع البحث يسمح فقط المناطق التي يمكن الوصول إليها من البروتين الفيروسي أن تكون مستهدفة ويستبعد أي تفاعلات غير واقعية. الإرساء الجزيئي يعتمد على الهياكل المتبلورة، ولكن التطورات الأخيرة في النمذجة الهولوجية مكنت من تحليل الهياكل غير المتبلورة من خلال تركيب تسلسل الأحماض الأمينية على بنية متبلورة وثيقة الصلة15. وقد سمح ذلك بتحليل المزيد من الهياكل، ويمكن أن تكون المعلومات التي تم الحصول عليها مفيدة لمزيد من الدراسات بما في ذلك التحليلات الطفرة التي يمكن أن تساعد في التحقق من صحة التفاعلات المتوقعة.
وفي الختام، فإن الاختبارات والبروتوكولات الموصوفة في هذا التقرير تُعالج على وجه التحديد لتحديد العوامل المضادة للفيروسات المرشحة التي تستهدف الدخول الفيروسي، وتقديم معلومات عن أي خطوة من عملية الدخول الفيروسي يستهدفها عامل الاختبار، سواء كانت التفاعل مع جزيئات الفيروس الحرة، والتنبؤ بمواقع التفاعل المخدرات المحتملة على virions. ويمكن تكرار هذه الأنواع من الاختبارات على الفيروسات الأخرى غير المغلفة أو تكييفها مع الفيروسات المغلفة كوسيلة لفحص مركبات الأدوية المضادة للفيروسات لمثبطات محتملة للدخول الفيروسي. ومن شأن استخدام هذا النهج القائم على الآلية لتحديد المرشحين المضادين للفيروسات أن يساعد على التعجيل بعملية تطوير العقاقير وتوسيع نطاق العلاجات المضادة للفيروسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشعر المؤلفون بالامتنان للدكتور جوشوا بيكهام في جامعة تكساس في أوستن على الدعم التقني مع الإرساء الجزيئي. وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا بتمويل من وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (MOST107-2320-B-037-002 إلى C.J.L. و L.T.L.; MOST106-2320-B-038-021 وMOST107-2320-B-038-034-MY3 إلى L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
