Summary
Målet med protokollen er å illustrere de ulike analysene knyttet til viral oppføring som kan brukes til å identifisere kandidat viral oppføring hemmere.
Abstract
Antivirale analyser som mechanistically undersøke viral oppføring er relevant å skjelne på hvilke trinn de evaluerte agentene er mest effektive, og tillater identifisering av kandidat viral oppføring hemmere. Her presenterer vi den eksperimentelle tilnærminger for identifisering av små molekyler i stand til å blokkere smitte av ikke-innhyllet coxsackievirus A16 (CVA16) gjennom målretting viruset partikler eller bestemte trinn i tidlig viral oppføring. Analyser inkluderer tid-av-stoff-tillegg analyse, flyt flowcytometri-baserte viral bindende analysen, og viral inaktive analysen. Vi presenterer også en molekylær docking-protokoll utnytte virus kapsid proteiner å forutsi potensielle rester målrettet av antivirale forbindelser. Disse analysene bør bidra i identifisering av kandidat antivirale midler som virker på viral oppføring. Fremtidige retninger kan utforske disse mulige hemmere for videre narkotika utvikling.
Introduction
Hånd-, fot-og munn sykdom (HFMD) er en sykdom som oftest forårsakes av coxsackievirus A16 (CVA16) og enterovirus 71 (EV71) hos små barn. Nylig over Asia-Pacific-regionen, har det vært en betydelig uptick i CVA16-indusert HFMD. Mens symptomene kan være milde, kan alvorlige komplikasjoner oppstå som påvirker hjernen og hjertet, med potensiell dødsulykke1,2. I dag er det ingen lisensierte antivirale behandlinger eller vaksiner tilgjengelig for CVA16, og dermed er det et presserende behov for å utvikle antivirale strategier for å dempe fremtidige utbrudd og tilhørende komplikasjoner.
CVA16 er en ikke-innhyllet virus som har en icosahedral kapsid samlet fra pentamers at hver inneholder 4 strukturelle proteiner nemlig VP1, VP2, VP3, og VP4. Omringe hver fem ganger aksen i pentamer er en "Canyon"-regionen som viser som en depresjon og er kjent for sin rolle i reseptor binding3. På bunnen av denne Canyon ligger en hydrofobe lomme i VP1 regionen som inneholder en naturlig fet ligand navngitt sfingosin (SPH). Cellular reseptorer, som menneskelige P selectin glykoprotein ligand 1 (PSGL-1) og renovasjonsarbeider reseptor klasse B-medlem 2 (SCARB2), har blitt foreslått å spille en rolle i viral bindende ved å fortrenge dette ligand som resulterer i conformational endringer i kapsid og påfølgende utstøting av viral Genova inn i Host Cell4,5,6. Identifisering mulig hemmere som blokkerer påfølgende hendelser i viral oppføring prosessen kunne gi potensielle terapeutiske strategier mot CVA16 infeksjon.
Trinnene i viruset livssyklus kan bli dissekert gjennom eksperimentelle tilnærminger som mål for å identifisere modus-spesifikke antivirale midler. En tid-av-stoff-tillegg analyse undersøker stoffet behandling effekt på ulike tidspunkter under viral infeksjon, inkludert pre-Entry (lagt før virus infeksjon), oppføring (lagt samtidige til virus infeksjon), og post-Entry (lagt etter virus infeksjon)7. Virkningen kan vurderes ved hjelp av en standard plakk analysen ved kvantitere antall viral plaketter dannet i hver av behandlings forhold. Flyten flowcytometri-baserte viral bindende analysen avgjør om stoffet hindrer viral vedlegg til vert celler. Dette oppnås ved å flytte temperaturen fra 37 ° c, der flertallet av humant virusinfeksjoner oppstår, til 4 ° c, der virions er i stand til å binde til verts celleoverflaten, men ikke kan gå inn i cellene7. Virus partiklene som er bundet til cellemembranen blir deretter kvantifisert gjennom immunostaining mot viral antigener og vurderes av strømnings flowcytometri. Den viral inaktive analysen på den annen side bidrar til å vurdere potensielle fysiske interaksjoner av stoffet med gratis virus partikler, enten skjerming eller nøytralisere virions, eller forårsaker samlinger eller conformational endringer som gjør dem inaktive for påfølgende interaksjoner med verts celleoverflaten under infeksjonen8,9. I dette eksperimentet, viral inokulum er lov til å først ruge med stoffet før de blir fortynnet til titrere ut stoffet før infisere verten celle monolag og utføre en standard plakk analysen8. Til slutt, molekylær docking er et kraftig verktøy for å forutsi potensielle narkotika interaksjon nettsteder på virionet overflaten, inkludert viral glykoproteiner fra innhyllet virus og viral kapsid proteiner fra ikke-innhyllet virus, ved hjelp av beregningsorientert Algoritmer. Dette bidrar til å mechanistically mål av stoffets handlings modus og gi nyttig informasjon som kan bli ytterligere validert av nedstrøms analyser.
Vi har nylig ansatt ovenfor beskrevet metoder for å identifisere antivirale forbindelser som effektivt blokkerte smitte av ikke-innhyllet CVA169. I dette dokumentet beskrives og diskuteres de detaljerte protokollene som ble brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: All cellekultur og virusinfeksjoner må gjennomføres i sertifiserte biosafety hetter som passer for biosafety nivået av prøvene som håndteres. De to tannin-klassen av små molekyler chebulagic syre (CHLA) og punicalagin (PUG), som ble observert for å effektivt blokkere CVA16 infeksjon9, brukes som eksempler på kandidat hemmende midler. For grunnleggende prinsipper i Virology teknikker, virus forplantning, fastsettelse av virus titer, og konsepter av plakk forming enheter (PFU) eller mangfoldet av smitte (MOI), leseren er referert til referanse10.
1. Cell kultur, virus forberedelse, sammensatte forberedelser, og sammensatte cytotoksisitet
- Humant rhabdomyosarcoma (RD) celler er vert celler ettergivende til CVA16 infeksjon11. Vokse RD cellene i 10 mL Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), 200 U/mL penicillin G, 200 μg/mL Streptomycin, og 0,5 μg/mL amfotericin B i T-75 flasker ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator.
- Forbered CVA16 ved å spre viruset i RD-celler og Bestem viral titer i PFU/mL. For optimert protokollen, behage henviser til henvisning11.
- Klargjør test forbindelsene og-kontrollene ved hjelp av sine respektive løsningsmidler: for eksempel oppløse CHLA og PUG i dimethyl sulfoxide (DMSO). For alle infeksjon skritt, det basal medium besto av DMEM pluss 2% FBS og antibiotika.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av DMSO i testen sammensatte behandlinger er lik eller under 0,25% i forsøkene; 0,25% DMSO er inkludert som en negativ kontroll behandling i analysene for sammenligning. - Utføre cytotoksisitet analysen av test forbindelser på RD cellene ved hjelp av en celle levedyktighet bestemme reagens som XTT ((2, 3-BIS [2-metoksy-4-Nitro-5-sulfophenyl] -5-phenylamino)-karbonyl]-2H-tetrazolium natriumhydroksid). For detaljert protokoll, Vennligst referer til referanse12. Bestem cytotoksisitet konsentrasjoner av test forbindelser ved hjelp av en analytisk programvare som GraphPad Prism henhold til produsentens protokoll. Legemiddel konsentrasjoner som ikke signifikant påvirker celle levedyktigheten (≥ 95% levedyktige celler) brukes for resten av studien.
2. tid-av-stoff-tillegg analysen
-
Å evaluere påvirkning av narkotika på verts celler før viral infeksjon (forbehandling)
- Seed RD celler i 12-brønn plater på en seeding tetthet på 2 x 105 celler/brønn. Ruge over natten ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator for å få en monolag.
- Behandle RD-celler med test forbindelser ved ikke-cytotoksisk konsentrasjoner (bestemmes fra trinn 1,4) i 1 mL basal medie volum for 1 t eller 4 timer.
- Vask celler med 1-2 mL PBS før du legger 50 PFU/brønn av virus i basal medium (det endelige volumet av inokulum er 300 μL) for 1 h. rock platen hver 15 min.
- Etter infeksjonen, vask monolagere igjen ved hjelp av PBS, deretter overlegg med 1 mL av basal medier som inneholder 0,8% methylcellulose for ytterligere inkubasjons ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator.
- Etter 72-inkubasjons, Fjern overleggs mediene og vask brønnene med 2 mL PBS.
- Fest brønnene ved hjelp av 0,5 mL 37% formaldehyd i 15 min.
- Fjern supernatanten og vask på nytt ved hjelp av PBS.
- Beis brønnene med 0,5 mL 0,5% krystall fiolett oppløsning. Fjern deretter flekken løsningen innen 2 min og vask brønnene med en svak strøm av vann før lufttørking.
- Telle viral plaketter ved å plassere platen på en hvit-lys boks. Beregn prosenten (%) CVA16 infeksjon som følger: (Mean # av plakk virus + narkotika /mener # av plakk virus + DMSO-kontroll) × 100%.
-
Å evaluere effekten av å legge narkotika og viruset samtidig (co-tillegg)
- Seed RD celler i 12-brønn plater på en seeding tetthet på 2 x 105 celler/brønn. Ruge over natten ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator for å få en monolag.
- Behandle RD-celler med test forbindelsene i de aktuelle konsentrasjonene og 50 PFU/brønn av CVA16 (endelig volum av inokulum er 300 μL) samtidig for 1 h. rock platen hver 15 min.
- Vask celler med 1 mL PBS og deretter overlappe med 1-2 mL basal medier som inneholder 0,8% methylcellulose for ytterligere inkubasjons ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator.
- Stain viral plaketter med krystall fiolett etter 72 h innlegg infeksjon og bestemme% CVA16 infeksjon som beskrevet ovenfor.
-
For å evaluere behandling effekt etter viral oppføring (post-smitte)
- Seed RD celler i 12-brønn plater på en seeding tetthet på 2 x 105 celler/brønn. Ruge over natten ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator for å få en monolag.
- Vaksinere RD cellene med 50 PFU/brønn av CVA16 (endelig volum av inokulum er 300 μL) for 1 h. rock platen hver 15 min.
- Vask brønnene med 1-2 mL av PBS og overlapp cellene med basal medier som inneholder 0,8% methylcellulose og egnede konsentrasjoner av test forbindelser.
- Stain viral plaketter med krystall fiolett og telle etter 72 h innlegg infeksjon og bestemme% CVA16 infeksjon incubations beskrevet ovenfor.
Merk: Utfør alle PBS-vasker forsiktig for å unngå å løfte cellene.
3. Flow flowcytometri-basert bindende analysen
- Seed RD celler i 12-brønn plater på en seeding tetthet på 2 x 105 celler/brønn. Ruge over natten ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator for å oppnå en monolag.
- Pre-chill cellen monolag ved 4 ° c for 1 t.
- Infisere RD celler med CVA16 (MOI = 100) i nærvær og fravær av test forbindelser for 3 t ved 4 ° c.
Merk: Utfør viral inoculation på is og den påfølgende inkubasjons i et kjøleskap på 4 ° c for å opprettholde temperaturen ved 4 ° c, som tillater viral binding, men ikke inngang. - Fjern virus inokulum og vask en gang med 1-2 mL iskald PBS.
- Løft celler ved å legge 1 mL iskald dissosiasjon buffer til brønnene på isen i 3 min, før du samler cellene og blanding dem i iskald flyt flowcytometri buffer (1x PBS pluss 2% FBS).
- Vask celler to ganger ved hjelp av iskald Flow flowcytometri buffer og fikse cellene med 0,5 mL 4% paraformaldehyde i 20 min på isen.
- Vask cellene ved hjelp av PBS for å fjerne ubundne eller svakt bundne virus, og deretter beis cellene med 1 mL anti-VP1-antistoff (1:2000; fortynnet i PBS med 3% BSA) på is for 1 time, etterfulgt av inkubasjons med en sekundær Alexa 488-bøyd anti-mus IgG (1:250; fortynnet i PBS med 3% BSA) på is for 1 t. Utfør PBS-vasken (3 ganger) etter hver antistoff behandling.
- Resuspend cellene i 0,5 mL av iskald flyt flowcytometri buffer og utføre flyt flowcytometri analyse på en flyt flowcytometer ved hjelp av standard prosedyrer. Presentere data i histogrammer ved hjelp av tilhørende programvare og quantitate for søylediagram representasjon.
4. viral inaktive analysen
-
Utfør viral inaktive analysen som tidligere beskrevet12 ved hjelp av følgende vilkår:
-En start konsentrasjon på 106 PFU/ml CVA16.
-RD celle monolagere i 12-brønn plater fra en seeding tetthet på 2 x 105 celler/brønn.
-50-fold fortynning for titrating ut stoffet forbindelser som resulterer i en endelig virus konsentrasjon av 50 PFU/well.
-Vask trinnene med 1-2 mL PBS.
-Overlay medier som inneholder 0,8% methylcellulose. - Utfør endelige avlesning av viral infeksjon ved hjelp av krystall fiolett farging av viral plaketter prosedyre som beskrevet ovenfor.
5. molekylær docking analyse
- Last ned 3D molekyler av test forbindelser fra PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Hvis molekylene ikke har en 3D-struktur lastet opp, Last ned 2D-strukturene eller bruk smil-streng sekvensen og forvandle seg til 3D-molekyler via et molekyl program (f.eks. CORINA).
- Last ned viral biologisk montering enhet fra RCSB protein data bank (https://www.rcsb.org/) og forberede viral strukturmodell ved hjelp av et biocomputing program (f. eks UCSF Chimera). For eksempel når det gjelder CVA16 eldre virionet krystallstruktur (PDB: 5C4W)3, slette løsningsmidler fra pdb-filen, erstatte ufullstendige side kjeder ved hjelp av data fra Dunbrach 2010 Rotamer-biblioteket, og legge til bygget og kostnader til strukturen som tidligere rapportert13. Forankrings mål kan være alle relevante virus proteiner for den tiltenkte analysen med biologisk samlingsinformasjon (protein data bank).
-
Dock test forbindelser på forberedt virus enhet ved hjelp av for eksempel UCSF chimera, og analysere utdatafiler med en visualisering programvare (f. eks Autodock Vina, PyMol):
- Last opp test sammensatte filen inn UCSF Chimera som "ligand" og utføre blind docking ved å velge hele forberedt viral protein som "reseptoren". Bruk datamaskin musen eller styreflaten til å endre størrelsen på søkevolumet til hele "reseptoren". I avanserte alternativer, la antall bindings moduser være på maksimum. Forankrings RAM mer blir automatisk rangert fra høyest til lavest bindende energi.
- Valgfritt Videre til blind dokking, begrense docking nettstedet til viral protein i områder av interesse avledet fra blinde docking resultater ved hjelp av musen eller styreflaten igjen for å redusere søkevolum (f. eks, 100 å x 100 å x 100 å). Dette trinnet bidrar til å bekrefte blinde docking resultater og øker spesifisitet.
- Bruk et molekyl grafikk system (f.eks. PyMol) til å analysere posisjonene til bindings modusene ved å laste opp dokking filen. Finn Polar kontakter fra sammensatt til viral protein ved å velge "ligand" og identifisere Polar kontakter med alternativet "til noen atomer"; undersøke resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tiden-av-stoff-tillegg analysen er angitt i figur 1 og viser påvirkning fra behandling ved hjelp av små molekyler CHLA og PUG på CVA16 infeksjon enten pre-viral oppføring (forbehandling), under viral oppføring (co-tillegg), eller post-viral oppføring ( etter infeksjon). Begge små molekyler produserte bare marginal påvirkning mot CVA16 infectivity enten i forbehandling av verten cellene før viral infeksjon (figur 1a) eller i post-infeksjon behandling (figur 1C). I kontrast avskaffet CHLA og PUG CVA16-infeksjonen effektivt med > 80% i tilleggs behandlingen (figur 1B). Disse observasjonene derfor tyder på at de to forbindelsene er mest effektive når de er samtidig til stede med viruset partikler på verten cellen overflaten under infeksjonen.
I figur 2, flyten flowcytometri binding analyse (skjematisk illustrert i figur 2a) bekrefter at de to tanniner hindre CVA16 oppføring ved å hindre viral partikkel binding til verten cellene. Den kvantifisering data i figur 2b viser at mengden av virus oppdaget på RD celleoverflaten i nærvær av de to stoffene, er mindre enn 10%, ligner på heparin positiv kontroll som er kjent for å hindre CVA16 vedlegg14. Figur 2C, 2Dog 2e skildrer den tilknyttede flyten flowcytometri histogrammer der bandet skiftet på grunn av påvisning av CVA16 på RD celleoverflaten er betydelig redusert når CHLA og pug er til stede.
Figur 3a avbilder hvordan viral inaktive eksperimentet ble utført. Stoffet sammensatte var enten blandet med CVA16 virus partikler og inkubert for 1 time (lang sikt) før fortynning trinn, eller blandes og umiddelbart fortynnet (kortsiktig) før infeksjonen. Som vist i figur 3b, førte en pre-INKUBASJONS av CV16-partiklene med test agentene for 1 t til en nær fullstendig beskyttelse av RD-cellene mot viral infeksjon sammenlignet med kortsiktige INKUBASJONS og DMSO-kontrollen. Resultatene tyder derfor på at både CHLA og PUG samhandler med CVA16-partiklene og er i stand til å gjengi dem inaktive i den påfølgende infeksjonen.
Siden våre data tyder på at stoffet forbindelser kan direkte deaktivere CVA16 partikler, og dermed identifisere virionet seg som et sannsynlig mål for deres antiviral aktivitet, brukte vi molekylær docking å forutsi potensialet interaksjon (e) mellom disse agenter og CVA16 kapsid pentamer. Figur 4a viser en overflate projeksjon av CVA16-pentamer som utgjør den icosahedral KAPSID til CVA16-virionet. Molekylær docking av tanniner CHLA (figur 4b, grønn) og PUG (figur 4c; blå) tyder på at de begge er spådd å binde i Canyon-regionen i CVA16 pentamer. Nærmere bestemt, både små molekyler bundet like over lommen inngangen (figur 4b og 4c, zoomet paneler), som holder lommen faktor og spiller en viktig rolle for formidling CVA16 bindende og inntreden i verten cellen. Både CHLA og PUG ser derfor ut til å maskere lomme inngangs regionen, som teoretisk sett ville hindre interaksjoner mellom virus partiklene og verts celle reseptorene. Figur 4d og 4e indikerer den unike rester spådd fra polare kontakter av CHLA og PUG, henholdsvis rundt lommen inngangen, med de fleste av disse interaksjoner oppstår med VP1 for både forbindelser og 3 aminosyrer ASN85 , Lys257, og ASN417 å være i felles mellom de to tanniner.
Figur 1: time-of-Drug-tillegg effekt av CHLA og PUG mot CVA16 infectivity. RD-celler ble behandlet med CHLA (20 μM) eller PUG (25 μM) på forskjellige tider av CVA16 inoculation (50 PFU/Well). DMSO (0,25%) behandling ble inkludert som negativ kontroll og alle analysene ble analysert av plakk analysen ved hjelp av krystall fiolett farging 72 h etter inkubasjons. (A) for forbehandling, celler ble inkubert med test forbindelser for 1 t eller 4 timer og deretter ble VASKET før CVA16 infeksjon. (B) for co-tillegg analyser, celler ble administrert med narkotika og virus samtidig for 1 time og deretter vasket. (C) i post-smitte, celler ble SMITTET med CVA16 for 1 time, vasket, og deretter behandlet med test forbindelser. Data som vises er midlene ± standardavvik (SD) fra tre uavhengige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med den respektive ' virus bare ' gruppe. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis analyse av varians. Dette tallet er tilpasset fra referanse9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: CHLA og PUG AVSKAFFE CVA16 binding til verts cellen. (A) skjematisk av flyten flowcytometri bindende analysen. (B) RD celler (2 x 105 celler/brønn) ble SMITTET med CVA16 (Moi = 100) i nærvær eller fravær av CHLA (20 μm), pug (25 μm), løselig heparin (500 μg/ml, positiv kontroll), eller DMSO (0,25%, negativ kontroll) for 3 h ved 4 ° c. Inocula fra brønner ble samlet inn i rør, vasket med PBS to ganger, fast, og farget med anti-VP1 antistoff etterfulgt av Alexa 488-bøyd sekundært antistoff for flyt flowcytometri deteksjon av overflate bundne virus. Kvantifisert data fra de oppdagede fluorescens signalene ble plottet som middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter i søylediagram som ' virus binding (%) '. *p < 0,05 sammenlignet med ' DMSO ' kontroll behandling. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis analyse av varians. Representanten flyt flowcytometri histogrammer av CHLA (C), pug (D), og heparin (E) behandlinger er vist. Dette tallet er tilpasset fra referanse9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: CHLA og PUG deaktiverer celle frie CVA16 virus partikler. (A) skjematisk av viral inaktive analysen. (B) CVA16 (106 PFU/brønn) ble behandlet med CHLA (20 μm) eller pug (25 μm) og blandet umiddelbart for kortvarig deaktivering eller inkubert for 1 time ved 37 ° c for lang tids deaktivering før den ble fortynnet 50-fold til en ikke-effektiv konsentrasjon av test forbindelser før vaksinere på RD celler (endelig virus konsentrasjon = 50 PFU/Well). DMSO (0,25%) ble brukt som en negativ kontroll. Eksperimenter ble analysert av plakk analysen ved hjelp av krystall fiolett farging 72 h post-smitte. Data som vises er midlene ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med den respektive ' virus bare ' gruppe. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis analyse av varians. Dette tallet er tilpasset fra referanse9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: CHLA og pug er rettet mot CVA16-kapsid nær lomme inngangen. Overflate projeksjon av CVA16 virionet partikkel med monomere strukturelle pentamer avgrenset av røde linjer (A). Ytterligere pentamers på virionet er vist i cyan, magenta, Indigo, bronse og grønn. Molekylær docking analyse av CHLA (B, grønn) og PUG (C, blå) på CVA16 PENTAMER (pdb: 5C4W); forstørrede panelene er avgrenset i gult. VP1 = oransje, VP2 = grå, VP3 = hvit; Polar kontaktene vises som svarte streker. Rester som sminke lomme inngangen er farget rød (Ile94, ASP95, Gln207, møtte212, møtte213, lys257, THR258). D, E. Nærbilde sideutsikt inn i juvet der lommen inngangen er plassert og hvor CHLA (D) og PUG (E) bind til. Unike rester som er polare kontakter fra forbindelsene ' Polar kontaktene på pentamer er merket i gult (VP1), hvit (VP2), og i svart (VP3) skrifter. Den hvite stiplede linjen indikerer lomme inngangs regionen. Dette tallet er tilpasset fra referanse9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten, beskrev vi protokollene som er nyttige for identifisering av antivirale kandidater som mål viral oppføring, spesielt mot ikke-innhyllet CVA16. Analysene er utformet på måter å analysere de tidlige hendelsene under viral oppføring, noe som er nyttig å avklare mekanismen (e) av handlingen og potensielle mål (er) av test agentene ' antiviral aktivitet. The ' time-of-Drug-tillegg analysen ' tillater å bredt bestemme potensialet målet av testen forbindelser, for eksempel infisert verten celler (forbehandling analyse), viruset partikler eller dens interaksjon med verten celleoverflaten (co-tillegg analyse ), eller den virusinfiserte verten celle under viral replicative fase (post-infeksjon analyse). Denne analysen alene kan bestemme metoden for samhandling fra forbindelsene (f. eks co-tillegg) som fører til påfølgende analyser beskrevet i denne protokollen (for eksempel viral inaktive analysen og bindende analyse). Vasketrinn er avgjørende for å sikre at behandlingsmetoden undersøkt er spesifikk for en analysert. Bruken av ' Flow flowcytometri binding analysen ' bidrar til å vurdere påvirkning av forbindelsene spesielt på virus binding til verten cellen. Opprettholde temperaturen på eksperimentet ved 4 ° c er viktig for den endelige oppdagelsen av virions på celleoverflaten, da denne temperaturen tillater viral binding, men ikke oppføring. The ' viral inaktive analysen ' kan hjelpe til å bestemme potensiell fysisk interaksjon av stoffet forbindelser med celle-frie virus partikler. Det kritiske trinnet er fortynning for titrating ut stoffet forbindelsene etter inkubasjons med viral inokulum, da dette er nødvendig for å hindre enhver meningsfull interaksjon av narkotika med verten celleoverflaten i den påfølgende infeksjonen trinn12.
Siden viral oppføring er en multi-trinns hendelse, en viral oppføring inhibitor klasse av antivirale midler kunne utøve flere typer mekanismer, inkludert: (1) modulerende celleoverflaten oppføring faktorer/reseptorer eller tilhørende signalnettverk trasé; (2) påvirker cellemembranen flyt eller integritet; (3) rettet mot elektrostatiske eller Van der Waals interaksjoner mellom virus partikler og verts celleoverflaten; (4) indusere fysiske endringer i virions som partikkel brudd eller aggregering; (5) binding til viral glykoproteiner eller kapsid proteiner og forebygge deres funksjoner eller conformational endringer; (6) blokkering Fusion tilhørende mekanismer; og (7) forhindre løslate av viral Genova innenfor det vert cellen. Analysene som er beskrevet i denne rapporten, kan derfor hjelpe til med å peke på de ovennevnte potensielle handlings modusene som ytterligere kan valideres av flere eksperimenter. Endelig er det ' molekylær docking analyse ' beskrevet her er medvirkende til å forutsi potensielle interaksjon regioner mellom stoffet forbindelser og viruset partikler, og som sådan kan bidra til å identifisere kandidat viral kapsid eller glykoprotein bindemidler og målrettede rester på viruset partikler. Men disse spådommer er avhengig av docking programvare, og oppløsningen og nøyaktigheten av viral protein krystallstrukturer. Det er viktig å merke seg at den valgfrie begrenset docking-metoden i trinn 5.3.2 ble lagt til fordi ofte når du bruker viral strukturelle proteiner som "reseptoren" molekyl, kan ligand muligens binder seg til regioner normalt ikke tilgjengelig eller eksponert på overflaten ( f. eks, under overflaten av virionet kapsid vendt mot innsiden av virionet, transmembrane regioner av konvolutt glykoproteiner, etc.). Confining søkeboksen tillater bare tilgjengelige områder av viral protein å være målrettet og regler ut eventuelle urealistiske interaksjoner. Molekylær docking er avhengig av krystallisert strukturer, men nylige fremskritt i homologi modellering har aktivert analyse av ikke-krystallisert strukturer ved å tilpasse sin aminosyre sekvens på et nært beslektet krystallisert struktur15. Dette har gjort det mulig å analysere flere strukturer og informasjonen som er ervervet kan være nyttig for videre studier, inkludert mutational analyser som kan bidra til å validere spådde interaksjoner.
I konklusjonen, analysene og protokollene som er beskrevet i denne rapporten er spesielt rettet mot å identifisere kandidat antivirale midler som mål viral oppføring, og gi informasjon om hvilke trinn i viral oppføring prosessen test agent mål til, om de samhandle med gratis virus partikler, og forutsi mulige stoff interaksjon nettsteder på virions. Disse typer analyser kan gjentas på andre ikke-innhyllet virus eller tilpasset innhyllet virus som en metode for screening antiviral stoffet forbindelser for mulige hemmere av viral oppføring. Ved hjelp av en slik mekanisme-drevet tilnærming for å identifisere antivirale kandidater kunne hjelpe fremskynde stoffet utviklingsprosessen og utvide omfanget av antivirale legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Dr. Joshua Beckham ved University of Texas i Austin for teknisk støtte med molekylær docking. Denne studien ble delvis støttet av finansiering fra departementet for vitenskap og teknologi i Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 til C.-JL og L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 og MOST107-2320-B-038-034-MY3 til L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M.
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
