Summary
Målet med denne protokollen er å oppdage ulike perfringens toxinotypes i lokalt kjøpte matvarer, spesielt Epsilon gift produserer belastningstyper B og D, uten bruk av anaerobe kamre.
Abstract
Perfringens (C. perfringens) er en produktiv gift produsent og forårsaker et bredt spekter av sykdommer i ulike verter. C. perfringens er kategorisert i fem forskjellige Toxinotypes, A til E, basert på befordring av fire store gift gener. Utbredelsen og fordelingen av disse ulike toxinotypes er lite studert, spesielt deres Gjennomtrengningskraft i amerikansk detaljhandel mat. Av spesiell interesse for oss er typen B og D stammer, som produserer Epsilon gift, en ekstremt dødelige giftstoffer foreslått å være miljømessig utløse multippel sklerose hos mennesker. For å evaluere tilstedeværelsen av forskjellige C. perfringens toxinotypes i ulike matvare prøver, utviklet vi en enkel metode for å selektivt kultur disse bakteriene uten bruk av en anaerob container system bare involverer tre dyrking trinn. Mat kjøpes fra lokale dagligvarebutikker og transporteres til laboratoriet under omgivelsesforhold. Prøvene er hakket og inokulert i modifiserte raske perfringens medier (RPM) og inkubert over natten ved 37 ° c i et forseglet, lufttett konisk rør. Overnatting kulturer er inokulert på et nederste lag av solid Tryptose sulfitt Cycloserine (TSC) agar, og deretter kledde med et øverste laget av smeltet TSC agar, og skaper en "klemt", anaerob miljø. Agar platene er inkubert over natten på 37 ° c og deretter evaluert for utseende av svarte, sulfitt-reduserende kolonier. C. perfringens-mistenkte kolonier er fjernet fra TSC agar ved hjelp av sterile øye droppers, og INOKULERT inn RPM og sub-kultivert overnatting ved 37 ° c i en lufttett konisk rør. DNA er Hentet fra RPM under kultur, og deretter analysert for tilstedeværelsen av C. perfringens gift gener via polymerase kjedere reaksjon (PCR). Avhengig av type mat samplet, typisk 15-20% av prøvene teste positivt for C. perfringens.
Introduction
Perfringens (C. perfringens) er et gram positivt, anaerob, spore-forming, stang formet bakterie som er funnet overalt i miljøet. Denne arten av bakterier bærer gener som koder for over 17 giftstoffer og, historisk, har vært karakterisert i fem toxinotypes (A-E) basert på tilstedeværelsen av fire forskjellige gift gener: alpha, beta, Epsilon, og iota gift (tabell 1)1. Nylig har det blitt antydet at dette skrive-ordningen må utvides til å omfatte typer F og G, som havna i C. perfringens ENTEROTOKSIN (CPE) og NetB gift, henholdsvis2. Men mer forskning er nødvendig før dette utspekulerte systemet er formelt akseptert. Mens alfa giften genet er strengt chromosomally plassert, kan CPE genet finnes både på kromosom og plasmider. Til sammenligning er de resterende giftstoffer ' gener finnes på ulike forskjellig størrelse plasmider. Vi er spesielt interessert i utbredelsen av C. perfringens typer B og D som disse stammene produsere Epsilon gift, en svært potent, pore-forming gift, som har blitt foreslått å spille en rolle i å utløse multippel SKLEROSE (MS) hos mennesker3 ,4,5,6,7. Hvordan folk blir smittet eller kolonisert av disse stammer er ukjent. En mulig forklaring er gjennom inntak av forurensede matvarer. For å bidra til å besvare dette spørsmålet, forsøkte vi å bestemme utbredelsen av ulike C. perfringens Toxinotypes i amerikansk mat prøver.
Tilstedeværelsen av C. perfringens toxinotypes i amerikanske matvare prøver er lite studert og krever ofte bruk av anaerobe container systemer og mange sub-dyrking trinn8,9,10,11 . Selv om mange dyrking trinn er nødvendig for å oppnå renset isolat, kan denne metoden føre til tap av plasmider over tid12,13,14, muligens påvirker påvisning av plasmider-borne gift gener inkludert Epsilon giften genet. Vi forsøkte å utvikle en enkel metode, med færre sub-dyrking trinn, til selektivt kultur C. perfringens uten bruk av anaerobe kamre, krukker, eller vesker. Kort, matvare prøver er inokulert i Rapid Perfringens Media (RPM) over natten (ON), deretter "klemt" inn TSC agar og inkubert ON. Kolonier mistenkt for å være C. perfringens er deretter sub-KULTIVERT i RPM og INKUBERT igjen på. DNA er ekstrahert og PCR utføres for å bestemme genotype (figur 1). Vi valgte å bruke RPM som det har vist seg å øke utvinningen av C. perfringens stammer fra matvare prøver sammenlignet med andre mer standard Media15. I tillegg ble RPM vellykket brukt til å isolere en Epsilon gift som produserer type B-stamme fra en MS pasient4. Vi bruker en modifisert versjon av RPM i stedet for den opprinnelige versjonen for å tillate enkel DNA-ekstraksjon. Selv om denne metoden gir enkel identifisering av gift gener i prøver, er det mulig at en enkelt prøve vil inneholde mer enn en C. perfringens toxinotype. Fordi vår metode ikke isolere renset stammer ved hjelp av flere runder med rensing, er identifisering av flere toxinotypes fra en prøve ikke mulig. Men, standard rensing teknikker (vanligvis striper på TSC plater eller blod agar plater) kan brukes på slutten av vår protokoll for å oppnå renset kulturer.
Protocol
Merk: C. perfringens regnes som en biosafety fare nivå 2 (BSL2) organisme. Selv om ikke alle mat prøvene vil inneholde C. perfringens, bør alle kultur prøver behandles som sådan. Alle riktige forholdsregler og personell verneutstyr (PPE) skal brukes til enhver tid. Decontaminate alt materiale før avhending.
1. Forbered endret RPM4,15
- Kombiner 30 g/L Fluid tioglykolat medium, 60 g/L gelatin, 5 g/L peptone, 5 g/L glukose, 5 g/L kalium fosfat dibasic, 3 g/L gjærekstrakt, 1,5 g/L natriumklorid, 0,5 g/L jernholdige sulfat i deionisert vann til jevnt fordelt. Vi lager vanligvis 1 L-batcher.
- Autoklav ved 121 ° c i 15 min.
- Avkjøl til ca. 40 ° c.
- Når RPM er kult, legger D-Cycloserine til en endelig konsentrasjon av 440 mg/L.
Merk: lager konsentrasjoner av D-Cycloserine oppløst i sterilt vann ved 50 mg/mL kan oppbevares ved-20 ° c for fremtidig bruk. - Aseptisk overføring 10 mL RPM til 15 mL koniske rør. RPM kan fremstilles i grupper og lagres ved 4 ° c i opp til en måned.
- Varm RPM til 37 ° c før bruk.
2. sample samling og RPM inkubasjons
- Transport mat til laboratoriet under omgivelsestemperaturer innen 1 time. mat kan transporteres i originalemballasjen eller i sterile beholdere. Hvis det ikke testes umiddelbart, kan mat oppbevares ved-20 ° c til bruk. Noter hvilken type mat og opprinnelsesland i henhold til emballasjen etiketten, hvis tilgjengelig, samt annen relevant informasjon.
- Fjern ca. 1,0 – 2,0 g mat og Overfør til steril Petri-rett eller tilsvarende. Fin hakke med et sterilt barberblad eller skalpell.
- Vaksinere i 10 mL fosfat bufret saltvann (PBS) i et 15 mL konisk rør. Bland godt.
- Hvis du vil velge for vegetative celler, overfører du 5 mL PBS-Food-blandingen til en 15 mL konisk slange som inneholder 10 mL RPM. Fest lokket godt.
- For å velge for sporer, varme de resterende 5 mL PBS-mat blanding ved 85 ° c i 15 min og deretter overføre til en 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL av RPM. Fest lokket godt.
- Vortex og invertere mat-RPM kulturer for å sikre fullstendig miksing.
- Tett forsegle koniske rør og pakk lokk med para fin film eller plastfolie for å sikre et anaerob miljø.
- Ruge over natten (ON) ved 37 ° c.
- Følgende morgen notatet noen turbiditet eller gjæring i RPM rør.
3. TSC "sandwich" plating
- Vaksinere på RPM kulturer i TSC agar ved hjelp av en "sandwich" teknikk (figur 2) beskrevet nedenfor.
- Klargjør TSC agar i henhold til produsentens anvisninger.
- Forbered basislaget av TSC platene ved å overføre 10 mL av smeltet TSC agar til sterile Petri retter og la stivne. Disse kan tilberedes i Avansert og oppbevares ved 4 ° c. Sørg for at platene varmes til romtemperatur før bruk.
- For det øverste laget av TSC-platen, opprettholder du de resterende smeltet TSC agar ved 40 ° c.
Merk: selv om agar Smeltepunkt er over 85 ° c, vil smeltet agar stivner rundt 32 – 45 ° c.
- Nøye hente på RPM kulturer og overføre 100 μL til TSC agar base. På grunn av gjæring, kan noen kulturer være under press. Pass på å bruke alt egnet PPE.
- Spre RPM-inokulum ved hjelp av sterilisert glassperler eller celle spredning.
- Tillat RPM å bli "absorbert" i TSC agar for 5-10 min ved romtemperatur.
- Overfør forsiktig 20 mL av smeltet, 40 ° c TSC agar til plate ved hjelp av en serologisk pipette.
- Erstatte Petri parabolen lokket og la TSC agar å helt stivne ved romtemperatur.
- Vend Petri-fatet og ruge ved 37 ° c på.
- Hvis seriell fortynninger er ønsket, utføre fortynninger av på RPM kulturer i frisk, pre-varmet RPM før inoculation inn TSC agar.
4. sub-dyrking av sulfitt-reduserende kolonier
- Neste morgen, fjerne plater fra inkubator og undersøke for bakteriell vekst. Aerobe bakterier kan være til stede på overflaten av agar. Anaerob bakterier vil bli funnet vokser innebygd i agar. Sulfitt-reduserende bakterier vil snu rundt agar svart. Mulig C. perfringens koloniene vil være svart og innebygd i agar.
- C. perfringens mistenkte kolonier vil være positivt for sulfitt reduksjon og vil vises svart, innebygd i agar. Ved hjelp av en steril, en gangs pipette, "plukke" de svarte koloniene fra agar og overføre til 10 mL fersk RPM i et 15 mL konisk rør. Det er viktig at luften fra pipetteverktøyet bli utvist før piercing agar.
- Hvis det er en tett mengde aerob bakterievekst på overflaten av platen, bruk en steril celle skraper for å fjerne kolonier fra utvalgte områder. Flere C. perfringens mistenkte kolonier kan samples fra samme TSC plate i separate RPM kulturer.
- Tett sikre koniske rør lokk og pakk i para fin film eller plastfolie. Ruge ON ved 37 ° c.
5. DNA-ekstraksjon
- Fjern ON RPM kulturer og undersøke om tegn på vekst, inkludert turbiditet og gjæring.
- Vend forsiktig RPM kultur for å spre eventuelle bosatte bakterier og nøye åpne. Overfør 1 mL av kulturen til en mikrosentrifugen tube.
- Sentrifuger i toppfart (ca. 15 000 x g) for 10 min til pellets bakterier.
- Vask pellet med 1 mL sterilt PBS.
- I noen tilfeller vil ufordøyd gelatin bosette seg på toppen av pelleted bakterier. For å fjerne gelatin, "fluff" av gelatin ved forsiktig agitating med PBS bruker en micropipette. Dette vil "fluff-up" gelatin mens du forlater bakteriell pellet intakt.
- Fjern PBS-gelatin blandingen med skånsom aspirasjon. Re-suspendere resterende bakteriell pellet med 1 mL fersk PBS.
- Sentrifuger resuspendert bakteriell pellet i toppfart på 10 min og nøye aspirer supernatanten.
- Umiddelbart utføre DNA-ekstraksjon ved hjelp av en DNA-ekstraksjon Kit og en protokoll spesielt opprettet for utvinning DNA fra gram-positive bakterier (se tabell over materialer).
- Bruk umiddelbart ut DNA eller Oppbevar ved-20 ° c til PCR-analyse.
6. påvisning av C. perfringens via PCR-genotyperingteknologi
- For å avgjøre om kulturer er positive for C. perfringens toxinotypes, UNDERSØK utvunnet DNA for ulike gift GENER via PCR.
Merk: fordi vi er mest interessert i Epsilon giftstoffer produsere stammer type B og D C. perfringens, evaluerer vi for tilstedeværelsen av Alpha, beta, og Epsilon gift gener. Primere er oppført i tabell 2. Primere for 16S ribosomal DNA brukes som en DNA-ekstraksjon kontroll. Ytterligere primere kan brukes til å teste for toxinotypes A til G og finnes i publisert litteratur2,12,13. - Bruk tidligere ekstrahert C. perfringens DNA som en positiv kontroll. Denne kontrollen sikrer at alle komponentene i PCR-reaksjonene fungerer. Vi bruker DNA Hentet fra C. perfringens type B (ATCC 3626) som vår positive kontroll. Grow ATCC 3636 ON i RPM ved 37 ° c og trekke ut DNA ved hjelp av de samme metodene som er beskrevet i trinn 5.1 – 5.7. Oppbevar utvunnet DNA ved-20 ° c til bruk.
- Angi PCR-betingelser som følger: 94,0 ° c i 3 min; 94,0 ° c i 30 s; 47,9 ° c i 30 s, 72,0 ° c i 1 min (gjenta trinn 2 – 4 for 35 sykluser); 72,0 ° c i 10 min.
- For å bekrefte PCR-produkter, Kjør PCR-reaksjoner på en 1,8 g/100 mL agarose gel med standard teknikker. Forventet PCR produkt størrelser er oppført i tabell 2. Typiske PCR-resultater vises i Figur 3.
Representative Results
Ved hjelp av denne metoden, 15-20% av våre samplet mat tester positivt for C. perfringens. Mens de fleste stammer er positive for toxinotype A, har vi lykkes oppdaget både type B og D i matvare prøver. I en tidligere publisert papir vi testet totalt 216 matvare prøver kjøpt fra New York butikkene16 (tabell 3). Disse prøvene inkluderte ulike kjøtt prøver (okse, lam, svinekjøtt og lam), fjærfe prøver (kylling og kalkun), og sjømat prøver (torsk, laks, skalldyr, snapper, flyndre, blekksprut, tilapia, tunfisk og diverse andre fisker). Produsere og meieri prøver ble også testet. Av 216 prøver, 34 (16%) var positive for C. perfringens. Av 34 C. perfringens positive prøver, 31 prøver (91,2%) inneholdt Alpha giften, en prøve (2,9%) inneholdt alfa-, beta-og Epsilon-giften, og to prøver (5,9%) inneholdt alfa-og Epsilon-giften.
Interessant, vi oppdaget også at C. perfringens var mer utbredt som vegetative celler sammenlignet med sporer. Tjuefem prøvene ble sammenlignet for tilstedeværelsen av vegetative C. perfringens celler eller sporer. Spores ble valgt for av varme sjokkerende prøver ved 85 ° c i 15 min. Av de 25 prøvene testet, var 16% positive for vegetative C. perfringens stammer versus 4% for sporer. Dette indikerer at det kan være mer kostnadseffektivt å teste for bare vegetative celler i stedet for begge.
Figur 1: oversikt over prosedyren.
Matvare prøver er hakket og fortynnet i steril PBS. Halvparten av PBS-mat prøven er inokulert i RPM å velge for vegetative celler. Den resterende PBS-mat prøven er varme sjokkert ved 85 ° c i 15 min å velge for sporer før inoculation i RPM. Kulturer er inkubert ON ved 37 ° c og deretter belagt til TSC agar. TSC agar er inkubert på på 37 ° c og svart, sulfitt-reduserende kulturer er sub-kultivert til frisk RPM. Sub-kultivert RPM kulturer er inkubert ON ved 37 ° c og DNA trekkes ut for å utføre genotyperingteknologi via PCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk av TSC agar sandwich teknikk.
RPM medier som inneholder C. perfringens bakterier er belagt mellom to lag av TSC agar for å fremme en anaerob miljø. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: valgte PCR-resultater.
Eksempel bilder av genotyperingteknologi resultatene av c. perfringens fra syv forskjellige typer mat, og en positiv kontroll av c. perfringens type B. En molekylvekt stige (første kjørefelt for hver gel) ble brukt til å anslå størrelsen av PCR resultater i Base parene (BP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Toxinotype | Alpha | Beta | Epsilon | Iota | Cpe | NetB | |
| Etablert | A | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Foreslått | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + til stede -ikke til stede +/-kan eller ikke kan være til stede |
|||||||
Tabell 1: oversikt over C. perfringens genotyper. Et diagram av kombinasjonene av giftstoffer produsert av hver C. perfringens toxinotype.
| Målet | Primer parene | Forventet PCR-produkt (BP) |
| Alpha | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Beta | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| Epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16S RNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
~ 1300 |
Tabell 2: grunning og forventede PCR-produkter for utvalgte gift gener. Primere som brukes i PCR-genotyperingteknologi trinnet.
| Mat type | Type A | Type B | Type C | Type D | C. ytelse + | |||||||
| Alpha giften positive | Alpha, beta, og Epsilon gift positive | Alfa og beta gift positive | Alpha og Epsilon gift positive | |||||||||
| N | N | % | N | % | N | % | N | % | N | % | ||
| Kjøtt | Biff | 38 | 8 | 21 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 24 |
| Lam | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Svinekjøtt | 15 | 2 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 13 | |
| Blandet | 1 | 1 | 100 prosent | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 100 prosent | |
| Delsum | 64 | 11 | 17 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12 | 19 | |
| Fjørfe | Kylling | 19 | 5 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 26 |
| Tyrkia | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Delsum | 26 | 5 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 19 | |
| Sjømat | COD | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Blandet | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| laks | 11 | 2 | 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 18 | |
| shelfish | 32 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | |
| snapper | 4 | 3 | 75 prosent | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 75 prosent | |
| Flyndre | 12 | 4 | 33 prosent | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 33 prosent | |
| Blekksprut | 4 | 1 | 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 25 | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 10 | 4 | 19 | |
| Tunfisk | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Andre | 8 | 1 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 13 | |
| Delsum | 100 | 14 | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 16 | 16 | |
| Meieri | ku | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Geit | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Melk | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Delsum | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Produsere | Vegetabilske | 12 | 1 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 8 |
| Frukt | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Urt | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Delsum | 16 | 1 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | |
| Totalt | 216 | 31 | 14 | 1 | 0,50 prosent | 0 | 0 | 2 | 0,90 prosent | 34 | 16 | |
Tabell 3: Prevalens av forskjellige C. perfringens toxinotypes i 216 matvare prøver. Et eksempel på resultatene oppnås ved bruk av denne metoden for å teste detaljhandel mat for C. perfringens. Denne tabellen er endret fra det tidligere utgitte manuskriptet Regan et al.16.
Discussion
Her beskriver vi en metode for å identifisere C. perfringens prevalens i detaljhandel matvare prøver med begrenset subculturing og uten bruk av et anaerob kammer system. Denne metoden bruker en kombinasjon av teknikker for å øke identifisering av C. perfringens fra matvare prøver. Ved å bruke en modifisert versjon av RPM Media, tillater vi for selektiv vekst av C. perfringens. Ved sandwiching inokulert RPM mellom lag av TSC agar, er vi i stand til å identifisere og isolere anaerob, sulfitt bakterier karakteristisk for C. perfringens. For å bekrefte tilstedeværelsen av C. perfringens, sulfitt-reduserende kolonier er sub-kultivert i frisk RPM. Den modifiserte versjonen eller RPM gjør det mulig for oss å enkelt trekke ut DNA fra kulturer, slik at PCR-bekreftelse av spesifikke gift gener. Bekreftelse av C. perfringens forurenset matvare prøver kan oppnås innen tre dager.
I tidlige eksperimenter, var matvare prøver bare inokulert inn RPM og DNA utvunnet fra ON kulturer. Denne metoden resulterte i påvisning av C. perfringens i et begrenset antall prøver (data ikke vist). Selv om RPM er selektiv for c. perfringens vekst, er det ikke eksklusivt for c. perfringens vekst. Andre, gram-positive, D-cycolserine resistente bakterier kan fortsatt vokse i RPM. Vi hypotetisk gjennomsnitt at forurensning av andre bakterielle arter kan ha redusert vår påvisning av C. perfringens stammer ved å redusere følsomheten til vår PCR-analyse i vår første på RPM kultur. Et kritisk skritt i å øke påvisning av C. perfringens var inkluderingen av TSC agar "sandwich" teknikk. Dette tillot oss å skille og velge for anaerobe, sulfitt-reduserende kolonier, karakteristisk for C. perfringens. Et viktig trinn i denne prosessen er å sikre at det øverste laget av smeltet TSC agar er på 40 ° c. Selv om noen C. perfringens stammer kan vokse ved økte temperaturer (46 – 48 ° c)15,16, tillegg av smeltet agar ved økte temperaturer sterkt reduserer mengden av kulturer utvinnes, mest sannsynlig på grunn av celle død .
Det finnes flere mulige begrensninger på denne metoden. Som nevnt tidligere, verken RPM eller TSC agar velger eller skiller for C. perfringens eksklusivt, slik at for vekst av andre bakterielle arter til stede i matvare prøver. Dette kan redusere følsomheten til analysen å velge for C. perfringens bare. Dette er imidlertid en felles begrensning i nesten alle dyrking teknikker. Genotyperingteknologi bekreftelse av renset isolat er den beste metoden for definitivt å identifisere C. perfringens og andre bakterielle arter. En annen begrensning av denne studien er at vi ikke tester renset isolerer. Vi hensikt gjorde dette for å begrense mengden av subculturing, som gjentas subculturing er fryktet å resultere i plasmider tap. Fordi vi ikke isolere til renhet, er det mulig at flere C. perfringens toxinotypes kan være til stede i samme prøve eller under kultur. Hvis forskerne ønsker å få renset isolerer, standard rensing metoder kan brukes på den siste RPM kulturen beskrevet i denne metoden; Dette krever vanligvis bruk av anaerobe kamre. Selv om den opprinnelig ble brukt til å isolere c. perfringens fra mat, kan denne metoden brukes til å identifisere og isolere C. perfringens fra en rekke kilder. Nærmere bestemt en slik anvendelse av denne metoden er å teste avføringsprøver fra mennesker (eller dyr) som er mistenkt for å være smittet med C. perfringens og toxinotype bakteriene til bedre å forstå kilden til infeksjonen.
Disclosures
Ingen avsløringer.
Acknowledgments
Denne forskningen har ikke mottatt noen konkrete midler fra offentlige, kommersielle eller ikke-for profitt sektorer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
