Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن مختلف أنواع التوكستريديوم بيرفرينجنز السمية في الاطعمه المشترية محليا ، ولا سيما السموم ابسيلون إنتاج سلاله نوعين B و D ، دون استخدام الغرف لاهوائية.
Abstract
كلوستريديوم بيرفرينجنز (c. بيرفرينجنز) هو منتج السموم غزير ويسبب مجموعه واسعه من الامراض في المضيفين المختلفة. C. بيرفرينجنز يتم تصنيفها إلى خمسه أنواع سميه مختلفه ، من A إلى E ، استنادا إلى نقل أربعه الجينات السامة الرئيسية. وقد تمت دراسة مدي انتشار وتوزيع هذه الأنواع المختلفة من السموم ، ولا سيما في الاغذيه الامريكيه بالتجزئة. ومن الاهميه بمكان بالنسبة لنا هو نوع B و D سلالات ، والتي تنتج السموم ابسيلون ، والسموم القاتلة للغاية واقترح ان يكون الزناد البيئي لتصلب متعددة في البشر. لتقييم وجود أنواع مختلفه من السميات c. بيرفرينجنز في عينات الطعام المختلفة ، وضعنا طريقه سهله لثقافة انتقائية هذه البكتيريا دون استخدام نظام الحاويات لاهوائية فقط التي تنطوي علي ثلاث خطوات الذبح. يتم شراء الاغذيه من محلات البقالة المحلية ونقلها إلى المختبر في ظل الظروف المحيطة. يتم فرم العينات وتطعيمها في وسائط بيرفرينجنز السريعة المعدلة (RPM) ويتم احتضانها بين عشيه وضحيها عند 37 درجه مئوية في أنبوب مخروطي محكم الغلق. يتم تطعيم الثقافات بين عشيه وضحيها علي طبقه سفليه من الصلبة Tryptose سلفايت السيكلوسبورين (المستوي التدريبي) أجار ، ومن ثم مضافه مع الطبقة العليا من أجار السائل المنصهر ، وخلق "محصورة" ، والبيئة لاهوائية. يتم احتضان لوحات أجار بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ومن ثم تقييمها لظهور الأسود ، المستعمرات الحد من الكبريت. C. بيرفرينجنز-يتم أزاله المستعمرات المشتبه بها من أجار الدورة التدريبية باستخدام القطرات العين معقمه ، وتطعيمها في RPM وشبه مثقف بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية في أنبوب مخروطي محكم. يتم استخراج الحمض النووي من الثقافة الفرعية RPM ، ومن ثم تحليلها لوجود الجينات السموم c. بيرفرينجنز عن طريق تفاعل البلمره سلسله (PCR). اعتمادا علي نوع من المواد الغذائية العينات ، عاده 15-20 ٪ من العينات اختبار ايجابيه ل c. بيرفرينجنز.
Introduction
كلوستريديوم بيرفرينجنز (c. بيرفرينجنز) هو غرام إيجابي ، لاهوائية ، بوغ تشكيل ، قضيب علي شكل بكتيريا التي تم العثور عليها في البيئة. هذا النوع من البكتيريا يحمل الجينات التي ترميز لأكثر من 17 السموم ، وتاريخيا ، وقد وصفت في خمسه أنماط السمية (A-E) علي أساس وجود أربعه الجينات السامة المختلفة: الفا ، بيتا ، ابسيلون ، والسموم ذره (الجدول 1)1. في الاونه الاخيره ، وقد اقترح ان هذا المخطط الطباعة يحتاج إلى توسيع لتشمل أنواع F و G ، التي تؤوي السموم المعوية (CPE) و netb السمية ، علي التوالي2. ومع ذلك ، هناك حاجه إلى المزيد من البحوث قبل ان يتم قبول هذا النظام مكيدة رسميا. في حين ان الجينات السامة الفا كروموسوميا يقع بدقه ، يمكن العثور علي الجينات CPE علي حد سواء علي الكروموسوم والبلازميدات. المقارنة ، توجد جينات السموم المتبقية علي مختلف أنواع البلازميدات. ونحن مهتمون بشكل خاص في انتشار c. بيرفرينجنز أنواع B و D لان هذه السلالات تنتج السموم ابسيلون ، وهي قويه للغاية ، والسموم تشكيل المسام ، والتي اقترحت للعب دور في التسبب في التصلب المتعدد (MS) في البشر3 ،4،5،6،7. كيف يصاب الناس أو استعمرت من قبل هذه السلالات غير معروف. ويتمثل أحد التفسيرات الممكنة في استهلاك المنتجات الغذائية الملوثة. للمساعدة في الاجابه علي هذا السؤال ، سعينا لتحديد مدي انتشار مختلف الأنماط السمية في c. بيرفرينجنز في عينات الاغذيه الامريكيه.
وجود السميات السامة بيرفرينجنز في عينات الاغذيه الامريكيه غير مدروس وغالبا ما يتطلب استخدام أنظمه الحاويات لاهوائية والعديد من الخطوات الفرعية8،9،10،11 . علي الرغم من ان هناك حاجه إلى العديد من الخطوات الفرعية للحصول علي العزلات المنقية ، يمكن ان يؤدي هذا الأسلوب إلى فقدان البلازميدات علي مر الزمن12،13،14، ربما تؤثر علي الكشف عن الجينات السمية المنقولة plasmid بما في ذلك الجينات السامة ابسيلون. سعينا إلى تطوير طريقه سهله ، مع عدد اقل من الخطوات الفرعية ، للثقافة انتقائية c. بيرفرينجنز دون استخدام الغرف لاهوائية ، والجرار ، أو أكياس. لفتره وجيزة ، يتم تطعيم عينات الطعام إلى السريع Perfringens وسائل الاعلام (RPM) بين عشيه وضحيها (ON) ، ثم "تقع" في أجار الدورة التدريبية واحتضانها علي. مستعمرات يشتبه ان يكون [ ك.]. [برفريجنز ] بعد ذلك [سوب-بروجنتد] داخل [ربم] وحضنت ثانيه فوق. يتم استخراج الحمض النووي واجراء PCR لتحديد النمط الجيني (الشكل 1). اخترنا لاستخدام دوره في الدقيقة كما ثبت لزيادة الانتعاش من سلالات c. بيرفرينجنز من عينات الغذاء بالمقارنة مع غيرها من وسائل الاعلام القياسية أكثر15. الاضافه إلى ذلك ، تم استخدام RPM بنجاح لعزل السموم ابسيلون إنتاج سلاله من نوع B من المريض MS4. نحن نستخدم نسخه معدله من RPM بدلا من النسخة الاصليه للسماح سهله استخراج الحمض النووي. في حين ان هذا الأسلوب يسمح بسهوله تحديد الجينات السامة داخل العينات ، فمن الممكن ان عينه فرديه سوف تحتوي علي أكثر من واحد c. بيرفرينجنز النمط السام. لان طريقتنا لا تعزل السلالات المنقية باستخدام عده جولات من التنقية ، فان تحديد الأنواع المتعددة من السموم من عينه واحده غير ممكن. ومع ذلك ، يمكن تطبيق تقنيات التنقية القياسية (عاده ما يتم وضعها علي لوحات النظام التدريبي أو لوحات أجار الدم) في نهاية بروتوكولنا لتحقيق الثقافات المنقية.
Protocol
ملاحظه: c. بيرفرينجنز يعتبر مستوي خطر السلامة الاحيائيه 2 (BSL2) الكائن الحي. علي الرغم من ان ليس كل العينات الغذائية سوف تحتوي علي c. بيرفرينجنز، يجب ان تعامل جميع العينات مثقف علي هذا النحو. وينبغي ارتداء جميع الاحتياطات المناسبة ومعدات حماية الموظفين في جميع الأوقات. تطهير جميع المواد قبل التخلص منها.
1. اعداد دوره فيالدقيقة المعدلة 4 ،15
- الجمع بين 30 غرام/لتر السائل ثيغليكولاتي المتوسطة ، 60 g/L الجيلاتين ، 5 غرام/لتر peptone ، 5 غرام/لتر الجلوكوز ، 5 غرام/لتر فوسفات البوتاسيوم dibasic ، 3 g/L استخراج الخميرة ، 1.5 g/L كلوريد الصوديوم ، 0.5 g/L كبريتات الحديد في الماء منزوع الأيونات حتى تفرق بالتساوي نحن عاده جعل 1 L دفعات.
- الاوتوكلاف في 121 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.
- السماح لتبرد إلى حوالي 40 درجه مئوية.
- مره واحده في الدقيقة هو بارد ، أضافه D-السيكلوسبورين إلى تركيز النهائي من 440 ملغ/لتر.
ملاحظه: تركيزات المخزون من D-السيكلوسبورين المذاب في الماء المعقم في 50 ملغ/مل يمكن تخزينها في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل. - نقل اسيبكالي 10 مل من دوره في الدقيقة إلى 15 مل أنابيب مخروطيه. دوره في الدقيقة يمكن اعدادها علي دفعات وتخزينها في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى شهر واحد.
- دوره في الدقيقة الدافئة إلى 37 درجه مئوية قبل الاستخدام.
2. جمع العينات والحضانة RPM
- نقل المواد الغذائية إلى المختبر تحت درجات الحرارة المحيطة في غضون 1 ساعة. ويمكن نقل الاغذيه في عبوات أصليه أو حاويات معقمه. إذا لم يتم الاختبار علي الفور ، يمكن تخزين الطعام عند-20 درجه مئوية حتى الاستخدام. وتجدر الاشاره إلى نوع الطعام والبلد الأصلي وفقا لعلامة التغليف ، ان وجدت ، وكذلك اي معلومات أخرى ذات صله.
- أزاله ما يقرب من 1.0-2.0 غرام من المواد الغذائية ونقل إلى طبق بيتري معقمه أو ما يعادلها. مفروم ناعما مع شفره حلاقه معقمه أو مشرط.
- تطعيم في 10 مل من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) في أنبوب مخروطي 15 مل. اخلط جيدا.
- لتحديد للخلايا الخضري, نقل 5 مل من خليط تلفزيوني-الغذاء في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي علي 10 مل من دوره في الدقيقة. تامين الغطاء باحكام.
- لتحديد لجراثيم ، وتسخين المتبقية 5 مل من خليط تلفزيوني-الغذاء في 85 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ومن ثم نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي علي 10 مل من دوره في الدقيقة. تامين الغطاء باحكام.
- دوامه وعكس ثقافات الغذاء-دوره في الدقيقة لضمان الاختلاط الكامل.
- ختم باحكام الأنابيب المخروطية والاغطيه التفاف مع فيلم البارافين أو التفاف من البلاستيك لضمان بيئة لاهوائية.
- احتضان بين عشيه وضحيها (ON) في 37 درجه مئوية.
- في الصباح التالي ملاحظه اي تعكر أو التخمير في أنابيب دوره في الدقيقة.
3. التدريبية "ساندويتش" تصفيح
- تطعيم الثقافات في دوره في الدقيقة في أجار التدريبية باستخدام تقنيه "ساندويتش" (الشكل 2) الموصوفة أدناه.
- اعداد أجار التدريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- اعداد الطبقة الاساسيه من لوحات المستوي التدريبي عن طريق نقل 10 مل من أجار السائل المنصهر لاطباق بتري المعقمة والسماح ليصلب. ويمكن اعداد هذه في المتقدمة وتخزينها في 4 ° c. تاكد من تسخين الصفائح إلى درجه حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- للطبقة العليا من لوحه المستوي التدريبي ، والحفاظ علي أجار المتبقية المنصهر في 40 درجه مئوية.
ملاحظه: علي الرغم من ان نقطه انصهار أجار فوق 85 درجه مئوية ، والمنصهر أجار يتصلب حول 32-45 درجه مئوية.
- بعناية استرداد الثقافات ON RPM ونقل 100 μL إلى قاعده أجار الدورة التدريبية. بسبب التخمير ، قد تكون بعض الثقافات تحت الضغط. تاكد من ارتداء جميع معدات الوقاية الخاصة المناسبة.
- انتشار في دوره في الدقيقة باستخدام الخرز الزجاجي المعقم أو الخلية مفرشه.
- السماح RPM لتكون "استيعابها" في أجار الدورة التدريبية لمده 5-10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- نقل بعناية 20 مل من المنصهر ، 40 درجه مئوية أجار الخدمة التدريبية للوحه باستخدام ماصه المصلية.
- استبدال غطاء الطبق بيتري والسماح أجار المستوي التدريبي ليصلب تماما في درجه حرارة الغرفة.
- عكس طبق بيتري واحتضان في 37 درجه مئوية علي.
- إذا كانت التخفيفات التسلسلية المطلوبة, أداء التخفيفات من الثقافات ON RPM في الطازجة, قبل الحرارة RPM قبل التلقيح في أجار الدورة التدريبية.
4-الزراعة الفرعية لمستعمرات الحد من الكبريت
- في صباح اليوم التالي ، وأزاله لوحات من الحاضنة وفحص لنمو البكتيريا. البكتيريا الهوائية قد تكون موجودة علي سطح أجار. سيتم العثور علي البكتيريا لاهوائية تنمو جزءا لا يتجزا داخل أجار. سوف البكتيريا الحد من الكبريت بدوره المحيطة أجار الأسود. وسوف تكون المستعمرات c. بيرفرينجنز المحتملة سوداء وجزءا لا يتجزا من أجار.
- C. بيرفرينجنز المستعمرات المشتبه بها ستكون ايجابيه للحد من سولفيت وسوف تظهر سوداء, جزءا لا يتجزا من أجار. باستخدام الشافطه معقمه ، أحاديه الاستخدام ، "نتف" المستعمرات السوداء من أجار ونقل إلى 10 مل من دوره في الدقيقة الطازجة في أنبوب مخروطي 15 مل. من المهم ان يتم طرد الهواء من الشافطه قبل ثقب أجار.
- إذا كان هناك كميه كثيفه من نمو البكتيريا الهوائية علي سطح اللوحة ، استخدم مكشطه خليه معقمه لأزاله المستعمرات من مناطق مختاره. متعددة c. بيرفرينجنز يشتبه مستعمرات يمكن أخذ عينات من نفس لوحه الدورة التدريبية في الثقافات RPM منفصلة.
- محكم الاغطيه أنبوب مخروطي الشكل والتفاف في فيلم البارافين أو التفاف من البلاستيك. احتضان علي 37 درجه مئوية.
5. استخراج الحمض النووي
- أزاله الثقافات علي دوره في الدقيقة ودراسة علامات النمو بما في ذلك التعكر والتخمير.
- عكس بلطف ثقافة RPM لتفريق اي البكتيريا استقرت وفتح بعناية. نقل 1 مل من الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير.
- أجهزه الطرد المركزي في السرعة القصوى (حوالي 15,000 x g) لمده 10 دقيقه إلى البكتيريا بيليه.
- غسل بيليه مع 1 مل من العقيمة تلفزيوني.
- في بعض الحالات ، سيستقر الجيلاتين غير المهضوم فوق البكتيريا المغلفة. لأزاله الجيلاتين ، "زغب" قباله الجيلاتين عن طريق التحريض بلطف مع تلفزيوني باستخدام ميكروماص. هذا سوف "زغب متابعه" الجيلاتين في حين ترك بيليه البكتيرية سليمه.
- أزاله خليط تلفزيوني-الجيلاتين مع الطموح لطيف. أعاده تعليق بيليه البكتيرية المتبقية مع 1 مل من تلفزيونيه الطازجة.
- الطرد المركزي بيليه البكتيرية المعاد تعليقها في السرعة القصوى لمده 10 دقيقه ويستنشق بعناية supernatant.
- اجراء استخراج الحمض النووي علي الفور باستخدام مجموعه استخراج الحمض النووي وبروتوكول تم إنشاؤه خصيصا لاستخراج الحمض النووي من البكتيريا الايجابيه الجرام (انظر جدول المواد).
- استخدام الحمض النووي المستخرج علي الفور أو تخزين في-20 درجه مئوية حتى تحليل PCR.
6. الكشف عن c. بيرفرينجنز عن طريق التنميط الجيني
- لتحديد ما إذا كانت الثقافات ايجابيه ل c. بيرفرينجنز الأنماط السمية ، فحص الحمض النووي المستخرج لجينات السموم المختلفة عبر PCR.
ملاحظه: لأننا الأكثر اهتماما في السموم ابسيلون إنتاج سلالات نوع B و D c. بيرفرينجنز، ونحن تقييم لوجود الجينات الفا ، بيتا ، والسموم ابسيلون. وترد الإشعال في الجدول 2. يتم استخدام الإشعال ل 16s الحمض النووي الريبي كعنصر تحكم استخراج الحمض النووي. ويمكن استخدام المواد التمهيدية الاضافيه لاختبار الأنماط السمية من خلال G ويمكن العثور عليها في المؤلفات المنشورة2و12و13. - استخدام المستخرجة سابقا c. بيرفرينجنز الحمض النووي كعنصر تحكم إيجابي. يضمن عنصر التحكم هذا ان كافة مكونات تفاعلات PCR تعمل. نحن نستخدم الحمض النووي المستخرج من c. بيرفرينجنز نوع B (atcc 3626) كما لدينا السيطرة الايجابيه. تنمو ATCC 3636 علي في دوره في الدقيقة في 37 درجه مئوية واستخراج الحمض النووي باستخدام نفس الطرق الموصوفة في الخطوات 5.1 – 5.7. يخزن الحمض النووي المستخرج عند-20 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
- تعيين شروط PCR علي النحو التالي: 94.0 درجه مئوية لمده 3 دقائق ؛ 94.0 درجه مئوية لمده 30 ثانيه ؛ 47.9 درجه مئوية لمده 30 ثانيه ، 72.0 درجه مئوية لمده دقيقه واحده (كرر الخطوات 2 – 4 لدورات 35) ؛ 72.0 درجه مئوية لمده 10 دقائق.
- لتاكيد المنتجات PCR, تشغيل تفاعلات PCR علي هلام 1.8 g/100 مل اجنشا باستخدام التقنيات القياسية. يتم سرد احجام المنتجات PCR المتوقعة في الجدول 2. يتم عرض نتائج PCR النموذجية في الشكل 3.
Representative Results
باستخدام هذه الطريقة ، 15-20 ٪ من الاطعمه لدينا عينات اختبار ايجابيه ل c. بيرفرينجنز. في حين ان معظم سلالات ايجابيه لنمط السمية A ، لقد اكتشفنا بنجاح كل من نوع B و D في عينات الغذاء. في ورقه نشرت سابقا اختبرنا ما مجموعه 216 العينات الغذائية التي تم شراؤها من مخازن التجزئة في نيويورك16 (الجدول 3). وشملت هذه العينات عينات مختلفه من اللحوم (لحم البقر ولحم الضان ولحم الخنزير ولحم الضان) وعينات الدواجن (الدجاج والديك الرومي) وعينات الماكولات البحرية (سمك القد والسلمون والمحار والسمك المفلطح وسمك الحبار وسمك البلطي واسماك أخرى) كما تم اختبار المنتجات وعينات ألبان. من 216 عينه ، 34 (16 في المائة) كانت ايجابيه ل c. بيرفرينجنز. من العينات الايجابيه 34 c. بيرفرينجنز ، 31 عينه (91.2 ٪) يحتوي علي السم الفا ، عينه واحده (2.9 ٪) الواردة الفا ، بيتا والسموم ابسيلون ، وعينين (5.9 ٪) يحتوي علي السموم الفا وابسيلون.
ومن المثير للاهتمام ، اكتشفنا أيضا ان c. بيرفرينجنز كان أكثر انتشارا كخلايا الخضري مقارنه مع الجراثيم. وقارنت 25 عينات لوجود خلايا الخضري ج. بيرفرينجنز أو الجراثيم. تم اختيار الجراثيم عن طريق الحرارة عينات صادمه في 85 درجه مئوية لمده 15 دقيقه. من 25 عينات اختبار, 16% كانت ايجابيه لسلالات الخضري c. بيرفرينجنز مقابل 4% للجراثيم. وهذا يشير إلى انه قد يكون أكثر فعاليه من حيث التكلفة لاختبار للخلايا الخضري فقط بدلا من كليهما.
الشكل 1: نظره عامه علي الإجراءات.
عينات الطعام المفروم والمخفف في العقيمة تلفزيوني. يتم تطعيم نصف عينه من الطعام التلفزيوني في دوره في الدقيقة لتحديد الخلايا الخضري. المتبقية [ببس-فوود] عينه صدمه حرارة في 85 [ك] ل 15 [مين] ان يحدد ل جراثيم قبل تلقيح في [ربم]. حضنت ثقافات فوق في 37 [ك] بعد ذلك مطليه داخل [س] أجار. يتم احتضان أجار الدورة التدريبية علي 37 درجه مئوية ، والأسود ، والثقافات التي تقلل من الكبريت هي شبه مثقف في RPM الطازجة. يتم احتضان الثقافات الفرعية دوره في الدقيقة في 37 درجه مئوية ويتم استخراج الحمض النووي لأداء التنميط الجيني عن طريق PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تخطيطي لتقنية ساندويتش أجار التدريبية.
يتم طلاء الوسائط RPM التي تحتوي علي البكتيريا c. بيرفرينجنز بين طبقتين من أجار النظام التدريبي من أجل تعزيز البيئة لاهوائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نتائج PCR المختارة.
أمثله علي نتائج التنميط الجيني لل c. بيرفرينجنز من سبعه أنواع مختلفه من المواد الغذائية ، والسيطرة الايجابيه علي c. بيرفرينجنز نوع B. تم استخدام سلم الوزن الجزيئي (الممر الأول من كل هلام) لتقريب حجم النتائج PCR في أزواج القاعدة (bp). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| النمط السام | الفا | الإصدار بيتا | ابسيلون | ايوتا | Cpe | NetB | |
| المنشاه | علي | + | - | - | - | - | - |
| ب | + | + | + | - | - | - | |
| ج | + | + | - | - | + | - | |
| د | + | - | + | - | + | - | |
| ه | + | - | - | + | + | - | |
| المقترحه | و | + | - | - | - | + | - |
| ز | + | - | - | - | - | + | |
| + الحالي -غير موجود +/-قد أو قد لا تكون موجودة |
|||||||
الجدول 1: لمحه عامه عن الأنماط الجينية لل c. بيرفرينجنز . رسم بياني لمجموعات من السموم التي تنتجها كل C. بيرفرينجنز النمط السام.
| الهدف | أزواج التمهيدي | المتوقع PCR المنتج (bp) |
| الفا | واو: قانون الاتحاد التونسي للشغل R: CCT CTG ATA القط CGT GTA AG |
325 |
| الإصدار بيتا | F: GCG AAT ATG CTG AAT القط CTA R: GCA غا ACA TTA GTA المتبادلة ج |
196 |
| ابسيلون | F: GCG GTG ATA المتبادلة TC R: CCA CTT قانون TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16s RNA | واو: الأغا التونسي للشغل R: GGT TAC CTT الاتحاد التونسي للشغل ACG ACT T |
1300 كيلوبايت تقريبا |
الجدول 2: الإشعال والمنتجات PCR المتوقعة لجينات السموم المختارة. الإشعال المستخدمة في الخطوة الجينية PCR.
| نوع الطعام | النوع الف | النوع باء | النوع جيم | النوع دال | C. الرف + | |||||||
| الفا السموم ايجابيه | الفا ، بيتا ، والسموم ابسيلون ايجابيه | الفا وبيتا السموم ايجابيه | الفا والسموم ابسيلون ايجابيه | |||||||||
| ن | ن | % | ن | % | ن | % | ن | % | ن | % | ||
| اللحوم | لحوم البقر | 38 | 8 | 21 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 24 |
| الحمل | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| لحم الخنزير | 15 | 2 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 13 | |
| مختلطه | 1 | 1 | 100 في المائة | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 100 في المائة | |
| المجموع الفرعي | 64 | 11 | 17 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12 | 19 | |
| الدواجن | الدجاج | 19 | 5 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 26 |
| تركيا | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| المجموع الفرعي | 26 | 5 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 19 | |
| الماكولات البحريه | القد | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| مختلطه | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| السلمون | 11 | 2 | 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 18 | |
| شيلفيش | 32 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | |
| النهاش | 4 | 3 | 75 في المائة | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 75 في المائة | |
| تتعثر | 12 | 4 | 33 في المائة | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 33 في المائة | |
| الحبار | 4 | 1 | 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 25 | |
| البلطي | 21 | 2 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 10 | 4 | 19 | |
| التونه | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| الاخري | 8 | 1 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 13 | |
| المجموع الفرعي | 100 | 14 | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 16 | 16 | |
| الالبان | البقر | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| الماعز | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| الحليب | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| المجموع الفرعي | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| انتاج | الخضروات | 12 | 1 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 8 |
| الفاكهه | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| عشب | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| المجموع الفرعي | 16 | 1 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | |
| مجموع | 216 | 31 | 14 | 1 | 0.50 في المائة | 0 | 0 | 2 | 0.90 في المائة | 34 | 16 | |
الجدول 3: انتشار الأنواع المختلفة من السميات في العينات الغذائية 216. مثال علي النتائج التي تم الحصول عليها عند استخدام هذه الطريقة لاختبار المواد الغذائية التجزئة ل c. بيرفرينجنز. تم تعديل هذا الجدول من المخطوطة المنشورة سابقا ريغان وآخرون16.
Discussion
هنا نحن وصف طريقه لتحديد c. بيرفرينجنز انتشار في عينات الاغذيه التجزئة مع الخياطة المحدودة ودون استخدام نظام الغرفة لاهوائية. يستخدم هذا الأسلوب مجموعه من التقنيات لزيادة التعرف علي c. بيرفرينجنز من عينات الطعام. باستخدام نسخه معدله من وسائل الاعلام RPM ، ونحن نسمح للنمو الانتقائي لل c. بيرفرينجنز. بواسطة يقحم دوره في الدقيقة تطعيم بين طبقات أجار المستوي التدريبي ، ونحن قادرون علي تحديد وعزل لاهوائية ، البكتيريا التي تقلل من الكبريت مميزه من c. بيرفرينجنز. لتاكيد وجود c. بيرفرينجنز، والمستعمرات الحد من الكبريت الفرعية إلى دوره في الدقيقة الطازجة. النسخة المعدلة أو RPM يسمح لنا بسهوله استخراج الحمض النووي من الثقافات ، وتمكين PCR تاكيد الجينات السمية محدده. تاكيد c. بيرفرينجنز عينات الاغذيه الملوثة يمكن ان يتحقق في غضون ثلاثه أيام.
في التجارب المبكرة ، تم تطعيم عينات الطعام ببساطه في دوره في الدقيقة والحمض النووي المستخرج من ثقافات ON. ادي هذا الأسلوب في الكشف عن c. بيرفرينجنز في عدد محدود من العينات (البيانات غير معروضه). علي الرغم من ان دوره في الدقيقة انتقائية ل c. بيرفرينجنز النمو ، فانه ليس حصريا ل c. بيرفرينجنز النمو. أخرى, ايجابيه الجرام, D-cycolserine البكتيريا المقاومة يمكن ان تنمو لا تزال في دوره في الدقيقة. افترضنا ان التلوث من الأنواع البكتيرية الأخرى قد انخفضت لدينا الكشف عن سلالات c. بيرفرينجنز من خلال تقليل حساسية تحليل PCR لدينا في الثقافة الاولي علي دوره في الدقيقة. وكان من الخطوات الحاسمة في زيادة الكشف عن c. بيرفرينجنز ادراج تقنيه أجار "ساندويتش" التدريبية. وقد سمح لنا هذا بالتفريق وتحديد المستعمرات لاهوائية التي تقلل من الكبريت ، والمميزة لل c. perfringens. ومن الخطوات الرئيسية في هذه العملية ضمان ان الطبقة العليا من أجار السائل المنصهر هو في 40 درجه مئوية. علي الرغم من ان بعض السلالات c. بيرفرينجنز يمكن ان تنمو في زيادة درجات الحرارة (46-48 °c)15,16, أضافه أجار المنصهر في زيادة درجات الحرارة يقلل كثيرا من كميه الثقافات المستردة, غالبا ما يكون بسبب وفاه الخلية .
هناك العديد من القيود المحتملة علي هذا الأسلوب. كما ذكر سابقا ، لا الدورة التدريبية في الدقيقة ولا النوع أجار يختار أو يميز ل c. بيرفرينجنز حصرا ، مما يسمح للنمو الأنواع البكتيرية الأخرى الموجودة في عينات الغذاء. وهذا قد يقلل من حساسية الفحص لتحديد ل c. بيرفرينجنز فقط. ومع ذلك ، فان هذا هو القيد الشائع في جميع تقنيات الاستزراع تقريبا. تاكيد التنميط الجيني من العزلات المنقية هو أفضل طريقه لتحديد نهائيا c. بيرفرينجنز والأنواع البكتيرية الأخرى. ومن القيود الأخرى التي تحد من هذه الدراسة اننا لا نختبر العزلات المنقية. فعلنا ذلك عمدا للحد من كميه الخياطة ، كما يخشى المتكررة التي تؤدي إلى فقدان البلازميد. لأننا لا عزل إلى النقاء ، فمن الممكن ان متعددة c. بيرفرينجنز الأنماط السمية قد تكون موجودة في نفس العينة أو الثقافة الفرعية. إذا كان الباحثون يرغبون في الحصول علي العزلات المنقية ، يمكن استخدام أساليب التنقية القياسية علي ثقافة RPM الاخيره الموصوفة في هذه الطريقة. وهذا يتطلب عاده استخدام الغرف لاهوائية. علي الرغم من ان تستخدم في الأصل لعزل c. بيرفرينجنز من الغذاء ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد وعزل c. بيرفرينجنز من العديد من المصادر. علي وجه التحديد ، واحد مثل هذا التطبيق من هذا الأسلوب هو لاختبار عينات البراز من البشر (أو الحيوانية) التي يشتبه في انها مصابه مع c. بيرفرينجنز والنمط السام للبكتيريا لفهم أفضل لمصدر العدوى.
Disclosures
لا إفصاحات.
Acknowledgments
ولم يتلق هذا البحث اي تمويل محدد من القطاعات العامة أو التجارية أو غير الربحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
