Summary
Denne undersøgelse skitserer kvantitative målinger af synaptisk størrelse og lokalisering, muskel morfologi, og mitokondrie form i C. elegans ved hjælp af frit tilgængelige billedbehandling værktøjer. Denne fremgangsmåde gør det muligt for fremtidige studier i C. elegans at sammenligne omfanget af vævs-og organelle strukturændringer som følge af genetiske mutationer.
Abstract
Definition af cellulære mekanismer underliggende sygdom er afgørende for udviklingen af nye Therapeutics. En strategi, der ofte bruges til at afdække disse mekanismer, er at introducere mutationer i kandidat gener og kvalitativt beskrive ændringer i morfologien af væv og celle organeller. Kvalitative beskrivelser kan dog ikke opfange subtile fænotypiske forskelle, kunne forvanske fænotypiske variationer på tværs af individer i en population og ofte vurderes subjektivt. Her beskrives kvantitative tilgange til at studere morfologien af væv og organeller i fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans ved hjælp af Laserscanning confokal mikroskopi kombineret med kommercielt tilgængelige bio-image behandling software. En kvantitativ analyse af fænotyper, der påvirker synapse integritet (størrelse og integreret fluorescens niveauer), muskel udvikling (muskel Cellestørrelse og myosin filament længde), og mitokondrie morfologi (cirkularitet og størrelse) blev udført for at forstå virkningerne af genetiske mutationer på disse cellulære strukturer. Disse kvantitative tilgange er ikke begrænset til de anvendelser, der er beskrevet her, da de let kunne anvendes til kvantitativt at vurdere morfologien af andre væv og organeller i nematoden samt i andre modelorganismer.
Introduction
Fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) udnyttes i stigende grad som et model system til at afdække de biologiske og molekylære processer, der er involveret i sygdomme hos mennesker. En voksen fyrretræsnematoden har en kropslængde på lidt over 1 mm, og kan producere en stor yngel på op til 300 æg1. Efter klækning kræver C. elegans kun 3-4 dage for at nå voksenalderen, og leve i omkring 2 til 3 uger2. På grund af sin lethed af dyrkning, C. elegans er i øjeblikket en af de mest eftertragtede in vivo dyremodeller for at gennemføre omkostningseffektiv, hurtig Drug screening for at identificere Therapeutics for menneskelige sygdomme. Desuden, dens genetiske bevaring, veldefinerede adfærdsmæssige paradigmer, gennemsigtige organ for fluorescens eller lys mikroskopi, og nem genetisk manipulation gør studiet af cellulære og molekylære konsekvenser af genetiske mutationer let opnåelige 3. C. elegans genom deler ca. 60-80% ortologi med menneskelige gener, og omkring 40% af disse gener er kendt for at være sygdomsrelaterede. Nogle af menneskelige sygdomme, der er blevet modelleret og undersøgt i C. elegans omfatter neurodegenerative lidelser (Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-tandsygdom), muskel-associerede sygdomme ( Duchenne muskeldystrofi), og metaboliske sygdomme (hyperglykæmi)2,4. I de fleste menneskelige lidelser opstår sygdoms induceret cellulær og organelle lokalisering og morfologiske forandringer, som let kan evalueres i fyrretræsnematoden modellen.
Fluorescerende markører har været meget brugt til at mærke væv og organeller til dynamisk visualisering under mikroskopet. Men i C. elegans, konventionelle metoder, der vurderer morfologiske uregelmæssigheder på grund af genetiske mutationer har i vid udstrækning påberåbt sig visuelle beskrivelser. Mens kvalitative vurderinger kan dække bredere intervaller af fænotypiske beskrivelser (synaptisk morfologi, GFP clumping, specifik axonal form, muskel fiber tykkelse, etc.) og give et fugleperspektiv af de morfologiske ændringer, de er mindre velegnede til sammenligning af små variationer på tværs af forskellige grupper. Desuden er kvalitative vurderinger baseret på visuel, subjektiv vurdering, hvilket kan føre til over-eller under estimeringer af morfologiske abnormiteter. Endelig kan kvalitative observationer også variere meget mellem individer, hvilket skaber problemer med datareplikering.
I de seneste år er der udviklet en række brugervenlige, let tilgængelige beregningsmæssige algoritmer, som kan analysere billeder kvantitativt. Men udnyttelsen af en sådan billedanalyse software til nogle morfologiske undersøgelser, især i forhold til kropsvæg muskler og mitokondrier, i C. elegans forskning har haltet bagud. For at forbedre underliggende strukturel analyse i C. elegans, nogle af de let tilgængelige, open-source billedanalyse software blev ved til kvantitativt sammenligne virkningerne af genetiske mutationer på muskel mitokondrier, Body Wall muskel og synaptisk Morfologi. Disse eksperimentelle procedurer skitsere i detaljer, hvordan disse programmer (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan bruges til at evaluere ændringer i synaptisk størrelse og synaptisk protein lokalisering, Body Wall muskel område og fiberlængde, og mitokondrie størrelse og cirkularitet som følge af genetiske mutationer i nematoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vækst og vedligeholdelse af C. elegans stammer
- Seed nematode vækst medium (NGM, se tabel over materialer) agar plader med 300 μl af den langsomt voksende E. coli stamme OP50 i et laminar flow kabinet.
- Lad NGM-agarpladerne i laminar flow kabinettet tørre.
Bemærk: i fravær af laminar flow kabinet, kan pladerne overlades til at tørre på bænken, men de er mere tilbøjelige til kontaminering. - Overfør mindst 20 dyr til hver af de to OP50-seeded NGM-agarplader for at have arbejdsbeholdninger. Der er to primære måder at overføre dyr.
- Plukning: løft forsigtigt dyrene ved hjælp af et varme steriliseret pluk. Denne metode er effektiv til at udvælge individuelle eller flere dyr fra en agarplade. At have en lille skrabe af bakterier på spidsen, når picking hjælper overførslen.
Bemærk: en pick er lavet af et lille stykke platin tråd omkring 4 cm lang, der er indlejret i en glas pipette, med wire spidsen fladtrykt til at være ' spyd-lignende '. Varme-sterilisere pick mellem picking for at forhindre krydskontaminering. - Chunking: ved hjælp af en steriliseret spatel skæres et lille kvadrat af agar, der indeholder dyrene fra en plade og overføres på hovedet til en ny plade.
NOTER: denne metode er generelt nyttig til at overføre et stort antal orme, og til at fjerne forurening fra plader gennem flere runder af Chunking ikke-forurenet agar. Undgå krydskontaminering ved flammende spatel i et par sekunder og nedsænkes spatel i 100% ethanol mellem overførsler. Overførsel fra udsultet plader anbefales ikke som sult og overbelægning kan påvirke sundhed og morfologi af cellulære og subcellulære strukturer.
- Plukning: løft forsigtigt dyrene ved hjælp af et varme steriliseret pluk. Denne metode er effektiv til at udvælge individuelle eller flere dyr fra en agarplade. At have en lille skrabe af bakterier på spidsen, når picking hjælper overførslen.
- Vedligehold orme ved standard vækst temperatur (20 °C). For at sikre kontinuerlig forsyning af velnærede orme, Overfør orme til nye OP50-seedede plader hver 2 til 3 dage.
2. alder-synkronisering C. elegans
- Vedligehold orme på 3-4 NGM plader, indtil befolkningen er overfyldt, men ikke sultet.
- Vask forsigtigt ormene af NGM-pladen med M9-opløsning. Æggene vil forblive på pladen, da de holder sig til E. coli OP50. Gentag med fire ekstra vaske trin for at fjerne alle udklækkede dyr.
- Lad orme udklækkes i 40 min.
- Tilsæt 1-2 mL M9-opløsning til pladen, og drej forsigtigt for at løsne de nyligt udklækkede orme.
- Saml M9-løsningen med nyligt fødte orme, og Overfør opløsningen med orme til en frisk NGM-plade.
- Lad M9-opløsningen fordampe ved at udsætte NGM-pladen til luft. Gør dette ved siden af en åben flamme for at undgå kontaminering af NGM-pladen.
- Dyrk orme i 27 timer ved 20 °C for at tillade udvikling i det tredje larve (L3) stadie. For synkroniserede 3-dages gamle voksne dyr, er ormene plukket på larve Stage 4, og dyrkes i yderligere 3 dage for at nå 3-dages gammel voksen scene.
3. klargøring af slides til billeddannelse
- Forbered 3-4% w/v agopstået bestand i en mikrobølgeovn-sikker flaske (3-4 g i 100 ml ultrarent vand).
Bemærk: agar kan anvendes i stedet for agopstået ved samme koncentration. - Smelt agopstod forsigtigt i en mikrobølgeovn, passe på ikke at over koge, indtil alle agat opløses (klar opløsning). Opløsningen opbevares ved 70 °C for at forhindre størkning.
Bemærk: Agopstået bestand kan bruges flere gange. Genopvarmning før brug, hvis den agerede er solidificeret. - Ved hjælp af en Pasteur-pipette placeres en dråbe smeltet agopstået på et mikroskop slide.
Bemærk: undgå at have luftbobler i dråbe agar, da disse forstyrrer integriteten af puden. - Tryk straks på den agopstået dråbe med et andet mikroskop slide, forsigtigt udfladning af agopstod i en pad mellem de to dias.
Bemærk: eventuelle rester af bobler bør fjernes på dette tidspunkt. Hvis ikke, skal der laves nye slides, da dyrene let kan sidde fast i boblerne. Undgå overløb af agar til siden, når du trykker på diaset. - Lad agopstod tørre i 1 min.
- Adskil forsigtigt de to slides for at undgå beskadigelse af agrose, mens du lader den solidificerede pad være på et af diasene.
Bemærk: slides med agrose Pads bør altid tilberedes frisk lige før eksperimentet, da de kan tørre ud. Sørg for, at agrose pad har en ensartet tykkelse. Der bør ikke være luftbobler eller revner i puden, da dette kan forstyrre billeddannelse. - Tilsæt en lille dråbe (5-10 μL) af 0,05% tetramisole hydrochlorid (bedøvelse) til midten af agrose pad.
- Ved hjælp af varme steriliseret pick, hurtigt overføre omkring 10 – 15 dyr fra bestanden pladen til bedøvelsesmidlet dråbe før opløsningen tørrer ud. Undgå at overføre for meget OP50 bakterier, da dette gør opløsningen uklar, hvilket kan forstyrre billeddannelse.
Bemærk: Hvis anæstesi opløsningen tørrer ud under plukningen, skal du blot afpipettere en anden dråbe 0,05% tetramisole hydrochlorid på dyrene. Dyrene har tendens til at lægge på deres laterale side i bedøvelsesmidlet opløsning. - Påfør en dækglas ved at placere den lige over agrose pad og forsigtigt droppe den ned. Dette vil forhindre dannelsen af bobler. Undlad at lægge pres på dæksedlen, da det kan knuse dyrene.
- Mærk diasene med stamme navnet.
4. vurdering af synaptisk morfologi
Bemærk: virkningerne af Mec-17 over ekspression på synapse integritet i den posterior lateral mikrotubulus (PLM) touch receptor neuroner blev undersøgt ved at kvantificere den synaptiske størrelse og lokalisering ved hjælp af linje scanning Konfokal mikroskopi. PLM neuroner (herunder de synaptiske regioner) blev visualiseret ved hjælp af uIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgen (stamme: TU40655) og den synaptiske region var specifikt mærket med jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: gfp) (stamme: NM664 6) . Denne undersøgelse blev udført i synkroniserede L3 ikke-transgene og transgene dyr af ekstrakromosomal MEC-17 overekspression stamme BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37; uIs115]7. En komplet liste over de stammer, der anvendes i dette studie, er medtaget i tabel 1.
- Confocal Imaging af touch receptor neuron synapser
- For at afbilde de synaptiske regioner, bruge en linje scanning confokale mikroskop koblet til en 488 nm og 552 nm optisk pumpet halvleder Diode Laser og udstyret med billedoptagelse software.
- Find orme med den laveste forstørrelse.
- Når dyrene er med held placeret, skifte til en 40X forstørrelse og anvende Immersion medium (i denne undersøgelse: en 40X/1.10 HC PL APO CS2 multi-fordybende mål med vand fordybelse blev brugt).
- Visualiser den synaptiske region ved spændende fluorophorerne med en 488 nm laser (2% effekt) for gfp fluoroforet og 552 nm (1% effekt) for tagrfp fluoroforet.
- Bestem optimal x og y frame til at fange hele synaptisk regionen. Sørg for at overveje den optimale pixelstørrelse, når du vælger rammen. I dette studie blev der opnået en konsistent pixelstørrelse på 56 nm.
- Optag billeder ved hjælp af en hybrid fotodetektor, og Indstil gevinsterne for at forhindre overeksponering af fluorophorerne (100% for 488 nm excitation og 15% for 552 nm excitation).
- Saml z-stack billeder til at dække hele synapse, ved hjælp af den optimale z-trin størrelse afhængigt af den specifikke mål, der anvendes. I dette studie blev der anvendt en optimal z-trins størrelse på 0,211 nm.
Bemærk: Sørg for, at alle billeder er taget under strenge betingelser for at tillade integreret fluorescens kvantificering og sammenligning. Dette kan gøres ved at holde mikroskopi parametre identiske på tværs af alle optagne billeder (dvs. laser og detektor indstillinger, pixelstørrelse, scanningshastighed, og optimal z-trin størrelse). Optimale indstillinger afhænger af målsætningen og kan beregnes ved hjælp af tilgængelige Bioinformatik programmer, såsom Nyquist Calculator (https://svi.nl/NyquistCalculator). Label billeder systematisk, vil dette være nyttigt, når du bruger Bioinformatik software, der vil organisere og behandle filer baseret på filnavn.
-
Kvantificering af den synaptiske region
- Hvis du vil analysere det synaptiske område, skal du eksportere billeder som TIFF-filer. Java-baseret Imaging Processing software som ImageJ, kan bruges (i dette studie blev MRI-billed konverterings makroen i ImageJ brugt).
- Størrelsen og de integrerede fluorescens intensitetsniveauer for synapser blev målt fra summen af de opnåede z-stakke med CellProfiler-3.1.5. Indlæs billederne i CellProfiler 3.1.5-softwaren. Hvis det er nødvendigt, kan billeder filtreres baseret på billedfilnavne.
- Konfigurer navnet og type modulet. Du skal eventuelt udtrække metadataene fra billed etiketten for at organisere beregnede data i overensstemmelse hermed.
- Bestem den synaptiske region ved hånd definition af denne region ved hjælp af diffus tagRFP udtrykt fra uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. Dette kan gøres ved at tilføje angående-modulet til CellProfiler-3.1.5-rørledningen.
- Hvis du vil måle størrelsen og fluorescensen af den hånd definerede synapse, skal du tilføje måle objektets størrelse og form og måle objekt intensitets modulet til pipelinen.
- Beregn den relative integrerede fluorescens intensitet ved at tilføje Beregn matematik modulet. Dividerer de integrerede intensitets enheder fra jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) med de integrerede enheder, som er fremstillet til UIs115 (pmec-17:: tagrfp).
- Eksport målinger og beregninger.
5. kvantificering kroppens væg muskel struktur
- Fluorescens billeddannelse af kroppens væg muskel struktur
- Få en stamme (f. eks. RW1596), der bærer transgenet stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006))8, som mærker MYOSIN Fibers med gfp.
Bemærk: Introduktion af transgenet til dyr kan opnås ved enten at krydse en stamme af interesse med dyr, der allerede udtrykker transgenet, eller mikroindsprøjtning DNA i den distale arm af gonaden. Den ' rullende ' fænotype induceret af ROL-6 mutation i dette transgene letter visualisering af musklerne. Kroppen væg muskler løber langs de dorsale og ventrale sider, der normalt er udelukket fra visning i vilde-type dyr, fordi de typisk ligger på en af deres laterale sider. Den ROL-6 (su1006) allel inducerer vridning af dyrene, og derved udsætte nogle muskler celler til billeddannelse. - Billede dyrene ved hjælp af en fluorescens mikroskop kombineret med en høj opløsning opladet koblet enhed kamera (CCD), 40X objektiv eller højere, GFP filter og erhvervelse software.
- Juster eksponeringstid og belysnings intensitet for at forhindre overmættede billeder.
- Capture og gemme billeder af muskler (400X forstørrelse) fra en del af dyret, der indeholder mindst én komplet synlig skrå muskel celle. Undgå regioner med en enkelt muskel celle, der er ufuldstændig eller sektioner, der er ude af fokus. Også udelukke billeder fra ekstreme forreste og posterior regioner, og regioner støder op til vulva.
Bemærk: hvis dyret ikke har en enkelt synlig komplet muskel celle, skal du forsigtigt skubbe dæksedlen for at dreje dyret for at udsætte en komplet celle.
- Få en stamme (f. eks. RW1596), der bærer transgenet stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006))8, som mærker MYOSIN Fibers med gfp.
- Måling af muskel celleområde
- Åbn billedet i Fiji software9 (version 2.0.0 blev brugt i denne undersøgelse).
- Brug polygon valget til omhyggeligt at spore omkring en enkelt skrå muskel celle. Juster polygon linjen i slutningen ved at trække anker prikken for at forbedre vektoriseringen.
- Gå til fanen Analysér øverst i softwaren, og klik på mål for at beregne området for markeringen. Der vises en separat resultattabel med området og andre målinger. Hvis område målingen mangler i resultattabellen, skal du gå til Angiv mål under fanen Analysér og kontrollere, at feltet område er markeret. På samme måde skal du fjerne markeringen af andre målinger, der ikke er nødvendige.
- For muskelceller med en degenereret/manglende region, spore den manglende region med polygon markeringsværktøjet og klik måle igen. Hvis der er flere huller i cellen, spores hvert hul separat.
- Beregn forholdet mellem Gap område til hele enkelt muskel celle. Et højt forhold indikerer en højere grad af muskel degeneration på grund af store huller i cellen. Hvis der ikke er nogen manglende regioner, som almindeligvis ses af vildtlevende dyr, vil forholdet blive beregnet som nul.
Bemærk: som en kontrol, score også for muskel struktur defekter visuelt og sammenligne resultater med den kvantitative måling. Dette er især nyttigt, hvis stammen bliver undersøgt for første gang i laboratoriet. For fænotypiske scorer, vurdere dyrene som defekte eller ikke-defekte baseret på integriteten af filamenter. F. eks. vil dyr med tab af særskilte glødetråd, GFP-klumpning eller huller i muskelcellerne som følge af strukturel nedbrydning blive scoret som defekte.
- Segmentering og kvantificering af myosin fiberlængde
- Hvis det er nødvendigt, skal du først konvertere filer til. TIF ved hjælp af Fiji eller en anden softwarepakke. Gem TIFF-filerne på den ønskede placering.
- Open ilastik10 (gratis software, version 1.3.2 kan downloades fra https://www.ilastik.org/).
- Når du er i ilastik, Vælg pixel klassifikation under Opret nyt projekt. Softwaren vil bede om, at projektet skal gemmes. Omdøb projektet, og Gem det på den ønskede placering.
Bemærk: der skal kun oprettes et nyt projekt én gang. Efterfølgende segmentering kan gøres ved hjælp af samme projekt. Hvis du vil bruge de samme projekt indstillinger, skal du gå til fanen projekt øverst og klikke på Åbn projekt for at få adgang til projektfilen. - Der bør være 5 faner på venstre panel (input data, valg af funktioner, uddannelse, forudsigelse eksport og batch behandling). I fanen input data skal du klikke på Tilføj ny og derefter tilføje separate billede (r). Direkte pop-up-vinduet til den mappe, der indeholder TIFF-filer og vælg det billede til at åbne.
- I næste faneblad nedenfor ( valgaf funktion), klik på Vælg funktioner for at vælge alle pixel funktioner, angivet med grønne afkrydsede kasser. Pixel valget i dette trin bruges til at skelne mellem de forskellige pixel klasser i næste trin.
Bemærk: valg af pixel funktion afhænger af billedopløsningen. Derfor udviklere foreslår at vælge alle eller så mange funktioner som muligt, hvis behandlingen magt og tid tillader. - Følgende Trænings panel tillader klassifikation af forskellige objektklasser baseret på pixels. I dette tilfælde er de to klasser de enkelte GFP-udtrykker myosin filamenter og uønsket baggrund eller sløret kanter. Klik på Tilføj etiket for at have den første etiket. Scrawl over en række filamenter for at begynde klassifikatoren træning.
Bemærk: Hvis du dobbeltklikker på etiketten, kan du ændre navne (f. eks. omdøbe ' label 1 ' til ' filament '). Hvis du dobbeltklikker på den farvede boks, kan farver til tegning og Sandsynligheds visning ændres. Standardstørrelsen på pensel er 1, selvom størrelsen kan øges til 61. Hvis den forkerte pixel er tegnet, skal du blot bruge værktøjet Viskelæder til at fjerne tegningen. Tastatur kontrol (-) og (Shift +) kan bruges til at zoome ind og ud af billedet, hhv. Piletasterne bruges til at navigere rundt i billedet. - Tilføj endnu en etiket, og Omdøb den til baggrunden. Scrawl over uønskede baggrunde og mellemrum mellem filamenter.
- Klik på Live Update og sørg for, at klassificeringen er udført af softwaren korrekt. Tilføj flere scrawls, og Finjuster træningen, hvis det er nødvendigt.
Bemærk: det er vigtigt at holde øje med fusionerede fibre og slørede kanter (såsom krops linje) i dette trin. Forbedre forudsigelse her så meget som muligt for at øge nøjagtigheden af målinger. Forudsigelses nøjagtigheden afhænger også af billedopløsningen, da pixels i billeder i lav kvalitet er vanskeligere at drille fra hinanden. Det er også valgfrit, men anbefales at køre filter metoden i funktionen foreslå funktioner ved siden af Live Update Control. - Når Trænings klassifikatoren er blevet udført korrekt, skal du gå til panelet forudsigelse Export . Klik på Vælg Eksporter billed Indstillinger med sandsynlig heder som kilde.
- Brug følgende indstillinger. Udskåret subregion x og y afkrydset, og c unticked. Start-og stop værdierne for c skal være henholdsvis 0 og 1. Afkryds og konverter datatype i transformationer til usigneret 8-bit, Tick efter [min, Max] og bruge standardværdierne. Ændre formatet af output fil video til PNG, og omdøbe filen og mappe som ønsket.
- Luk vinduet eksportindstillinger, og Eksporter det specifikke billede, der lige er blevet segmenteret.
- Åbn det gemte PNG-billede i Fiji-softwaren. Billedet skal vises i sort-hvid.
- Juster billedets tærskel ved hjælp af standardindstillingerne.
- Anvende skeletonization plugin (Skeletonize 2D/3D, og derefter analysere skelet). Der vises en separat tabel med resultater, som indeholder forgrenings længde. Filialens længde repræsenterer fiber længden. Andre data i resultaterne kunne også være nyttige, såsom euklidisk afstand.
Bemærk: Udelad fibre med længder på 0 μm eller mere end 250 μm, da disse størrelser ikke er fysiologisk mulige.
6. kvantificering af mitokondrie morfologi
Bemærk: til kvantificering af mitokondrie morfologi anvendte denne undersøgelse BXN0387 -stammen, der indeholdt uIs115 (pmec-17:: tagrfp)5 -transgen til visualisering af PLM-neuroner og jsIs609 (pmec-4:: MLS:: gfp)11 at visualisere mitokondrier specifikt inden for PLM neuroner. Denne undersøgelse blev udført i synkroniserede 3 dage gamle voksne orme, men er med succes blevet udført i andre aldre, samt i andre væv7.
- Fluorescens Imaging af mitokondrier inden for PLM neuroner
- For at målestørrelse og formændringer af mitokondrier inden for PLM neuroner, visualisere både baggrunden neuron og mitokondrier ved hjælp af fluorescerende transgener.
- For at afbilde PLM neuron skal du bruge et Konfokal mikroskop koblet til en 488 nm og 552 nm optisk pumpet halvleder Diode Laser og udstyret med billed optagelses software.
- Billede ormen som pr trin 4.1.1-4.1.4 ovenfor, hvilket sikrer ikke-mættede eksponeringsbetingelser.
- For at visualisere hele Neuron, kan et flisebelagt billede være nødvendigt. For at opnå dette, bruge software med en flise scanning mulighed for at finde og slippe en markør på et hjørne af neuron og derefter finde den modsatte ende og slippe den anden markør. Softwaren vil beregne det optimale antal fliser, der er nødvendige for at fange det ønskede område.
Bemærk: for at reducere scanningstiden er det ofte lettere at finde neuroner, der følger et enkelt plan, hvilket resulterer i færre fliser. - Hvis du vil koble flise scanningen med en Z-stak, skal du indstille de nedre og øvre grænser, før du starter felt scanningen, og sikre, at den optimale skive størrelse er indstillet.
- Sørg for, at opløsningen er optimeret, da segmentering bliver mere raffineret med højere opløsninger (her blev der brugt en opløsning på 3224 x 3224 pixels).
Bemærk: mens uIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgen bruges til at markere PLM og med succes placere kameraet, behøver det ikke nødvendigvis at blive afbildet på grund af let baggrunds fluorescens observeret fra jsIs609 (pmec-4:: MLS:: gfp) transgene inden for selve PLM Axon. Scannings-og billedbehandlings tiden kan således reduceres ved at fjerne 552 nm-filteret fra eksperimentet.
- Objekt segmentering ved hjælp af SQUASSH
- Konverter billedfiler til . TIFF billeder og generere maksimal intensitet projektioner fra Z-stakke ved hjælp af Fiji imaging software. Beskær billeder til den minimale størrelse, mens du stadig indeholder den komplette neuron for at reducere Computational Load og reducere baggrundsstøj.
Bemærk: for de repræsentative resultater, kun mitokondrier inden for de lange axonal processer blev overvejet, så cellen krop og enhver mitokondrier inden blev udelukket fra hvert billede. - Ved hjælp af Mosaic Suite SQUASSH Macro for ImageJ, Udfør split Bregman segmentering12 på de maksimale projektioner. En detaljeret vejledning til installation og anvendelse af denne makro er tilgængelig på Mosaic hjemmeside (http://mosaic.mpi-cbg.de/) og beskrevet af Rizk et al. 201413. Processen med billedsegmentering er beskrevet kort nedenfor.
Bemærk: denne segmentering identificerer objekter (i dette tilfælde individuelle mitokondrier) over en tærskel for fluorescens intensitet, hvilket giver mulighed for nøjagtig måling af hver enkelt objekters størrelse og form. - Fjern baggrundsstøjen fra et billede ved hjælp af rulle kugle metoden, hvor et brugerdefineret vindue bevæger sig hen over billedet, og som imputerende det lokale baggrunds intensitets estimat fra den hyppigst forekommende intensitet i hvert vindue. Dette korrigerer ujævne baggrunds intensiteter.
- Brug objekt genkendelse til groft at finde områder af billedet, der indeholder objekter (mitokondrier) af interesse, baseret på fluorescens intensitet og antallet af pixels. De parametre, der styrer dette trin, er regularisering og minimal objekt intensitet.
Bemærk: regularisering bruges til at undgå segmentering af lille intensitet, støj-induceret toppe, og den minimale objekt intensitet tærskel hjælper med at definere de subcellulære organeller fra baggrunds vævs fluorescens. Disse er de vigtigste to parametre, der er manipuleret for at finde en optimal segmentering af mitokondrier, og optimering processen har tendens til at være retssag og fejl af forskellige parametre for en test billede, efterfulgt af manuel inspektion. - Brug softwaren til at estimere de lokale baggrunds intensiteter omkring hvert objekt for at støtte beregning af optimal segmentering.
- Mål individuelle objekter for størrelse, omkreds, længde via pixel nummer, samt signalintensitet og x/y placering på billedet. Hvis du vil beregne målinger i størrelse (nm), skal du faktor i pixelstørrelsen på det oprindelige billede.
Bemærk: for hvert eksperiment skal de optimale parametre først beregnes. For at sikre nøjagtighed af segmentering, er det tilrådeligt at udføre en SQUASSH analyse på et test billede og manuelt inspicere nøjagtigheden af segmentering. Makroen giver output-filer, der viser de enkelte objekter, som blev identificeret på det oprindelige billede, og inspicere disse nøje og justere parametre, der passer til, vil sikre en nøjagtig segmentering. De definerede parametre skal derefter anvendes til hele forsøget for sammenlignelighed. De parametre, der anvendes til de repræsentative resultater, er medtaget i tabel 2. - Åbn Fiji eller ImageJ Analysis software, Naviger til mosaik makro beholderen og Åbn SQUASSH menuen.
- Åbn undermenuen baggrunds træk , og sørg for at fjerne baggrund? er markeret. Standardværdien for vinduesstørrelse er 10.
- Indstil den ønskede regularisering og minimal objekt intensitet, kanal 1 -værdier for bedst at identificere og segmentere objekter (Se trin 6.2.4). Kanal 2 -værdier er ikke nødvendige for objekter, der er markeret med et enkelt transgen.
- Klik på estimat-PSF fra objektive egenskaber for at estimere funktionen point Spread baseret på mikroskopens egenskaber. Dette hjælper segmentering af tæt placeret objekter ved at regnskab for indflydelsen af hver pixel på sin tilstødende pixel.
Bemærk: subpixel segmentering blev ikke brugt i dette eksperiment på grund af dens øgede belastning på computer processorkraft. Celle masker blev heller ikke brugt, da Axon er let defineret. Disse indstillinger er nyttige til mere komplekse væv og til at definere objekter på en celle for celle basis. - Kontroller, at objekt konturer og Gem objekt-og billedegenskaber er markeret for visualiserings indstillinger. Til senere brug i grafik og statistisk software skal du sikre, at det korrekte antal betingelser er input.
- Find mappen med . TIFF -billeder, og Kør makroen. Denne proces kan udføres på et individuelt billede eller på en batch af billeder pr genotype placeret i en mappe. Output-filer vil blive placeret i mappen sammen med de originale billeder.
- Konverter billedfiler til . TIFF billeder og generere maksimal intensitet projektioner fra Z-stakke ved hjælp af Fiji imaging software. Beskær billeder til den minimale størrelse, mens du stadig indeholder den komplette neuron for at reducere Computational Load og reducere baggrundsstøj.
- Analyse og målinger af form
- Brug outputtet fra SQUASSH til at levere en specificeret Object data . csv -fil, som giver hvert enkelt objekt pr. række, herunder dets målinger som beskrevet ovenfor.
Bemærk: mens denne makro proces automatiserer objekt målinger, er det altid vigtigt at manuelt kontrollere output billeder efter SQUASSH segmentering for at sikre, at makroen har korrekt identificeret mitokondrier. - For at analysere formen af hver mitokondrier, bruge en to-dimensionelle mål for sfærisk, cirkularitet, at estimere afvigelsen af objektet fra en perfekt cirkel.
Bemærk: cirkularitet er en funktion af område og omkreds (cirkularitet = (4 x π) x (område/omkreds2), hvor 1 = en perfekt cirkel og 0 = en lige linje. Dette kan opnås ved hjælp af en formel i grafik og statistisk software. - For at bestemme variansen i størrelse og form på tværs af puljen af mitokondrier, beregne histogrammer og en monteret Gaussisk fordeling ved hjælp af grafik og statistisk software, med beholdere af 0,2 μm for mitokondrie størrelse og 0,05 for mitokondrie cirkularitet.
- Brug outputtet fra SQUASSH til at levere en specificeret Object data . csv -fil, som giver hvert enkelt objekt pr. række, herunder dets målinger som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans er en ideel model organisme til at studere morfologi af forskellige væv og organeller på grund af sin enkelhed, kendt celle Lineage, gennemsigtighed, og tilgængelige værktøjer. Her giver vi kvantitative tilgange til at studere organeller (f. eks. mitokondrier) og væv, herunder synapser og muskler ved hjælp af levende fluorescens Imaging og gratis bio-billedbehandling software.
Streng regulering af MEC-17 udtryk er nødvendig for normal synapse udvikling
For yderligere at forstå funktionen af alpha-Tubulin acetyl-transferase MEC-1714, 15, 16 i nervesystemet, vi studerede synaptisk morfologi i touch receptor neuroner i C. elegans overudtrykker protein17. Disse cellulære strukturer er afgørende for neuron funktion, som de tillader signaler, der skal videregives til tilstødende neuroner. Billeder af PLM synapse blev indsamlet ved hjælp af en Laserscanning confokale mikroskop og kvantitativ morfologi analyse blev udført ved hjælp af tilgængelig bio-billedbehandling software (figur 1a, B). Over ekspression af MEC-17 resulterer i betydelige reduktioner i området for præ-synaptiske ophobninger i PLM og reducerede relative integrerede fluorescens intensiteter af SNB-1:: GFP markør (figur 1C, D). Tilsammen tyder disse resultater på, at overekspression af MEC-17 forstyrrer normal synapse udvikling i PLM touch receptor neuroner.
Størrelsen af det præsynaptiske sted og relativ integreret fluorescens blev undersøgt ved hjælp af den gratis bio-billedbehandling software CellProfiler 3.1.5. På grund af deres komplekse struktur, synapser blev defineret i hånden ved hjælp af diffus tagRFP protein udtrykt fra uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. Arealet af det definerede synapse blev beregnet ud fra antallet af pixels i det definerede område. Sammenlignet med Wild-type kontrol, dyr overudtrykker MEC-17 har signifikant reduceret præ-Synaptic regioner (P = 0,0025; n ≥ 10) (figur 1C). For at studere den synaptiske integritet blev relative integrerede fluorescens intensitetsniveauer desuden sammenlignet. Dette blev beregnet ved at måle integrerede fluorescens intensitetsniveauer inden for den definerede synapse for både SNB-1:: GFP og difsible tagRFP. Efterfølgende blev SNB-1:: GFP-fluorescens værdier i forhold til tagRFP-værdier sammenlignet, for hvilke der blev observeret et signifikant fald (P = 0,0479; n ≥ 10) med OVEREKSPRESSION af Mec-17 (figur 1d). Tilsammen tyder disse resultater på, at den korrekte regulering af MEC-17 er vigtig for udviklingen af synapse.
Kvantitativ måling af krops væggen muskel celleområde og fiberlængde afslører betydelige defekter som følge af mutationer i CMT2-relaterede gener
Mutation i gener MFN2, DNM2 og KIF5A har vist sig at forårsage Charcot-Marie-Tooth type 2 (CMT2), en axonal form af de mest almindeligt nedarvede perifer neuropati18, 19. CMT2 er ofte forbundet med langsomt progressiv distale muskelsvaghed og atrofi, distale sensorisk svækkelse, foden deformiteter og sekundære steppage gangside. Som følge heraf lider patienter ofte af invaliderende livslang bevægelseshæmning. Der er i øjeblikket ingen kur mod sygdommen, dels på grund af genetiske og kliniske heterogenitet forbundet med CMT219, samt en mangel på animalske modeller til at studere sygdoms patofysiologi. Derfor, ved hjælp af dyremodeller til at forstå de underliggende cellulære defekter kan give svar på den ukendte CMT2 sygdomsmekanismer.
Hidtil, offentliggjorte undersøgelser evaluere Body Wall muskel defekter i C. elegans har påberåbt sig visuel scoring snarere end kvantitative målinger20. For at undgå subjektive bias, der kan opstå under kvalitativ vurdering, kvantitative målinger af kropsvæg muskel område og myosin fiberlængde blev ved ved hjælp af tilgængelige billedbehandling programmer. Vi brugte disse metoder til at vurdere muskel morfologi i dyr, der bærer mutationer i FZO-1/MFN2, dyn-1/DNM2 og UNC-116/KIF5A gener i 3-dages voksen C. elegans. For begge målinger blev der anvendt en række betingelser, således at mindst en enkelt komplet skrå muskel celle var i udsigt, muskelceller, der var fuzzy eller ude af fokus blev udelukket, og ekstreme forreste og posterior regioner, samt regioner støder op til vulva blev udeladt. Ud over mutationer i de CMT2-associerede gener, transporterede dyrene også stEx30 (pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) transgen, der mærker en C. elegans myosin tung kæde underenhed med gfp (figur 2a-E). Den simple polygon værktøj i Fiji software9 (version 2.0.0) blev brugt til at måle arealet af en enkelt muskel celle. Hvis et dyr oplevede kroppens væg muskel struktur opdeling, efterlader tomme rum i muskelcellerne, forholdet mellem Gap område til total enkelt muskel celleområde blev beregnet og sammenlignet med vild-type kontrol (figur 3a). For at opnå målinger af myosin fiberlængde blev hvert billede først segmenteret ved hjælp af ilastik software10 (version 1.3.0) (figur 3b). Segmentering er en proces, der gør det muligt for de enkelte muskelfibre at blive klassificeret og adskilt fra uønskede sektioner såsom baggrunden. Efter segmentering blev billedet eksporteret som et ikke-tildelt 8-bit binært billede. Fiji (version 2.0.0) blev derefter brugt til at Skeletonize det binære billede for at filtrere ud kant pixels, efterlader fragmenter, der repræsenterer de oprindelige fibre. Gren længder af skeletter, eller individuelle myosin filamenter, blev derefter analyseret i Fiji. Længde målinger på 0 eller mere end 250 μm, som er den maksimale, rimelige længde for en glødetråd, selv med muskel stræk, blev udelukket. Helt, mellem 2000 til 3000 myosin fiber længder blev målt. En oversigt over segmenterings arbejdsgangen vises i figur 3b. Resultaterne fra den kvantitative analyse blev yderligere sammenlignet med visuel scoring af Body Wall muskel defekter, hvor 3-dages gamle dyr blev kategoriseret som defekte eller ikke-defekt baseret på muskel struktur integritet.
Der blev observeret defekter i krops vægmusklen morfologi mellem 2,5 og 3,5 gange højere i FZO-1 (cjn020), dyn-1 (ky51) og UNC-116 (e2310) dyr end hos vildtlevende dyr under visuel vurdering (figur 4a). De fleste dyr med mutationer i FZO-1 og UNC-116 oplevede iøjnefaldende tab af muskel striber, store gfp sammenklumpning på grund af ophobning af cellulære rester, og muskel fiber degeneration, der forlod gabende rum i muskelcellerne ( Figur 2C, E). Mens mere end 60% af dyn-1- mutanter blev scoret visuelt defekt, var omfanget af defekter i modsætning til de to andre genetiske mutanter minimal. Der var kun let tab af striber, ingen GFP-aggregeringer og kun mindre muskel degeneration sammenlignet med de to andre mutanter (figur 2D og figur 4a). Som med andre fænotypiske scorer, kunne omfanget af defekter ikke overvejes, og en tendens til bias kan forårsage en større andel af defekter, der skal registreres. Derfor, kvantitative målinger af muskel celleområde og fiberlængde ville give en mere præcis gengivelse af omfanget af muskel defekter end visuel vurdering alene. I overensstemmelse med de store huller, der blev observeret med visuel scoring, viste forholdet mellem Gap-arealet og det samlede enkelt celleområde sig at være 5 til 6 gange højere i FZO-1 -og UNC-116- mutante dyr sammenlignet med gruppen af vildtlevende typer, som kun oplevede ubetydelig nedbrydning af muskelstrukturen (figur 4b). Den manglende strukturelle sammenbrud i dyn-1 mutanter resulterede i en ikke-signifikant, 3-fold stigning i Gap til muskel celleområde ratio (figur 4b). Dette indikerer også, at eksperimententer bias kan være en faktor, der bidrager til den høje andel af defekter tildelt ved kvalitativ vurdering. Ikke desto mindre reducerede de små huller den gennemsnitlige fiberlængde fra 24 μm i vildtype til 22 μm i dyn-1- mutanter (figur 4c). Den gennemsnitlige fiberlængde var dramatisk kortere i FZO-1 og UNC-116 mutanter, korrelerende med tilstedeværelsen af større huller i degenererede muskelceller i disse dyr (figur 2C,E og figur 4c ). Disse resultater er i overensstemmelse med vores seneste resultater undersøger virkningerne af muterede CMT2-asscoiated gener i C. elegans20. Desuden fremhæver de den mere præcise vurdering af muskel morfologi ved hjælp af disse kvantitative metoder i forhold til visuel scoring alene, og giver bevis for, at FZO-1 og UNC-116 er nødvendige for normal muskel morfologi.
Kvantitative målinger af mitokondrie morfologi ved hjælp af SQUASSH objekt segmentering
For at forstå, hvordan fraværet af mitokondriel fission påvirker mitokondrie morfologi i C. elegans neuroner, udførte vi kvantitative analyser i PLM mechanosensoriske neuroner. DRP-1, C. elegans orthologue af pattedyrs dynamin-relaterede protein 1 (DRP1), styrer mitokondriel fission, hvor der ved aktivering rekrutteres fra cytosol til dannelse af en spiral omkring mitokondrier, forsnævring og til sidst at afbryde både de indre og ydre mitokondrielle membraner21, 22. Vi fluorescently mærket mitokondrier med et vævs specifikt transgen i PLM neuroner, som har en lang axonal proces, der let kan visualiseres ved hjælp af epifluorescens mikroskopi. Et tab af fission er en hypotese at forstyrre samlede mitokondrie dynamik, og derfor mindske skabelsen af nyere, mindre mitokondrier gennem en proces kendt som spirende23.
Vi udførte SQUASSH segmentering for at sammenligne mitokondrie morfologi i vilde-type og DRP-1 mutant dyr. Vi analyserede mitokondrierne fra 6 PLM neuroner per genotype, hvilket resulterede i en n værdi af større at 200 mitochondrier for hver. Skematiske og repræsentative billeder er vist i figur 5a, B. Vi konstaterede, at mutanter, der manglede DRP-1, havde større og mere langstrakt mitokondrier (figur 5b-F). Mitokondrier i DRP-1- mutant baggrund var 32% større end vildtype (p = 0,0006, figur 5c) og 14% mere langstrakt (længere fra en perfekt cirkel) (p < 0,0001, figur 5D). For en mere detaljeret vurdering af variansen i størrelse og form, vi plottet histogrammer for hver foranstaltning, tilpasning af data til Gaussian distributioner (figur 5E, F). Vi fandt, at for både størrelse og cirkularitet, mutanter mangler fissions proteinet havde en større varians (p < 0,0001 for begge), fremhævet af tilstedeværelsen af større og mere aflange mitokondrier/mitokondrie netværk (Se figur 5Bii for eksempler ). Samlet set fandt vi beviser for, at mutation af DRP-1 forårsager en mangel på fission inden for PLM neuroner, hvilket resulterer i større og mere aflange mitokondrier. Vi har også vist, at afbrydelse af mitokondriel fission forårsager en stigning i variansen af mitokondrie morfologi.
Figur 1: kvantificering af synapse-integriteten i PLM-neuroner. (A) billeder er maksimale z-projektioner af PLM synaptisk region i et ikke-transgene dyr. Det venstre panel viser PLM neuron mærket med tagRFP, det andet panel viser den præ-Synaptic region mærket med SNB-1:: GFP, det tredje billede er en overlay med co-lokalisering repræsenteret i gul, og det fjerde panel er en skematisk af overlay billede. (B) maksimal z-projektion konfokale billeder af den synaptiske region i dyr overudtrykker MEC-17. Billeder vises som pr. panel A. C) størrelses kvantificering af det præ-synaptiske område i ikke-transgene sammenlignet med transgene dyr, der overudtrykker MEC-17. D) kvantificering af det relative integrerede fluorescens niveau for SNB-1:: gfp i ikke-transgenics versus transgene dyr, som overudtrykker MEC-17. For (C) og (D), individuelle synapser analyseres er repræsenteret ved cirkler; n ≥ 10; gennemsnit ± S.E. vist med sort. P -værdier * < 0,05, * * < 0,01 fra ikke-parrede t-tests; skala søjler repræsenterer 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: visualisering af C. elegans Body Wall muskler. A) et dyr, der udtrykker StEx30 (pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) transgene, som etiketter myosin tunge kæde med gfp i kroppen væg muskler. Arrayet inducerer også en rullende fænotype i dyret, der letter visualisering af muskelcellerne arrangeret langs rygnings-og ventrale sider af kroppen. Repræsentative forstørrede visninger af myosin fibre i (B) Wild-type, (C) FZO-1 (cjn020), (D) dyn-1 (ky51) og (E) UNC-116 (e2310) dyr. Alle dyr blev afbildet på den 3-dages gamle voksen scene. Skalalinjen repræsenterer 60 μm i (A) og 30 μm i (B-E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: måling krop væg muskel område og fiberlængde ved hjælp af tilgængelige beregningsmæssige algoritmer. (A) eksempelbillede, der viser, hvordan det indvendige mellemrums mellemrum i en enkelt muskel celle (rød-lukket), og arealet af hele cellen (gul-lukket) tegnes og beregnes i Fiji for at opnå muskel arealet ratio. (B) skitse af segmenterings protokol på et enkelt eksempelbillede ved hjælp af en kombination af Fiji og ilastik. Scale bar repræsenterer 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvalifikation og kvantificering af muskel defekter i krops væggen. A) visuel vurdering af muskel defekter i krops væggen. (B) sammenligning af tomt rumområde til det totale muskelcelleareal forhold mellem WT og indikerede mutanter. C) måling af myosin fiberlængde. For (B) og (C), kun billeder med mindst én komplet synlig skrå muskel celle blev inkluderet til analyse. Fibre med en længde på 0 μm eller længere end 250 μm blev også udelukket. Stænger repræsenterer procentvise defekte dyr i (A) og gennemsnit ± S.E.M. i (B) og (C); n værdier, der er angivet i hver bjælke. Chi-firkantet test med falsk Discovery-hastighed blev udført for at sammenligne visuelle defekter i (A), hvorimod envejs-ANOVA med Dunnetts post hoc-test til flere sammenligninger blev anvendt til at analysere kvantitative målinger i (B) og (C). *P < 0,05, * * * *p < 0,0001, NS = ikke signifikant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: mitokondrie morfologi i axonerne af PLM neuroner. (A) skematisk af en posterior lateral mikrotubule (PLM) mechanosensorisk neuron i halen af C. elegans. Den røde boks angiver den omtrentlige placering af de fremhævede sektioner i (B), som viser repræsentative billeder af gfp mærket mitokondrier (pmec-4:: MLS:: gfp) inden for PLM Axon. Lysegrøn punkta indikerer mitokondrier. Sammenlignet med WT (i), DRP-1 (tm1108) mutanter (II) viser større, mere aflange mitokondrier. Billeder er repræsentative for n = 6 PLM axoner fra 6 orme pr. genotype; skala stænger = 15 μm. (C) middelstørrelse (μm2) af individuel mitokondrion som kvantificeret ved squassh objekt segmentering i 3-dages gammel voksen (3doa) orme. D) gennemsnitlig cirkularitet af individuelle mitokondrier inden for PLM Axon, som kvantificeret ved målinger af SQUASSH-objekter i 3DOAs. E) histogrammet og Gaussisk Distribution, der viser variabiliteten af mitokondrie størrelse. F test (P < 0,0001) viser, at afvigelser er signifikant forskellige mellem DRP-1 og WT. f) histogrammet og Gaussisk fordeling, der viser variansen af mitokondrie cirkularitet. Data er repræsenteret som Mean +/-SEM. * * * p < 0,001, * * * * p ≪ 0.0001 fra welchs t-test; n ≥ 204 mitokondrier til kvantitativ analyse fra n = 6 orme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stamme navn | Genotype | Kilde | Reference # | ||
| BXN038 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP) | Neumann Lab | 7 | ||
| BXN366 | FZO-1 (cjn020); MYO-3 (st386); zdIs5 (Pmec-4:: GFP); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| BXN419 | DRP-1 (tm1108); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Lab | 7 | ||
| BXN507 | cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Lab | 17 | ||
| BXN675 | UNC-116 (e2310); MYO-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| BXN685 | dyn-1 (ky51); MYO-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| NM664 | jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765) | Caenorhabditis Genetik Center | 6 | ||
| RW1596 | MYO-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Caenorhabditis Genetik Center | 8 | ||
| TU4065 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Martin Chalfie | 5 | ||
Tabel 1. Liste over C. elegans stammer, der anvendes i dette studie.
| PLM Axon-billeder | |
| Mål | 40x |
| Billedopløsning (pr. panel for tilescan) | 3224 x 3224 |
| Baggrund fjernelse vindue størrelse | 20 |
| PSF XY | 0,78 |
| PSF z | 0,68 |
| Legalisering | 0,15 |
| Mindste fluorescens intensitet af GFP | 0,4 |
Tabel 2. SQUASSH parametre for segmentering af mitochondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Morfologiske variationer er ofte blevet vurderet via manuel optælling af mærkbare forskelle eller ved hjælp af vilkårlige tærskler for at bestemme defekter i forhold til en vildtype fænotype. For nylig er der imidlertid blevet anvendt kvantitative metoder til sammenlignende undersøgelser af morfologi for nøjagtigt at måle og beskrive ændringer på et cellulært og subcellulært niveau på en upartisk måde. Evnen til at identificere subtile, men biologisk relevante forskelle mellem fænotyper er et effektivt middel til at forstå de underliggende molekylære mekanismer, der kontrollerer ændringer i morfologi forårsaget af miljøfaktorer eller genetiske sygdomme. De fortsatte stigninger i beregningskraft og mikroskopi billeddannelse opløsning, kombineret med den lethed af vækst og alsidigheden af C. elegans genetik har givet den perfekte platform for kombinationen af sofistikerede endnu gratis imaging software med fine detaljerede konfokale billeder. Her har vi demonstreret metoder til at evaluere og kvantificere synaptisk størrelse og protein lokalisering, Body Wall muskel område og fiberlængde, og mitokondrie morfologi i en række genetiske baggrunde.
Mens disse analyser har vist en evne til at kvantificere subtile morfologiske forskelle, er der begrænsninger. Selv om hver af disse analyser gør brug af open source og let tilgængelig software, de er afhængige af høj kvalitet, skarpe billeder til præcist at løse cellulære strukturer og subcellulære organelles. Dette kan ofte være en begrænsende trin, som følsomt high-end udstyr, såsom confokale mikroskoper med avancerede detektorer, er forpligtet til at tage billeder med tilfredsstillende opløsning. Disse er ikke altid tilgængelige for laboratorier, og analyse med sub-par-teknologi kan føre til unøjagtige og ikke-gentagelige resultater. Desuden, mens hver teknik har til formål at reducere eksperimententer bias ved hjælp af computer algoritmer, der er stadig skridt, der kan indebære et element af menneskelige fejl. Den manuelle definition af synapse i hånden, skitserer af muskel celleområde, parameter optimeringer af mitokondrie segmentering af øjet er alle områder, der kan forbedres i denne henseende. For at mindske risikoen for menneskelige fejl, undersøgelser kunne udføres i en blindet måde eller alternativt billedanalyse software kan bruges til at definere regionen af interesse selv. Ved hjælp af celle masker, hvor det ønskede område til analyse er defineret af fluorescens på en anden bølgelængde, kan hjælpe dette. Dette bruges til at begrænse analysen til en del af et billede, der viser fluorescens over en fastsat tærskel, såsom en celles kerne eller en transficeret celle13,24. Desuden begrænser brugen af Single time point-billeder de spørgsmål, som disse teknikker kan løse. De processer, der regulerer organelle morfologi, synapse dannelse og muskel struktur er mest sandsynligt dynamisk, og forskelle kan ses inden for samme celle afhængigt af den udviklingsmæssige eller biologiske tilstand. En analyse af disse strukturer på et bestemt slutpunkt kan derfor være begrænsende, og tidsforskudt billeddannelse vil være gavnlig for overvågningen af strukturelle ændringer over tid. Endelig, mens morfologiske ændringer kan være en god indikator for forstyrrelse i cellulære processer, korrelation er ikke altid implicit. For eksempel har nylige fund i forskellige arter vist, at mitokondrie funktion og form faktisk kan adskilles fra7,25. Derfor skal yderligere assays tages i betragtning, når udlede funktionelle ændringer som følge af morfologiske forskelle.
Vi har været i stand til at demonstrere brugen af disse kvantitative teknikker i et bestemt sæt af væv og genetiske baggrunde; Men, deres anvendelse kan anvendes mere bredt. Fluorescens kvantificering via imaging software kan bruges til at analysere en række forskellige subcellulære organeller såsom kerner og endosomer, eller forskellige strukturer såsom neuroner og epitelceller, alle inden for rammerne af forskellige mutant eller sygdom Baggrunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af Neumann Lab for værdifulde diskussioner og input. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH kontor for forskning infrastrukturprogrammer (P40 OD010440). Forfatterne takker WormBase for sin rigdom af information om C. elegans, og anerkender Monash Micro Imaging, Monash University, for tilvejebringelse af instrumentering, uddannelse og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af CMTAA-forskningsstipendier (2015 og 2018), og NHMRC-projekttilskud 1101974 og 1099690 blev tildelt B.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
