Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة

Published: August 2, 2019 doi: 10.3791/59982
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات الغلوتامات (GluR) الاتجار في الثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة. باستخدام نهج تغذية الأجسام المضادة لتسمية مستقبلات ذاتية أو مبالغ فيها في تركيبة مع النهج الدوائية، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير سطح غلور عن طريق تحوير عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير.

Abstract

الاستجابات الخلوية للمحفزات الخارجية تعتمد بشكل كبير على مجموعة من المستقبلات التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية في لحظة معينة. وبناء على ذلك، فإن عدد المستقبلات التي يعبر عنها السطح يتكيف باستمرار ويخضع لآليات صارمة للتنظيم. المثال النموذجي واحد من أحداث الاتجار الأكثر دراسة في علم الأحياء هو السيطرة المنظمة للتعبير متشابك من مستقبلات الغلوتامات (غلورس). تتوسط GluRs الغالبية العظمى من انتقال الأعصاب المحفزة في الجهاز العصبي المركزي والسيطرة على التغيرات الوظيفية والهيكلية التي تعتمد على النشاط الفسيولوجي على مستويات متشابك والخلايا العصبية (على سبيل المثال، اللدونة متشابك). التعديلات في عدد, موقع, وتكوين الوحدة الفرعية من السطح أعرب GluRs تؤثر بعمق على وظيفة الخلايا العصبية، وفي الواقع, ترتبط التعديلات في هذه العوامل مع اعتلال اتّصالات عصبيّة مختلفة. المعروضة هنا هي طريقة لدراسة الاتجار GluR في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر المنفصلة. يتم استخدام نهج "تغذية الأجسام المضادة" لتصور بشكل تفاضلي مجموعات غلور المعبر عنها في السطح والأغشية الداخلية. من خلال وضع علامات على مستقبلات السطح على الخلايا الحية وإصلاحها في أوقات مختلفة للسماح لمستقبلات بطانة الرحم و / أو إعادة التدوير، يمكن تقييم عمليات الاتجار هذه ودراستها بشكل انتقائي. هذا هو بروتوكول تنوعا التي يمكن استخدامها في تركيبة مع النهج الدوائية أو الإفراط في التعبير عن المستقبلات المعدلة للحصول على معلومات قيمة حول المحفزات والآليات الجزيئية التي تؤثر على الاتجار GluR. وبالمثل, ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة مستقبلات أخرى أو البروتينات السطحية أعرب.

Introduction

الخلايا الاستفادة من العملية النشطة للاتجار لتعبئة البروتينات لتوطين تحت الخلية محددة وممارسة صارمة spatiotemporal التنظيم على وظيفتها1. هذه العملية مهمة بشكل خاص لمستقبلات عبر الغشاء، كما الاستجابات الخلوية لمختلف المحفزات البيئية تعتمد على السلاسل التعاقبية داخل الخلايا الناجمة عن تنشيط مستقبلات. الخلايا قادرة على تعديل هذه الاستجابات عن طريق تغيير الكثافة، والتوطين، وتكوين الوحدة الفرعية من المستقبلات المعبر عنها على سطح الخلية عن طريق مستقبلات تحت الخلية تنظيم الاتجار2. إدراج مستقبلات مُدمجة حديثاً في غشاء البلازما، جنباً إلى جنب مع بطانة الرحم وإعادة تدوير المستقبلات الموجودة هي أمثلة على عمليات الاتجار التي تحدد المجموعة الصافية من المستقبلات التي يعبر عنها السطح2. العديد من الآليات الجزيئية تتعاون لتنظيم الاتجار بالبروتين، بما في ذلك تفاعلات البروتين البروتين والتعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفورية، أو التعليب، أو palmitoylation2.

إن تنظيم الاتجار بالمستقبلات مطلوب بشكل خاص في الخلايا المستقطبة بشدة ذات الهياكل المتخصصة للغاية. المثال النموذجي هو السيطرة على وظيفة الخلايا العصبية عن طريق تنظيم الاتجار بمستقبلات الغلوتامات (GluRs)3،4. الجلوتامات، الناقل العصبي المحفز الرئيسي، يربط وينشط الغلورس التي يعبر عنها السطح للسيطرة على الوظائف العصبية الفسيولوجية الأساسية مثل انتقال الأعصاب متشابك واللدونة متشابك. حقيقة أن تغيير الاتجار GluR لوحظ في مجموعة واسعة من الاعتلالات العصبية، بدءا من اضطرابات النمو العصبي إلى الأمراض العصبية التنكسية، يسلط الضوء على أهمية هذه العملية5. وبالتالي، فإن فهم الأحداث الجزيئية التي تتحكم في الاتجار بجلوآر هو أمر ذو أهمية في العديد من مجالات البحث.

في هذا البروتوكول، يتم استخدام طريقة تعتمد على تغذية الأجسام المضادة لتحديد مستوى الغلورس التي يتم التعبير عنها على السطح في الخلايا العصبية الرئيسية لفرس النهر، فضلاً عن تقييم كيفية تؤدي التغيرات في الاستيعاب وإعادة التدوير إلى التعبير الصافي للسطح الملاحظ. استخدام الصيدلة و / أو التعبير المفرط من المستقبلات الخارجية التي تأوي طفرات محددة يجعل هذا البروتوكول نهجا قويا بشكل خاص لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء التكيف الخلايا العصبية لمختلف المحفزات البيئية. ومن الأمثلة النهائية على فائدة هذا البروتوكول دراسة كيفية تأثير التغيرات المتعددة العوامل في البيئة (كما هو الحال في نماذج المرض) على الاتجار بجلوآر من خلال فحص التعبير السطحي في هذه النماذج.

باستخدام أمثلة محددة، يتم إثبات في البداية كيف أن التلاعب الدوائي الذي يحاكي التحفيز الفسيولوجي متشابك [LTP الكيميائية (cLTP)] يزيد من التعبير السطحي للوحدة الفرعية GluA1 الذاتية من نوع AMPA من GluRs (AMPARs) 6- ويجري أيضا تحليل الاتجار بشكل فوسفي - mimetic مبالغ فيه من الوحدة الفرعية GluN2B من نوع الغلورس NMDA (NMDARs) لتجسيد كيفية استخدام هذا البروتوكول لدراسة تنظيم الاتجار بجلوران اتّصالا ً بمرحلة ما بعد الترجمة التعديلات. على الرغم من أن هذه الأمثلة المحددة تستخدم، يمكن بسهولة تطبيق هذا البروتوكول على GluRs الأخرى وغيرها من المستقبلات والبروتينات التي تمتلك مجالات خارج الخلية المضادة للجينات. في حالة عدم وجود أجسام مضادة متاحة للمجالات خارج الخلية، يمكن أن تساعد البروتينات في وضع العلامات على البروتين في وضع العلامات على الأيض خارج الخلية (على سبيل المثال، العلم، Myc-، GFP-agged، إلخ).

ويوفر البروتوكول الحالي تعليمات لتحديد الكثافة الفرعية المحددة للغلور والاتجار بها باستخدام أجسام مضادة محددة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة 1) مجموع التعبير السطحي GluR، 2) استيعاب GluR، و 3) إعادة تدوير GluR. ولدراسة كل عملية على حدة، يُنصح بالبدء بالقسمين 1 و2 ومواصلة العمل إما في القسم 3 أو 4 أو 5. في جميع الحالات، الانتهاء معالقسمين 6 و 8 (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقامت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نورث وسترن (البروتوكول #IS00001151) باستعراض الأعمال المتعلقة بإعداد ثقافة فرس النهر الأولية والموافقة عليها.

1. التحضير قبل وضع العلامات

  1. إعداد وصيانة الثقافات الرئيسية لفرس النهر
    1. إعداد الثقافات فرس النهر الأولية في كثافة 150،000 خلية مطلية على بولي-د-يسين المغلفة (0.1 ملغ / مل) 18 مم غطاء النظارات. أدلة ممتازة لإعداد الثقافة العصبية منفصلة متوفرة7،8.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن التعامل مع الثقافات مع السيتوزين أرابينوسيد (آرا-C، 10 mM من DIV1) لتجنب انتشار الدبقية في التحضير.
      ملاحظة: يمكن استخدام الكواشف الطلاء البديلة مثل الفيبرونكتين (1 ملغ / مل) أو لامينين (5 ملغ / مل) بدلا من بولي د-يسين.
    2. الحفاظ على الثقافات في حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في 2 مل / جيدا من وسائل الإعلام العصبية مع B27 و 2 مل L-الجلوتامين.
      ملاحظة: يمكن استخدام بدائل L-الجلوتامين (على سبيل المثال، الجلوتاماكس)، إذا رغبت في ذلك.
    3. على أساس أسبوعي، إزالة نصف حجم وسائل الإعلام واستبدالها بنفس الحجم من وسائل الإعلام العصبية التكميلية.
  2. اختياري: التغوط من المستقبلات المتحولة و / أو ذات العلامات الظهارية
    ملاحظة:     يجب أن يتم نقل الخلايا العصبية 3-4 أيام على الأقل قبل نقطة وقت التحليل للسماح للتعبير مستقبلات. استخدام الخلايا العصبية الشابة [أيام في المختبر 6-9 (DIV6-9)] يؤدي إلى كفاءة تحويل أفضل من الخلايا العصبية القديمة (DIV15-20)، ولكن يمكن تحقيق عدد كاف من الخلايا المتحولة (>20) بغض النظر عن DIV المستخدمة.
    1. لكل بئر من لوحة 12 جيدا، تمييع 1.5 ميكروغرام من بلازميد تحتوي على بناء الاهتمام في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام العصبية الطازجة دون B27 أو مكملات الجلوتامين في أنبوب الطرد المركزي الجزئي ومزيج عن طريق دوامة بسرعة.
      ملاحظة: للمثّلة الناجحة، من الأهمية بمكان أن تكون الوسائط العصبية المستخدمة طازجة قدر الإمكان، ومن الناحية المثالية أقل من أسبوع واحد بعد فتح الزجاجة.
    2. في أنبوب الطرد المركزي الصغير الثاني، مزيج 1 ميكرولتر من كاشف lipofection المناسبة في 100 درجة مئوية من وسائل الإعلام العصبية الطازجة ومزيج بلطف.
      ملاحظة: لا تُرْكُمخليط الكاشف الليبوفيك. استخدام الكواشف lipofection الطازجة يمكن أن يحسن كفاءة التغوط.
    3. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. يُضاف خليط الكاشف الليبوفاتيكيعلى إلى خليط الحمض النووي، ويُمزج برفق، ويُحضن لمدة 20 دقيقة في RT.
    5. ضبط حجم الوسائط في كل بئر إلى 1 مل من الوسائط المكيفة.
    6. إضافة كاشف lipofection -DNA خليط قطرة إلى البئر.
    7. اعادة الخلايا الى الحاضنة واتيحت 3-4 ايام على الاقل للتعبير عن البروتين.
      ملاحظة: لأغراض بروتوكولات الاستيعاب وإعادة التدوير المبينة أدناه، تم نقل الخلايا العصبية في فرس النهر في DIV11-12 مع المنشآت التي تعبر عن GluN2B الموسومة GFP في المجال خارج الخلية (GFP-GluN2B) وصورتها في DIV15-16.
  3. اختياري: حضانة الخلايا مع المخدرات (بشكل مزمن أو حاد) في وسائل الإعلام مكيفة حتى التثبيت.
    ملاحظة:     للعلاج الحاد، بدء علاج الخلايا قبل وضع العلامات. واعتمادا على بروتوكول العلاج من المخدرات المستخدم، يمكن الاحتفاظ بالخلايا في وسائط تحتوي على المخدرات خلال القسم 2. في مثالنا، كانت خلايا DIV21 تخضع لبروتوكول cLTP لزيادة AMPAR 9 التي يعبر عنها السطح.
    1. تبادل الوسائط مشروطة للحل خارج الخلية (ECS).
    2. علاج الخلايا مع 300 ميكرومتر غليسين في ECS لمدة 3 دقائق في RT. كتحكم، علاج غطاء شقيقة مع ECS (دون الجلايسين).
    3. غسل الخلايا 3X مع 37 درجة مئوية ECS وإعادة الخلايا في ECS (دون الجلايسين) إلى حاضنة الخلية لمدة 20 دقيقة قبل الاستمرار مع القسم 2.
      ملاحظة:ECS (في MM): 150 NaCl، 2 CaCl2،5 KCl، 10 HEPES، 30 الجلوكوز، 0.001 TTX، 0.01 strychnine، و 0.03 picrotoxin في pH 7.4.

2. وضع العلامات الحية من المستقبلات التي يعبر عنها السطح

  1. إعداد الأغطية لوضع العلامات
    1. لحفظ الكواشف وتسهيل التلاعب، نقل coverlips جانب الخلية تصل إلى علبة مغطاة بالبارافين.
      ملاحظة: من المهم عدم السماح للعينات بالجفاف.
    2. حفظ والحفاظ على وسائل الإعلام مكيفة في 37 درجة مئوية لخطوات الحضانة والغسيل.
      ملاحظة: بالنسبة للغطاء 18 مم، يوصى بالحضانة مع 75-100 ميكرولتر من الوسائط لوضع العلامات على الأجسام المضادة و120-150 ميكرولتر للتدخيل/إعادة التدوير.
  2. وضع العلامات على مستقبلات السطح مع الأجسام المضادة الأولية
    1. حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في وسائل الإعلام مكيفة لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: لمستقبلات GFP الموسومة، تم استخدام الأجسام المضادة للأرنب المضادة لGFP في تخفيف 1:1000. بالنسبة لGluA1 الذاتية، تم استخدام الماوس المضادة GluA1 في تخفيف 1:200.
    2. يستنشق بعناية قبالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الأجسام المضادة باستخدام ماصة فراغ وغسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام مكيفة.
      ملاحظة: إذا كانت الوسائط المكيفة غير متوفرة، يمكن تنفيذ كافة خطوات الغسيل باستخدام PBS+ [الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1 mM MgCl2 و 0.1 mM CaCl2]. يمكن إجراء الطموح اليدوي باستخدام micropipette إذا لم يكن هناك طموح فراغ لطيف.

3. التعبيرالسطحي (الشكل 2)

  1. تسمية الأجسام المضادة الثانوية للمستقبلات التي يعبر عنها السطح
    1. غسل مرة واحدة مع PBS +.
    2. إصلاح الخلايا عن طريق احتضان مع 4٪ بارافورمالهايد (PFA) والسكروز 4٪ في PBS لمدة 7-8 دقائق.
      ملاحظة: على عكس أساليب التثبيت الأخرى مثل حضانة الميثانول، PFA لا permeabilize غشاء البلازما، وبالتالي هو مناسبة لتحليل التعبير السطحي. للحصول على أفضل النتائج، استخدم PFA المعدة حديثًا. التخزين القصير الأجل لPFA عند 4 درجة مئوية أو على المدى الطويل (حتى 30 يوما) التخزين في -20 درجة مئوية هو متساهل لتثبيت كافية.
      تحذير: PFA هو مسرطن معروف. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء محرك السيارة السلامة عند المناولة.
    3. غسل الخلايا ثلاث مرات مع PBS العادية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام 0.1 M الجلايسين لغسل PFA بدلا من PBS، كما الجلايسين سوف تسقي أي المثبت المتبقية التي قد تزيد من الخلفية في التحضير.
    4. منع مواقع ملزمة غير محددة عن طريق الحضانة مع 10٪ مصل الماعز العادي (NGS) في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
      ملاحظة: يمكن تمديد وقت حظر دون آثار سلبية على وضع العلامات.
    5. حضانة مع الجسم المضاد الثانوي الفلورسنت الموسومة المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT لتسمية مستقبلات الأولية التي تحمل اسم الأجسام المضادة (أي، سطح أعرب).
      ملاحظة: في هذه الأمثلة، تم استخدام تخفيف 1:500 من الأجسام المضادة الثانوية اليكسا 555-المترافقة: الماعز المضادة للأرنب لمستقبلات GFP المسمى والماعز المضادة للماوس لGluA1.
    6. غسل الخلايا مع PBS 3X.
  2. وضع العلامات على المستقبلات داخل الخلايا
    1. الخلايا التبرّهة مع 0.25% تريتون X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق في RT.
      ملاحظة: للتحقق من أن الجولة الأولى من وضع العلامات على الأجسام المضادة تحتل جميع الepitopes السطح، يمكن تخطي هذه الخطوة نفاذيبيليت في ثقافة شقيقة. في هذه الحالة ، لا ينبغي الحصول على أي إشارة لمستقبلات داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، للتحقق من أنه لم يتم تسمية أي مستقبلات داخلية في القسم السابق 2 (أي، مما يدل على سلامة أغشية البلازما في الثقافة)، يمكن تخطي خطوة نفاذية في ثقافة شقيقة، والأجسام المضادة الأولية ضد يمكن استخدام البروتين داخل الخلايا (على سبيل المثال، PSD-95 أو MAP2) في الخطوة 2.2.1. ولا ينبغي الحصول على أي إشارة من هذه المرحلة الابتدائية في ظل هذه الظروف. في هذه الحالة، تم استخدام جسم مضاد مضاد لـ PSD-95 (1:500).
    2. كتلة مع 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. تسمية المستقبلات داخل الخلايا عن طريق احتضان الخلايا نفاذية مع نفس الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في القسم 2.2 المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: قد يكون تخفيف الأجسام المضادة لوضع العلامات على المستقبلات داخل الخلايا مختلفاً عن تلك المطلوبة لوضع العلامات على المستقبلات التي يعبر عنها السطح. في مثال GluA1، تم استخدام نفس تخفيف الأجسام المضادة (1:200).
    4. غسل الخلايا 3X مع PBS.
    5. تسمية مع ثاني الفلورسنت الموسومة الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: في هذه الأمثلة، تم استخدام تخفيف 1:500 من الماعز المضادة للماوس اليكسا 647-المترافق الأجسام المضادة الثانوية (لGluA1).
    6. غسل الخلايا 3X مع PBS.

4. الاستيعاب الداخلي (الشكل 3)

  1. استيعاب مستقبلات السطح التي تحمل اسم الأجسام المضادة
    1. بعد وضع العلامات على المستقبلات التي يعبر عنها السطح وغسل الأجسام المضادة (القسم 2.2)، والحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام مكيفة دون الأجسام المضادة وإعادتها إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح للاستيعاب.
      ملاحظة: لمستقبلات NMDA، ينصح 30 دقيقة للتدخيل. كعنصر تحكم، يمكن الحفاظ على ثقافة شقيقة مع وسائل الإعلام مشروطة في 4 درجة مئوية أثناء عملية الاستيعاب الداخلي. وينبغي أن يحدث الحد الأدنى من استيعاب مستقبلات في ظل هذه الظروف.
  2. وضع العلامات على المستقبلات السطحية
    1. غسل الخلايا مرة واحدة مع PBS +.
    2. إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA والسكروز 4٪ في PBS لمدة 7-8 دقائق.
      تحذير: استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء محرك السيارة السلامة عند التعامل مع PFA.
    3. غسل الخلايا 3X مع PBS العادية.
    4. كتلة مع NGS 10٪ في PBS لمدة 30 دقيقة في RT لمنع الربط غير محدد.
    5. احتضان عينات مع الجسم المضاد الثانوي الفلورسنت الموسومة المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT لتسمية مستقبلات الأولية التي تحمل اسم الأجسام المضادة (أي، مستقبلات أعرب عن سطح التي لم يتم استيعابها).
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام أليكسا 555-المترافقالماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب المضادة (1:500) لوضع العلامات.
    6. غسل الخلايا 3X مع PBS.
  3. وضع العلامات على المستقبلات الداخلية
    1. الخلايا التبرّهة مع 0.25% تريتون X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق.
    2. منع ملزمة غير محددة عن طريق الحضانة مع 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. عينات الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي الموسومة الفلورسنت المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT لتسمية مستقبلات تحمل اسم الأجسام المضادة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتم استخدام أليكسا 647-المترافقالماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب الثانوية (1:500) لوضع العلامات.
    4. غسل الخلايا 3X مع PBS.

5. إعادة التدوير (الشكل 4)

  1. استيعاب مستقبلات السطح التي تحمل اسم الأجسام المضادة
    1. بعد وضع العلامات على المستقبلات التي يعبر عنها السطح وغسل الأجسام المضادة (القسم 2.2)، والحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام مكيفة دون الأجسام المضادة وإعادتها إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح للاستيعاب.
      ملاحظة: لمستقبلات NMDA، ينصح 30 دقيقة للتدخيل.
  2. حجب مستقبلات سطح مستقر أعرب
    1. لمنع epitopes على الأجسام المضادة الأولية المرفقة بمستقبلات سطح أعرب التي لم يتم استيعابها، وحضانة الخلايا مع غير المنقطعة فاب المضادة للIgG (H + L) شظايا الأجسام المضادة (H + L) المخففة في وسائل الإعلام مكيفة ( 20 ميكروغرام/مل) لمدة 20 دقيقة في RT. يمنع هذا العلاج التفاعل في المستقبل مع الأجسام المضادة الثانوية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام شظايا الماعز المضادة للأرانب فاب.
      ملاحظة: تجربة التحكم: لضمان حدوث حظر كامل للمستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح، يمكن احتضان الأغطية الشقيقة مع فاب وبدونها. يجب إصلاح الثقافات مباشرة بعد العلاج فاب، ويتم احتضان كلتا الثقافتين مع اليكسا 555-المترافق الأجسام المضادة الثانوية. لا إشارة اليكسا 555 في الخلايا الحاضنة فاب يشير إلى حجب الأجسام المضادة السليم.
    2. غسل الخلايا 3X مع وسائل الإعلام مكيفة.
    3. حضانة الخلايا مع وسائل الإعلام مكيفة تحتوي على 80 درجة مئوية dynasore لمنع المزيد من التدخيل وإعادة الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية) للسماح لإعادة تدوير المستقبلات الداخلية. Dynasore هو مثبط GTPase الذي يمنع الدينامين وبالتالي يمنع التدخيل.
      ملاحظة: يوصى بـ 45 دقيقة لإعادة تدوير NMDAR. لاحظ أن Dynasore يمنع بشكل خاص عملية الاستيعاب المعتمد على dynamin (على سبيل المثال، الاستيعاب NMDARs). ومع ذلك، يمكن أن يحدث استيعاب البروتين متشابك أخرى (دينامين مستقلة) لا يزال في وجود ديناسور.
  3. وضع العلامات على المستقبلات المعاد تدويرها
    1. غسل الخلايا مرة واحدة مع PBS +.
    2. إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA والسكروز 4٪ في PBS لمدة 7-8 دقائق.
      تحذير: استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء محرك السيارة السلامة عند التعامل مع PFA.
    3. غسل الخلايا 3X مع PBS.
    4. كتلة مع NGS 10٪ في PBS لمدة 30 دقيقة في RT لمنع الربط غير محدد.
    5. خلايا التسمية مع أول الجسم المضاد الثانوي الفلورسنت الموسومة المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام أليكسا 555-المترافقالماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب (1:500) لوضع العلامات.
    6. غسل الخلايا 3X مع PBS.
      ملاحظة: قد تساعد عمليات النُشَم الأطول مع PBS (5-10 دقائق) في تقليل الخلفية في الإعداد.
  4. وضع العلامات على المستقبلات الداخلية
    1. الخلايا التبرّهة مع 0.25% تريتون X-100 في PBS لمدة 5-10 دقائق.
    2. كتلة مع 10٪ NGS في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. تسمية مع ثاني الفلورسنت الموسومة الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 3٪ NGS في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام أليكسا 647-المترافقة الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة للأرنب (1:500) لوضع العلامات.
    4. غسل الخلايا 3X مع PBS.

6. تركيب وتصوير العينات

  1. قم بتركيب الخلايا عن طريق وضع جانب الخلية في الأغطية برفق على 12-15 مل من الوسائط التركيبية المناسبة.
    ملاحظة: وسيؤدي التطلع إلى زيادة الوسائط المتصاعدة إلى تحسين نوعية الصور.
  2. خلايا الصورة على المجهر البؤري المناسب.
    ملاحظة: فمن المستحسن أن صورة z-كومة في التكبير 60X مع خطوات 0.35 درجة مئوية, تشمل سمك كامل من الخلايا العصبية.

7. اعتبارات الوقت

  1. هذا بروتوكول طويل يمكن إيقافه في عدة نقاط. إذا رغبت في ذلك، قم بإجراء خطوات حظر وحضانة الأجسام المضادة الأساسية بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
  2. بدلا من ذلك، إذا رغبت في ذلك، استخدم معالج الأنسجة الميكروويف لتسريع إلى حد كبير بعد التثبيت أوقات الحضانة. لجميع الخطوات، استخدم 150 وات عند 30 درجة مئوية لإعدادات "التشغيل".
    1. لمنع، تشغيل المعالج في 2 دقيقة "على"، 1 دقيقة "إيقاف"، و 2 دقيقة "على".
    2. بالنسبة لخطوات حضانة الأجسام المضادة الأساسية والثانوية، قم بتشغيل المعالج في 3 دقائق "تشغيل"، ودقيقتين "إيقاف التشغيل"، و3 دقائق "تشغيل".
      ملاحظة: ونحن لا نلاحظ أي فرق في الجودة عن طريق إجراء التعديلات المذكورة أعلاه على البروتوكول.

8. تحليل الصور

  1. من المستحسن استخدام FIJI لإجراء تحليل الصورة، لأنه متوافق مع تنسيقات ملفات متعددة. بالنسبة لبياناتنا، تم الحصول على صور بتنسيق ملف نيكون ND2.
  2. يتم توفير برنامج نصي ماكرو لتحديد كمية دفعية سهلة من معلمات مختلفة تم اختيارها مسبقًا من قبل FIJI. يتم تضمين الخطوات التالية في الماكرو:
    ملاحظة: وبالنسبة لهذه الأمثلة، تم قياس "الكثافة المتكاملة".
  3. افتح ملفات الصور في FIJI وقنوات منفصلة.
  4. Z-project كل كومة قناة كإسقاط كثافة قصوى.
  5. تعيين عتبة أقل لكل قناة.
    ملاحظة: وينبغي تحديد العتبات تجريبيالكل مجموعة بيانات تجريبية. في حين يمكن أن يكون لكل قناة قيمة عتبة أقل منفصلة، فمن المهم أن يتم الاحتفاظ قيم عتبة القناة باستمرار لجميع الصور من نفس مجموعة البيانات.
  6. اختر ثلاثة إلى خمسة من الديندرات الثانوية أو الثالثة ووفرها كمناطق ذات أهمية.
  7. قياس الكثافة المتكاملة لكل عائد استثمار في القنوات السطحية وداخل الخلايا.
  8. قم بتطبيع الإشارة لكل عائد استثمار عن طريق تقسيم قيمة الكثافة المتكاملة للقناة السطحية على القناة داخل الخلايا.
  9. كرر قياسات جميع الصور التجريبية والتحكم وتطبيع القيم التجريبية للتحكم في القيم (على سبيل المثال، GluN2B WT أو شروط عدم الجلايسين).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويستند هذا البروتوكول لدراسة الاتجار مستقبلات الغلوتامات على وضع العلامات التفاضلية للمستقبلات المعبر عنها في سطح الخلية وتلك التي أعرب عنها في الأغشية الداخلية. ويتحقق الفصل عن طريق وضع العلامات على المستقبلات قبل وبعد نفاذية الغشاء، وذلك باستخدام نفس الجسم المضاد الأولي ولكن جسم مضاد ثانوي مترافق مع فلوروفور مختلفة. وكما هو مبين في الخطوات الاختيارية التي تضمنت البروتوكول، فإن هذه طريقة متعددة الاستخدامات للغاية لاستجواب مختلف عمليات الاتجار بالمستقبلات، مثل الاستيعاب الداخلي وإعادة التدوير، ويمكن تكييفها بسهولة مع احتياجات المحقق (الشكل 1) .

أولا، يتم توفير طريقة للقياس الكمي للمستقبلات المعبر عنها في سطح الخلايا العصبية. يسمح هذا البروتوكول بالقياس الكمي للتعبير السطحي القاعدي وكذلك دراسة الآليات الجزيئية التي تغير بها الأدوية أو الطفرات المختلفة المستويات القاعدية للمستقبلات التي يعبر عنها السطح. تم تسمية المستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح لأول مرة عن طريق الحضانة مع كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية قبل نفاذية. بعد نفاذية مع 0.25٪ تريتون X-100، يمكن الوصول إلى تجمع بين الخلايا من المستقبلات لوضع العلامات على الأجسام المضادة. لتوضيح هذا البروتوكول، تم إجراء تلطيخ السطح مقابل الخلايا لمستقبلات AMPA (AMPARs) في ثقافات التحكم وبعد الحث على cLTP. على وجه التحديد، تم تسمية الخلايا الحية باستخدام جسم مضاد ضد epitope خارج الخلية في وحدة GluA1 الفرعية من AMPAR، وتم إصلاح الخلايا ثم وصفت مع اليكسا 555-مترافق الثانوية. ثم تم نفاذ الخلايا ووصفت مع نفس الأجسام المضادة للAMPAR واحتضنت مع جسم مضاد ثانوي مترافق مع اليكسا 647. تسمح هذه العلامات المزدوجة بتصور واضح لـ اثنين من سكان GluA1.

بعد الحصول على الصور البؤرية، يمكن بسهولة تحديد كمية إشارة الفلورسنت لإظهار زيادة في التعبير السطحي، بالنسبة إلى السكان داخل الخلايا، بعد cLTP (الشكل2A،B). كعنصر تحكم، تم تخطي خطوة نفاذية (الحضانة مع 0.25٪ تريتون X-100) في غطاء شقيقة واستخدمت الأجسام المضادة الأولية ضد PSD-95، علامة داخل الخلايا القياسية لنقاط الاشتباك العصبي المحفزة. كما هو مبين في الشكل 2C، لا يمكن الحصول على إشارة لPSD-95 في الخلايا غير نفاذية ، مما يدل على سلامة غشاء البلازما. وهذا يشير إلى أن الإشارة التي تم الحصول عليها لـ "GluA1 السطحية" تتوافق في الواقع مع المستقبلات التي يعبر عنها السطح (أي أن إشارة GluA1 التي يعبر عنها السطح لا تشمل مستقبلات داخل الخلايا). الأهم من ذلك، يمكن ملاحظة إشارة الحد الأدنى لـ "GluA1 المنضم" في ظروف عدم نفاذية، مما يدل على أن جميع epitopes السطحية تشغلها الجولة الأولى من وضع العلامات على الأجسام المضادة (أي، لا يتم تضمين إشارة لGluA1 داخل الخلايا مستقبلات سطحية التعبير عنها).

والعملية الثانية التي يمكن دراستها باستخدام هذا البروتوكول هي استيعاب المستقبلات التي يعبر عنها السطح. على وجه التحديد، يتم تسمية مستقبلات السطح على خلية حية، ويتم إرجاع الخلايا العصبية إلى الحاضنة لفترة معينة للخضوع لاستيعاب مستقبلات عن طريق بطانة الرحم بوساطة clathrin. بعد هذه الخطوة، يتم إصلاح الخلايا للحفاظ على التعبير المكاني للمستقبلات الأولية التي تحمل اسم الأجسام المضادة (أي المستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح والاستيعاب). ثم، يتم تسمية المستقبلات السطحية (أي تلك التي لم يتم استيعابها في الفترة الزمنية من الفائدة)، مع الأجسام المضادة الثانوية قبل نفاذية. بعد نفاذية, يتم تسمية المستقبلات التي تم استيعابها من قبل الأجسام المضادة الثانوية مع فلوروفور مختلفة.

وفي هذا البروتوكول، تم بحث الكيفية التي يؤدي بها الفسفورية الخاصة داخل الرباط PDZ للوحدة الفرعية GluN2B من NMDARs (في S1480) إلى الاستيعاب الداخلي لـ NMDAR. وللقيام بذلك، تم نقل الثقافات الأولية مع مستقبلات فوسفو-mimetic، التي تم استبدال سيرين (S1480) بالغلوتامات (E). والمتحولة الناتجة، GluN2B S1480E، بمثابة شكل "تأسيسي-فوسفوري" من GluN2B. لتسهيل وضع العلامات على GluN2B وتحديد متحولة phospho-mimetic، تم استخدام GFP كعلامة epitope على الجانب خارج الخلية من GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). تم تسمية مستقبلات السطح على الخلايا الحية مع الأجسام المضادة للGFP لمدة 15 دقيقة في RT. بعد ذلك، تم غسل الأجسام المضادة الزائدة مع وسائل الإعلام مكيفة وعاد الخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح لبطانة الرحم. ثم، تم إصلاح الخلايا لتجميد حركة مستقبلات. ثم وصفت المستقبلات التي بقيت على السطح مع اليكسا 555-المترافق الأجسام المضادة الثانوية قبل نفاذية.

لتحديد المستقبلات التي تم استيعابها خلال فترة الحضانة 30 دقيقة، تم نفاذية الخلايا، والمستقبلات الداخلية (وصفت بالفعل مع الأجسام المضادة الأولية) ثم وصفت مع اليكسا 647-المترافق الأجسام المضادة. مرة أخرى، تسمح هذه الاستراتيجية ذات العلامات المزدوجة بالقياس الكمي لنسبة المستقبلات الداخلية. يسلط هذا المثال الضوء على أن الفسفور GluN2B في S1480 يعزز استيعاب مستقبلات، كما عرض متحولة فوسفو mimetic S1480E نسبة استيعاب أعلى بكثير مقارنة مع مستقبلات WT (الشكل3A،B). كتحكم، تم الحفاظ على ثقافة شقيقة في 4 درجة مئوية في وسائل الإعلام مشروطة أثناء الاستيعاب لإبطاء العملية بقوة. كما هو متوقع، لم يتم الحصول على أي إشارة لمستقبلات "استيعاب" في ظل هذه الظروف (الشكل3C).

وأخيراً، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة إعادة تدوير المستقبلات التي كانت داخلية في السابق. هذا الاختلاف البروتوكول هو استمرار لبروتوكول الاستيعاب الداخلي، باتباع هذه المستقبلات مرة أخرى إلى سطح الخلية. وهناك عنصران حاسمان لهذا الاختلاف. أولاً، يجب "حظر" المستقبلات التي ظلت معبراً عنها بشكل ثابتاً على السطح خلال البروتوكول بأكمله (أي المستقبلات التي لم يتم استيعابها أو إعادة تدويرها) بحيث لا تكون خاطئة بالنسبة للمستقبلات المعاد تدويرها. للقيام بذلك، قبل أداء خطوة إعادة التدوير، يتم احتضان الخلايا العصبية الحية مع تركيزات عالية من Fab التي تتفاعل مع مستقبلات الأولية التي تحمل اسم الأجسام المضادة والمعبر عنها على السطح لمنع المزيد من الربط من الثانوية الفلورية المترافقة جسم. ثانياً، ينبغي منع الاستيعاب الداخلي أثناء مرحلة إعادة التدوير، بحيث لا تتكرر المستقبلات المعاد تدويرها داخلياً. وقد تم ذلك عن طريق إضافة dynasore إلى وسائل الإعلام أثناء إعادة التدوير كما أن هذا الدواء كتل العمليات التي تعتمد على dynamin مثل بطانة الرحم بوساطة clathrin، مثل التدخيل NMDAR. في هذا البروتوكول، تم إجراء دراسة الاتجار بالمتحولين الفسفو-mimetic GluN2B S1480E وكذلك وضع العلامات السطحية لGFP-GluN2B على الخلايا الحية، مما سمح بالاستيعاب خلال فترة 30 دقيقة كما هو موضح من قبل.

بعد ذلك، تم حظر مستقبلات السطح التي لم يتم استيعابها خلال هذه الفترة عن طريق احتضان الخلايا مع فاب لمدة 20 دقيقة في RT. بعد ذلك، تم احتضان الخلايا مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة للسماح لإعادة تدوير GluN2B التي تم استيعابها من قبل إلى سطح الخلية. وكان ديناسور حاضرا في وسائل الإعلام خلال خطوة إعادة التدوير. تثبيت الخلايا التالية لهذه الخطوة يسمح لتحديد المستقبلات المعاد تدويرها (أي تلك التي يتم إلغاء حظرها وعبّر عنها على سطح الخلية) والمستقبلات الداخلية (أي تلك التي هي الأجسام المضادة الأولية المسمى وداخل الخلايا). من قبل 1) وضع العلامات على المستقبلات المعاد تدويرها مع الأجسام المضادة الثانوية اليكسا 555-المترافقة قبل نفاذية و 2) وضع العلامات داخليا، ولكن لا يعاد تدويرها، والمستقبلات مع اليكسا 647-مترافق الأجسام المضادة الثانوية، تم إنشاء نسبة إعادة التدوير لإظهار أن GluN2B S1480E ليس له أي تأثير على إعادة تدوير NMDAR (الشكل4A،B). كتحكم، تم التأكد من أن حجب كامل من المستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح وقعت عن طريق احتضان الأغطية الشقيقة في وجود أو غياب فاب، تليها تثبيت PFA. كما هو مبين في الشكل 4C، يمكن ملاحظة إشارة قوية لGluN2B التي يتم التعبير عنها على السطح في غياب حظر القوات المسلحة البوروندية. تختفي هذه الإشارة في الثقافات المعالجة فاب، مما يدل على أن بروتوكول حظر يكفي لمنع تماما من epitopes السطح أعرب وأن الإشارات السطحية التي لوحظت بعد إعادة التدوير تتوافق في الواقع مع مستقبلات الاتجار بها مرة أخرى إلى غشاء البلازما.

Figure 1
الشكل 1: مخطط الاختلافات البروتوكول لدراسة التعبير السطحي مستقبلات، واستيعاب مستقبلات (بطانة الرحم)، وإعادة تدوير المستقبلات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: cLTP يزيد التعبير السطحي من GluA1. تعرضت الخلايا العصبية الحصية الأولية في DIV21 إلى LTP الكيميائية (cLTP) عن طريق الحضانة مع ECS التي تحتوي على الجلايسين. إن وضع العلامات المميزة لتجمعات GluA1 التي يتم التعبير عنها على السطح (الأحمر) مقابل السكان داخل الخلايا (الأزرق) يكشف عن الزيادة المتوقعة في التعبير السطحي عن AMPAR. (أ) طائرة واحدة و(ب) Z مكدسة (الحد الأقصى من كثافة الإسقاط) صور confocal. قضبان مقياس = 50 ميكرومتر (خلية كاملة) أو 5 ميكرومتر (dendrite). يظهر الرسم البياني زيادة التعبير السطحي من GluA1 بعد بروتوكول cLTP. مؤشر التعبير السطحي: مستقبلات السطح/داخل الخلايا (n = 3؛ عدد الخلايا: con = 7؛ cLTP = 7؛ القيم تمثل المتوسط ± SEM؛ ****p < 0.0001 باستخدام اختبار Mann-Whitney U). (ج) تجربة التحكم التي تم فيها تخطي خطوة النفاذية. بالإضافة إلى السطح والداخلية GluA1، تم تقييم علامة متشابك ة داخل الخلايا PSD-95. قضبان مقياس = 50 ميكرومتر (خلية كاملة) أو 5 ميكرومتر (dendrite). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الفسفور من GluN2B في S1480 يعزز الاستيعاب NMDAR. تم نقل الخلايا العصبية فرس النهر الأولية إما GFP-GluN2B WT أو متحولة فوسفو mimetic GFP-GluN2B S1480E على DIV11-12. بعد 3-4 أيام من التعبير البروتيني، تم تسمية GFP السطح على الخلايا الحية مع الأجسام المضادة للأرنب GFP ثم أعيد الخلايا إلى 37 درجة مئوية للسماح لاستيعاب مستقبلات عن طريق بطانة الرحم. تم تصور المستقبلات الخارجية التي يتم التعبير عنها على السطح مع الأجسام المضادة الثانوية 2000 200 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 للوضوح، سطح GFP-GluN2B هو الزائفة الملونة في الأخضر واستيعابGF-GluN2B هو الزائفة الملونة باللون الأبيض. (أ) طائرة واحدة و(ب) Z مكدسة (الحد الأقصى من كثافة الإسقاط) صور confocal. قضبان مقياس = 50 ميكرومتر (خلية كاملة) أو 5 ميكرومتر (dendrite). الرسم البياني يظهر الاستيعاب المرتفعة التي تظهرها متحولة فوسفو mimetic GluN2B S1480E. مؤشر الاستيعاب الداخلي: المستقبلات الداخلية/المستقبلات التي يعبر عنها السطح (n = 6؛ عدد الخلايا: WT = 34; S1480E = 28; القيم تمثل يعني ± SEM؛ p < 0.001 باستخدام اختبار مان ويتني يو). (C) تجربة التحكم التي أجريت فيها خطوة الاستيعاب الداخلي (Intenaliz.) عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. قضبان مقياس = 50 ميكرومتر (خلية كاملة) أو 5 ميكرومتر (dendrite). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: لا يغير الفسفورية من GluN2B في S1480 إعادة تدوير NMDAR. تم نقل الخلايا العصبية فرس النهر الأولية إما GFP-GluN2B WT أو متحولة فوسفو mimetic GFP-GluN2B S1480E على DIV11-12 كما هو مبين في الشكل 3. بعد 3-4 أيام من التعبير البروتيني، تم تسمية GFP السطح على الخلايا الحية مع الأجسام المضادة للأرنب GFP ثم أعيد الخلايا إلى 37 درجة مئوية للسماح لاستيعاب مستقبلات عن طريق بطانة الرحم. تم حظر المستقبلات المتبقية التي يتم التعبير عنها على السطح من قبل حضانة القوات المسلحة البوروندية وسمح بإعادة التدوير لمدة 45 دقيقة. السكان الذين تم تحديدهم بعد النفاذ باستخدام الأجسام المضادة 2000 2000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 0 للوضوح، سطح GFP-GluN2B هو الزائفة الملونة باللون الأبيض واستيعاب GFP-GluN2B هو الزائفة الملونة باللون الأخضر.  (A) طائرة واحدة و (B) Z-مكدسة (الحد الأقصى من كثافة الإسقاط) صور confocal. قضبان مقياس = 50 ميكرومتر (خلية كاملة) أو 5 ميكرومتر (dendrite). يبين الرسم البياني عدم تأثير الفسفور GluN2B S1480 على إعادة التدوير. مؤشر إعادة التدوير: المستقبلات المعاد تدويرها/المستقبلات الداخلية (n = 5؛ عدد الخلايا: WT = 27; S1480E = 24; القيم تمثل يعني ± SEM؛ n.s. = غير مهم باستخدام اختبار مان ويتني يو). (C) تجربة التحكم التي تم تخطي خطوة حضانة القوات المسلحة البوروندية لمنع epitopes التي يتم التعبير عنها على السطح. قضبان مقياس = 50 ميكرومتر (خلية كاملة) أو 5 ميكرومتر (dendrite). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التفاعل بين الخلية وبيئتها (على سبيل المثال، التواصل مع الخلايا الأخرى، والاستجابة لمحفزات مختلفة، وما إلى ذلك)، يعتمد بشكل كبير على التعبير الصحيح للمستقبلات على سطح الخلية. التنظيم السريع والدقيق في محتوى المستقبلات التي يتم التعبير عنها على السطح يتيح الاستجابة الخلوية المناسبة لبيئة متغيرة باستمرار. في حالة معينة من الخلايا العصبية، والتعديلات في عدد، والتوطين، وتكوين الوحدة الفرعية من مستقبلات أعرب synaptically يؤثر بشكل كبير الاتصالات متشابك، اللدونة متشابك، متشابك التكوين، وتقليم متشابك3، 5،10. ولذلك، فإن التحليل الدقيق للتعبير السطحي لمستقبلات والآلية التي يقوم عليها تنظيمه هو موضوع مهم من مواضيع البحث.

وهناك عدد من الطرائق التي يمكن من خلالها دراسة التعبير السطحي لمستقبلات. وبصفة عامة، تندرج هذه الفئات ضمن ثلاث فئات رئيسية هي: '1' العزل البيوكيميائي لسكان المستقبلات المعبر عنها على السطح، '2' تقنيات التصوير لتصور المستقبلات على السطح، '3' التقنيات الوظيفية لرصد عواقب المستقبلات التنشيط. هذه النهج هي متكاملة ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب للإجابة على أسئلة محددة حول التعبير السطحي للمستقبلات.

وتشمل الأمثلة على العزلة البيوكيميائية للمستقبلات السطحية المعبر عنها بروتوكولات biotinylation في الخلايا المستزرعة أو شرائح الدماغ وتجزئة الخلايا دون الخلوية من الخلايا المستزرعة أو الأنسجة11. ويستند biotinylation السطح على وضع العلامات من المستقبلات التي يعبر عنها السطح مع البيوتين عن طريق احتضان الثقافات مع البيوتين تنشيط إستر. مجموعة استر يتفاعل مع المجموعات الأمينية الأولية (-NH2) لتشكيل السندات أميد مستقرة. لأن هذا الكاشف هو خلية لا يمكن نفاذها، يتم تسمية البروتينات التي يتم التعبير عنها سطح فقط مع البيوتين. بعد تحلل الخلوية باستخدام المنظفات، يمكن استرداد مستقبلات المسمى عن طريق احتضان الخلية lysate مع حبات أغاروز مترافقة مع avidin أو المتغيرات التي لديها تقارب قوي لالبيوتين، ثم تقييمها عن طريق المناعية. الكسر تحت الخلوي هو بروتوكول كيميائي حيوي يستخدم عدة خطوات الطرد المركزي لعزل مختلف المقصورات الصغيرة الصغيرة استنادا ً إلى كثافاتها المختلفة12. كلا الأسلوبين مفيدين لتحديد التغيرات في التعبير السطحي للبروتينات الذاتية ويمكن استخدامها بالاقتران مع النهج الدوائية (في الجسم الحي وفي الثقافة على حد سواء) لتحديد كيفية تأثير التلاعب الجزيئي على التعبير السطحي من المستقبلات. وهي مفيدة بشكل خاص لأن التغيرات في مستقبلات محلية متعددة، بالنسبة إلى معيار، يمكن قياسها كميا في وقت واحد. ومع ذلك، وخلافا لطرائق التصوير، مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول، يتم فقدان الاستبانة المكانية من خلال المعالجة البيوكيميائية للعينات.

البروتوكول الموضح هنا ينتمي إلى فئة تقنيات التصوير. هذه المجموعة من النهج (مثل وضع العلامات السطحية والتصوير بالخلايا الحية من البروتينات ذات العلامات الفلورية الزائدة) مفيدة لإعطاء الدقة الصدغية للتعبير السطحي عن المستقبلات. على سبيل المثال، من خلال فحص التعبير السطحي مقابل داخل الخلايا من AMPAR، كما هو موضح سابقا، يمكن للمرء أن يدرس كيف يتم نطق التغييرات في التعبير في dendrites (المقصورة البيولوجية ذات الأهمية لهذا التطبيق معين). مثل الكسر البيوكيميائي، يمكن استخدام الأدوية مع تقنيات التصوير لتحديد آثار الدواء على التعبير السطحي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نقل الخلايا العصبية مع مستقبلات تحتوي على تعديلات (طفرات أو علامات) يزيد من تعقيد الاحتمالات للتصوير. يمكن أن يحدد الانسياق مع مستقبلات متحولة آثار طفرة معينة على التعبير السطحي.

نهج مفيد آخر لتصور الاتجار بالمستقبلات هو التصوير المجهري بالصور الحية بعد التغوط من الثقافات الأولية مع المنشآت ذات العلامات الفلورية، مثل pHluorin Superecliptic (SEP)- أو غيرها من المنشآت ذات العلامات الفلورية13. مستقبلات SEP الموسومة يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لدراسة مستقبلات السطح أعرب, كما أن هذا الفلوروفور سوف الفلورة فقط عندما تتعرض للوسط خارج الخلية. مثل الأمثلة السابقة، يمكن استخدام النهج الدوائية، أو الطفرات التي أجريت على المستقبلات، لتحديد ما إذا كانت هذه تغير خصائص التعبير السطحي للمستقبلات. في حالة المخدرات، يمكن استخدام التصوير بالخلايا الحية لمراقبة التعديلات في التعبير السطحي في الوقت الحقيقي. الحد من التصوير الحي هو عدم وجود رؤية ميكانيكية في التغيرات في التعبير السطحي. على سبيل المثال، قد يكون انخفاض التعبير السطحي نتيجة إما زيادة استيعاب مستقبلات، وانخفاض إعادة تدوير مستقبلات، أو كليهما.

للإجابة على هذا السؤال، يمكن استخدام البروتوكول الموضح أعلاه. ومن الأحداث الهامة الأخرى للاتجار التي يمكن رصدها باستخدام نُهج التصوير الحي الانتشار الجانبي للمستقبلات بين المقصورات المختلفة في غشاء البلازما (على سبيل المثال، بين المواقع المتشابكة والمواقع الخارجية). في هذه الحالة، فإن تقنية الاختيار هي استخدام نُهُج تتبع الجسيمات الواحدة التي يتم فيها إرفاق البلورة النانوية لأشباه الموصلات الفلورية [أي نقطة الكم (QD)] بجسم مضاد ضد epitope خارج الخلية على البروتين ذي الأهمية. تتميز QDs باستقرار ملحوظ (مما يسمح بتبييض الصور أقل بكثير من البروتينات الفلورية التقليدية)، والسطوع القوي، والتناوب بين حالة تشغيل / إيقاف ("وامض"). باستخدام إعدادات المجهر المناسبة ، فمن الممكن تتبع حركة QD واحد (وبالتالي ، بروتين واحد من الفائدة) من خلال غشاء البلازما الخلوية14.

ويوفر البروتوكول الحالي فحصاً للمستقبلات في السكان السطحيين، والسكان الداخليين، والسكان المعاد تدويرهم، مما يسمح بحساب النسب لتحديد كيفية تحكم هذه العمليات في التعبير السطحي الكلي. وعلاوة على ذلك، فإن وقف عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير في نقاط زمنية مختلفة يضيف دقة زمنية. هذا الأسلوب، لذلك، يسمح لدراسات التعبير السطحي spatiotime. على عكس تقنيات التصوير الأخرى، يمكن أيضًا دراسة مستويات التعبير السطحي المحلي (على سبيل المثال، AMPAR)، شريطة وجود جسم مضاد ضد الجزء خارج الخلية من المستقبلات. ومع ذلك، لأن هذا الأسلوب يتطلب تثبيت الخلايا، فإنه غير متوافق مع التصوير بالخلايا الحية وبالتالي لا يمكن توفير معلومات في الوقت الحقيقي.

وأخيرا، النهج الوظيفية مثل الفيزيولوجيا الكهربائية15 أو تصوير الكالسيوم16 قوية، وإن كانت غير مباشرة في كثير من الأحيان، والآداب لدراسة التعبير السطحي للمستقبلات. وتستند هذه الأساليب على التحديد الكمي للتغيرات الوظيفية في الخلية بعد تنشيط المستقبلات (على سبيل المثال، التغير في إمكانات الغشاء أو تركيز الكالسيوم). باستخدام الصيدلة لعزل استجابة مستقبلات معينة، وهذه الطرق تسمح لتقدير المستقبلات المعبر عنها على سطح الخلية بطريقة دقيقة، spatiotemporal. هذه الأساليب هي تنوعا وتسمح لدراسة الخلايا في الثقافة وفي ظروف أكثر فسيولوجية السابقين فيالجسم الحي (على سبيل المثال، شرائح الدماغ الحاد) وفي الجسم الحي. ومع ذلك، كما هو الحال في نهج التصوير الحي، غالباً ما يتم تفويت المعلومات الميكانيكية عند استخدام النهج الوظيفية.

وباختصار، يمكن استخدام مجموعة من التقنيات لدراسة التعبير السطحي مستقبلات لفهم كامل كيف يتم التحكم في التعبير السطحي. البروتوكول المعروض هنا قوي بشكل خاص لأنه يوفر فهم ًا آليًا للتعبير السطحي الصدغي للمستقبلات في الثقافات الأولية المنفصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر مركز نورث ويسترن للتنظير المجهري المتقدم على استخدام مجهر نيكون A1 البؤري ومساعدتهم في تخطيط وتحليل التجارب. وقد تم دعم هذا البحث من قبل NIGMS (T32GM008061) (A. M.), وNIA (R00AG041225) ومنحة الباحث الشباب NARSAD من مؤسسة بحوث الدماغ والسلوك (#24133) (A. S. -C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Tags

علم الأعصاب العدد 150 مستقبلات الغلوتامات التعبير السطحي استيعاب مستقبلات إعادة تدوير مستقبلات تغذية الأجسام المضادة التغوط الخلايا العصبية
نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova,… More

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter