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Neuroscience

Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

Published: August 2, 2019 doi: 10.3791/59982
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

Summary

Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.

Abstract

Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de receptores expresados en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, la población de receptores expresados en superficie se está adaptando constantemente y sujeta a estrictos mecanismos de regulación. El ejemplo paradigmático y uno de los eventos de tráfico más estudiados en biología es el control regulado de la expresión sináptica de los receptores de glutamato (GluR). Los GluR median la gran mayoría de la neurotransmisión excitatoria en el sistema nervioso central y controlan los cambios funcionales y estructurales dependientes de la actividad fisiológica a los niveles sináptico y neuronal (por ejemplo, plasticidad sináptica). Las modificaciones en el número, la ubicación y la composición de la subunidad de los GluR expresados en superficie afectan profundamente la función neuronal y, de hecho, las alteraciones en estos factores se asocian con diferentes neuropatías. Presentado aquí es un método para estudiar el tráfico de GluR en las neuronas primarias del hipocampo disociadas. Se utiliza un enfoque de "alimentación de anticuerpos" para visualizar diferencialmente las poblaciones de GluR expresadas en la superficie y las membranas internas. Mediante el etiquetado de receptores de superficie en células vivas y la fijación en diferentes momentos para permitir la endotosis de receptores y / o reciclaje, estos procesos de tráfico pueden ser evaluados y estudiados selectivamente. Este es un protocolo versátil que se puede utilizar en combinación con enfoques farmacológicos o sobreexpresión de receptores alterados para obtener información valiosa sobre los estímulos y mecanismos moleculares que afectan el tráfico de GluR. Del mismo modo, se puede adaptar fácilmente para estudiar otros receptores o proteínas expresadas en la superficie.

Introduction

Las células utilizan el proceso activo de tráfico para movilizar proteínas a localizaciones subcelulares específicas y ejercer una estricta regulación espaciotemporal sobre su función1. Este proceso es especialmente importante para los receptores transmembrana, ya que las respuestas celulares a diferentes estímulos ambientales dependen de cascadas intracelulares desencadenadas por la activación del receptor. Las células son capaces de modificar estas respuestas alterando la densidad, localización y composición de subunidades de los receptores expresada en la superficie celular a través de la regulación del tráfico subcelular de receptores2. La inserción de receptores recién sintetizados en la membrana plasmática, junto con la endocitosis y el reciclaje delos receptores existentes son ejemplos de procesos de tráfico que determinan el conjunto neto de receptores expresados en superficie 2. Muchos mecanismos moleculares cooperan para regular el tráfico de proteínas, incluidas las interacciones proteína-proteína y las modificaciones posttranslacionales, como la fosforilación, la ubiquitinación o la palmitoylación2.

La regulación del tráfico de receptores es particularmente necesaria en células fuertemente polarizadas con estructuras altamente especializadas. El ejemplo paradigmático es el control de la función neuronal mediante el tráfico regulado de receptores de glutamato (GluRs)3,4. El glutamato, el principal neurotransmisor excitatorio, se une y activa los GluRs expresados por la superficie para controlar las funciones neuronales fisiológicas fundamentales como la neurotransmisión sináptica y la plasticidad sináptica. El hecho de que se haya observado el tráfico de GluR alterado en un amplio espectro de neuropatías, que van desde trastornos del neurodesarrollo hasta enfermedades neurodegenerativas, pone de relieve la importancia de este proceso5. Por lo tanto, entender los eventos moleculares que controlan el tráfico de GluR es de interés en muchas áreas de investigación.

En este protocolo, se utiliza un método basado en la alimentación de anticuerpos para cuantificar el nivel de GluRs expresados por la superficie en las neuronas primarias del hipocampo, así como evaluar cómo los cambios en la internalización y el reciclaje dan lugar a la expresión de superficie neta observada. El uso de farmacología y/o sobreexpresión de receptores exógenos que albergan mutaciones específicas hace de este protocolo un enfoque particularmente poderoso para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la adaptación neuronal a diferentes estímulos ambientales. Un ejemplo final de la utilidad de este protocolo es estudiar cómo los cambios multifactoriales en el medio ambiente (como en los modelos de una enfermedad) afectan el tráfico de GluR a través del examen de la expresión superficial en estos modelos.

Utilizando ejemplos específicos, inicialmente se demuestra cómo una manipulación farmacológica imitando la estimulación sináptica fisiológica [LTP químico (cLTP)] aumenta la expresión superficial de la subunidad Endógena GluA1 del tipo AMPA de GluRs (AMPARs) 6. El tráfico de una forma fosfomimética sobreexpresada de la subunidad GluN2B de GluRs de tipo NMDA (NMDAR) también se analiza para ejemplificar cómo este protocolo puede utilizarse para estudiar la regulación del tráfico de GluR por Modificaciones. Aunque se utilizan estos ejemplos específicos, este protocolo se puede aplicar fácilmente a otros GluRs y otros receptores y proteínas que poseen dominios extracelulares antigénicos. En el caso de que no haya anticuerpos disponibles para dominios extracelulares, la sobreexpresión de proteínas extracelulares etiquetadas con epítopos (por ejemplo, Flag-, Myc-, GFP-tagged, etc.) puede ayudar en el etiquetado de proteínas.

El protocolo actual proporciona instrucciones para cuantificar la densidad específica de subtipos GluR y el tráfico utilizando anticuerpos específicos. Este protocolo se puede utilizar para estudiar 1) expresión total de la superficie GluR, 2) internalización de GluR, y 3) reciclaje de GluR. Para estudiar cada proceso individualmente, se aconseja comenzar con las secciones 1 y 2 y continuar con las secciones 3, 4 o 5. En todos los casos, termine con las secciones 6 y 8 (Figura1).

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Protocol

El Trabajo relacionado con la preparación del cultivo primario hipocampal fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern (protocolo #IS00001151).

1. Preparación antes del etiquetado

  1. Preparación y mantenimiento de las culturas primarias del hipocampo
    1. Preparar cultivos primarios de hipocampo a una densidad de 150.000 células chapadas en gafas de cubierta recubiertas de poli-D-lisina (0,1 mg/ml) de 18 mm. Excelentes guías para la preparación disociada del cultivo neuronal están disponibles7,8.
      NOTA: Si es necesario, los cultivos pueden ser tratados con citosina arabinósido (Ara-C, 10 mM de DIV1) para evitar la proliferación glial en la preparación.
      NOTA: Se pueden utilizar reactivos de recubrimiento alternativos como la fibronectina (1 mg/ml) o laminina (5 mg/ml) en lugar de poli-D-lisina.
    2. Mantener los cultivos en una incubadora celular a 37oC y 5% CO2 en 2 mL/pozo de medios neurobasales complementados con B27 y 2 mM de L-glutamina.
      NOTA: Se pueden utilizar sustitutos de L-glutamina (por ejemplo, Glutamax), si se desea.
    3. Cada semana, eliminar la mitad del volumen de medios y reemplazar con el mismo volumen de medios neurobasales suplementados.
  2. OPCIONAL: Transfección de receptores mutados y/o etiquetados con epítopos
    NOTA:     Las neuronas deben ser transfectó al menos 3-4 días antes del punto de tiempo de análisis para permitir la expresión del receptor. El uso de neuronas jóvenes [Días in vitro 6–9 (DIV6–9)] da como resultado una mejor eficiencia de transfección que las neuronas más antiguas (DIV15–20), pero se puede lograr un número suficiente de células transinfectantes (>20) independientemente del DIV empleado.
    1. Para cada pozo de una placa de 12 pocillos, diluir 1,5 g de plásmido que contenga la construcción de interés en 100 ml de medios neurobasales frescos sin b27 o suplementos de glutamina en un tubo de microcentrífuga y mezclar por vórtice rápidamente.
      NOTA: Para una transfección exitosa, es fundamental que los medios neurobasales utilizados sean lo más frescos posible, idealmente menos de 1 semana después de la apertura del frasco.
    2. En un segundo tubo de microcentrífuga, mezcle 1 l de un reactivo de lipofección adecuado en 100 ml de medios neurobasales frescos y mezcle suavemente.
      NOTA: No vórtice la mezcla de reactivos de lipofección. El uso de reactivos de lipofección frescos puede mejorar la eficiencia de la transfección.
    3. Incubar los tubos durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Añadir la mezcla de reactivo de lipofección en forma abisal a la mezcla de ADN, mezclar suavemente e incubar durante 20 minutos a RT.
    5. Ajuste el volumen de medios en cada pocel a 1 ml de soporte acondicionado.
    6. Añadir el reactivo de lipofección -Mezcla de ADN gota en el pozo.
    7. Devolver las células a la incubadora y permitir al menos 3-4 días para la expresión de proteínas.
      NOTA: A los efectos de los protocolos de internalización y reciclaje descritos a continuación, las neuronas del hipocampo fueron transfectó en DIV11–12 con construcciones que expresaban GluN2B etiquetadas con GFP en el dominio extracelular (GFP-GluN2B) e imágenes en DIV15–16.
  3. OPCIONAL: Incubación de células con fármacos (crónica o agudamente) en los medios acondicionados hasta la fijación.
    NOTA:     Para el tratamiento agudo, comience a tratar las células antes de etiquetarlas. Dependiendo del protocolo de tratamiento de drogas utilizado, las células se pueden mantener en medios que contienen drogas durante la sección 2. En nuestro ejemplo, las células DIV21 estaban sujetas a un protocolo cLTP para aumentar AMPAR9expresado en superficie.
    1. Intercambio de medios condicionados para la solución extracelular (ECS).
    2. Tratar las células con glicina de 300 m en ECS durante 3 min a RT. Como control, trate a una cubierta hermana con ECS (sin glicina).
    3. Lavar las células 3 veces con ECS de 37 oC y devolver las células en ECS (sin glicina) a la incubadora de células durante 20 minutos antes de continuar con la sección 2.
      NOTA: ECS (en mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucosa, 0.001 TTX, 0.01 estricnina, y 0.03 picrotoxina a pH 7.4.

2. Etiquetado en vivo de receptores expresados en superficie

  1. Preparar los cubreobjetos para el etiquetado
    1. Para guardar los reactivos y facilitar la manipulación, transfiera el lado de la celda de coverslips hasta una bandeja cubierta de película de parafina.
      NOTA: Es fundamental que nunca deje que las muestras se sequen.
    2. Guardar y mantener los medios acondicionados a 37oC para los pasos de incubación y lavado.
      NOTA: Para un cubreobjetos de 18 mm, se recomienda la incubación con 75-100 ml de medios para el etiquetado de anticuerpos y 120–150 l para internalización/reciclaje.
  2. Etiquetado de receptores de superficie con anticuerpo primario
    1. Incubar células con anticuerpo primario diluido en medios acondicionados durante 15 min a RT.
      NOTA: Para los receptores etiquetados con GFP, se utilizó anticuerpo anti-GFP de conejo a una dilución de 1:1000. Para GluA1 endógeno, se utilizó un ratón anti-GluA1 a una dilución de 1:200.
    2. Aspirar cuidadosamente el medio que contiene anticuerpos utilizando una pipeta de vacío y lavar las células tres veces con medios acondicionados.
      NOTA: Si los medios acondicionados no están disponibles, todos los pasos de lavado se pueden realizar utilizando PBS+ [sal insa tamponada de fosfato (PBS) que contiene 1 mM MgCl2 y 0,1 mM CaCl2]. La aspiración manual con un micropipeta se puede realizar si no se dispone de una aspiración de vacío suave.

3. Expresión de superficie (Figura 2)

  1. Etiquetado secundario de anticuerpos de receptores expresados en superficie
    1. Lavar una vez con PBS+.
    2. Arreglar las células incubando con 4% de paraformaldehído (PFA) y 4% sacarosa en PBS durante 7-8 min.
      NOTA: A diferencia de otros métodos de fijación como la incubación de metanol, PFA no permeabiliza la membrana plasmática y, por lo tanto, es adecuado para el análisis de la expresión superficial. Para obtener resultados óptimos, utilice PFA recién preparado. El almacenamiento a corto plazo de PFA a 4 oC o a largo plazo (hasta 30 días) de almacenamiento a -20 oC es permisivo para una fijación adecuada.
      PRECAUCION: La PFA es un carcinógeno conocido. Utilice el equipo de protección personal adecuado y una capucha de seguridad cuando manipule.
    3. Lave las células tres veces con PBS regular.
      NOTA: Alternativamente, 0.1 M glicina se puede utilizar para lavar PFA en lugar de PBS, ya que la glicina apagará cualquier fijador restante que pueda aumentar el fondo en la preparación.
    4. Bloquear sitios de unión inespecíficos incubando con 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBS durante 30 min a RT.
      NOTA: El tiempo de bloqueo se puede extender sin efectos adversos en el etiquetado.
    5. Incubar con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente diluidos en 3% NGS en PBS durante 1 h a RT para etiquetar receptores primarios etiquetados con anticuerpos (es decir, expresados en la superficie).
      NOTA: En estos ejemplos, se utilizó una dilución 1:500 de anticuerpos secundarios conjugados por Alexa 555: anticonejo de cabra para receptores etiquetados por GFP y antiratón de cabra para GluA1.
    6. Lave las células con PBS 3x.
  2. Etiquetado de receptores intracelulares
    1. Permeabilizar celdas con 0.25% Triton X-100 en PBS durante 5-10 min en RT.
      NOTA: Para comprobar que la ronda inicial de etiquetado de anticuerpos ocupa todos los epítopos de superficie, este paso de permeabilización se puede omitir en una cultura hermana. En este caso, no se debe obtener ninguna señal para los receptores intracelulares. Además, para comprobar que no se han etiquetado receptores internos en la sección 2 anterior (es decir, que muestra la integridad de las membranas plasmáticas en el cultivo), el paso de permeabilización se puede omitir en un cultivo hermano, y un anticuerpo primario contra un proteína intracelular (por ejemplo, PSD-95 o MAP2) se puede utilizar en el paso 2.2.1. No se debe obtener ninguna señal de este primario en estas condiciones. En este caso, se utilizó un anticuerpo anti-PSD-95 de conejo (1:500).
    2. Bloque con 10% NGS en PBS durante 30 min en RT.
    3. Etiquetar los receptores intracelulares mediante la incubación de células permeabilizadas con el mismo anticuerpo primario utilizado en la sección 2.2 diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT.
      NOTA: La dilución de anticuerpos para el etiquetado de receptores intracelulares puede ser diferente de la necesaria para etiquetar receptores expresados por la superficie. En el ejemplo de GluA1, se utilizó la misma dilución de anticuerpos (1:200).
    4. Lave las células 3 veces con PBS.
    5. Etiqueta con el segundo anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT.
      NOTA: En estos ejemplos, se utilizó una dilución 1:500 de anticuerpo secundario conjugado por Alexa 647 de cabra (para GluA1).
    6. Lave las células 3 veces con PBS.

4. Internalización (Figura 3)

  1. Internalización de receptores superficiales etiquetados con anticuerpos
    1. Después del etiquetado de los receptores expresados en la superficie y el lavado de anticuerpos (sección 2.2), mantenga las células en medios acondicionados sin anticuerpos y devuélvalas a la incubadora (37 oC) para permitir la internalización.
      NOTA: Para los receptores NMDA, se recomienda n.o 30 min para la internalización. Como control, se puede mantener una cultura hermana con medios acondicionados a 4 oC durante el proceso de internalización. La internalización mínima del receptor debe ocurrir en estas condiciones.
  2. Etiquetado de receptores de superficie
    1. Lave las células una vez con PBS+.
    2. Fijar células con 4% PFA y 4% sacarosa en PBS durante 7-8 min.
      PRECAUCION: Utilice un equipo de protección personal adecuado y una campana de seguridad cuando manipule PFA.
    3. Lave las células 3 veces con PBS regular.
    4. Bloquee con 10% NGS en PBS durante 30 minutos en RT para evitar la unión inespecífica.
    5. Incubar muestras con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente diluidos en 3% NGS en PBS durante 1 h a RT para etiquetar receptores primarios etiquetados con anticuerpos (es decir, receptores expresados en superficie que no fueron internalizados).
      NOTA: En este ejemplo, se utilizó el anticuerpo secundario anticonejo de cabra conjugado Alexa 555 (1:500) para el etiquetado.
    6. Lave las células 3 veces con PBS.
  3. Etiquetado de receptores internalizados
    1. Permeabilizar celdas con 0.25% Triton X-100 en PBS durante 5-10 min.
    2. Bloquear la unión inespecífica por incubación con 10% NGS en PBS durante 30 min a RT.
    3. Incubar muestras con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente diluidos en 3% NGS en PBS durante 1 h a RT para etiquetar receptores con etiqueta de anticuerpos internalizados.
      NOTA: En este ejemplo, se utiliza el anticuerpo secundario anticonejo de cabra conjugado Alexa 647 (1:500) para el etiquetado.
    4. Lave las células 3 veces con PBS.

5. Reciclaje (Figura 4)

  1. Internalización de receptores superficiales etiquetados con anticuerpos
    1. Después del etiquetado de los receptores expresados en la superficie y el lavado de anticuerpos (sección 2.2), mantenga las células en medios acondicionados sin anticuerpos y devuélvalas a la incubadora (37 oC) para permitir la internalización.
      NOTA: Para los receptores NMDA, se recomienda n.o 30 min para la internalización.
  2. Bloqueo de receptores de superficie estable expresados
    1. Para bloquear los epítopos en el anticuerpo primario unido a receptores expresados en superficie que no se han internalizado, incubar células con fragmentos de anticuerpos Fab anti-IgG (H+L) no conjugados (contra los primarios utilizados en la sección 2.2) diluidos en medios acondicionados ( 20 g/ml) durante 20 min a RT. Este tratamiento evita la interacción futura con anticuerpos secundarios.
      NOTA: Para este ejemplo, se utilizaron fragmentos de Fab anticonejo de cabra.
      NOTA: Experimento de control: para asegurar que se ha producido un bloqueo completo de los receptores expresados en la superficie, los cubreobjetos de las hermanas se pueden incubar con y sin Fab. Los cultivos deben fijarse inmediatamente después del tratamiento con Fab, y ambos cultivos se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 555. Ninguna señal Alexa 555 en las células incubadas por Fab indica un bloqueo adecuado de anticuerpos.
    2. Lave las células 3 veces con medios acondicionados.
    3. Incubar células con medios acondicionados que contengan un dinaso de 80 m para evitar una mayor internalización y devolver las células a la incubadora (37 oC) para permitir el reciclaje de receptores internalizados. Dynasore es un inhibidor de GTPase que inhibe la dinamina y por lo tanto previene la internalización.
      NOTA: Se recomienda 45 minutos para el reciclaje NMDAR. Tenga en cuenta que Dynasore bloquea exclusivamente el proceso de internalización dependiente de dinamina (por ejemplo, internalización de NMDAR). Sin embargo, la internalización de otras proteínas sinápticas (independientes de la dinamina) todavía puede ocurrir en presencia de Dynasore.
  3. Etiquetado de receptores reciclados
    1. Lave las células una vez con PBS+.
    2. Fijar células con 4% PFA y 4% sacarosa en PBS durante 7-8 min.
      PRECAUCION: Utilice un equipo de protección personal adecuado y una campana de seguridad cuando manipule PFA.
    3. Lave las células 3 veces con PBS.
    4. Bloquee con 10% NGS en PBS durante 30 minutos en RT para evitar la unión inespecífica.
    5. Etiquetar las células con el primer anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT.
      NOTA: En este ejemplo, se utilizó el anticuerpo anticonejo de cabra conjugado por Alexa 555 (1:500) para el etiquetado.
    6. Lave las células 3 veces con PBS.
      NOTA: Lavados más largos con PBS (5-10 min) pueden ayudar a reducir el fondo en la preparación.
  4. Etiquetado de receptores internalizados
    1. Permeabilizar celdas con 0.25% Triton X-100 en PBS durante 5-10 min.
    2. Bloque con 10% NGS en PBS durante 30 min en RT.
    3. Etiqueta con el segundo anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT.
      NOTA: En este ejemplo, se utilizó el anticuerpo anticonejo de cabra conjugado por Alexa 647 (1:500) para el etiquetado.
    4. Lave las células 3 veces con PBS.

6. Montaje e imágenes de muestras

  1. Monte las celdas colocando suavemente las cubiertas del lado de la celda hacia abajo en 12-15 ml del soporte de montaje adecuado.
    NOTA: La aspiración de exceso de medios de montaje mejorará la calidad de las imágenes.
  2. Imagen de células en un microscopio confocal apropiado.
    NOTA: Se recomienda crear una imagen de una pila z con un aumento de 60x con pasos de 0,35 m, que abarcan todo el grosor de la neurona.

7. Consideraciones de tiempo

  1. Este es un protocolo largo que se puede detener en varios puntos. Si lo desea, realice pasos de bloqueo e incubación de anticuerpos primarios durante la noche a 4 oC en una cámara húmeda.
  2. Alternativamente, si lo desea, utilice un procesador de tejido de microondas para acelerar enormemente los tiempos de incubación después de la fijación. Para todos los pasos, utilice 150 W a 30 oC para la configuración "Activado".
    1. Para bloquear, ejecute el procesador a 2 min "On", 1 min "Off", y 2 min "On."
    2. Para los pasos de incubación de anticuerpos primarios y secundarios, ejecute el procesador a 3 min "On", 2 min "Off" y 3 min "On."
      NOTA: No observamos ninguna diferencia de calidad haciendo las alteraciones anteriores al protocolo.

8. Análisis de imágenes

  1. Se recomienda utilizar FIJI para realizar análisis de imágenes, ya que es compatible con varios formatos de archivo. Para nuestros datos, se adquirieron imágenes en el formato de archivo Nikon ND2.
  2. Se proporciona un script de macro para facilitar la cuantificación por lotes de diferentes parámetros preseleccionados por FIJI. Los siguientes pasos se incluyen en la macro:
    NOTA: Para estos ejemplos, se midió la "intensidad integrada".
  3. Abra los archivos de imagen en FIJI y canales separados.
  4. Proyecto Z de cada pila de canales como una proyección de intensidad máxima.
  5. Establezca un umbral inferior para cada canal.
    NOTA: Los umbrales deben determinarse empíricamente para cada conjunto de datos experimentales. Aunque cada canal puede tener un valor de umbral inferior independiente, es crucial que los valores de umbral de canal se mantengan de forma coherente para todas las imágenes del mismo conjunto de datos.
  6. Seleccione de tres a cinco dendritas secundarias o terciarias y guárdelas como regiones de interés (ROI).
  7. Mida la densidad integrada de cada ROI en canales de superficie e intracelulares.
  8. Normalizar la señal para cada ROI dividiendo el valor de densidad integrado del canal de superficie por el canal intracelular.
  9. Repita las mediciones de todas las imágenes de control y experimentales y normalice los valores experimentales para controlar los valores (por ejemplo, GluN2B WT o condiciones de no glicina).

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Representative Results

Este protocolo para estudiar el tráfico de receptores de glutamato se basa en el etiquetado diferencial de los receptores expresados en la superficie celular y los expresados en membranas internas. La segregación se logra mediante el etiquetado de los receptores antes y después de la permeabilización de la membrana, utilizando el mismo anticuerpo primario pero un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo diferente. Como se describe en los pasos opcionales incluidos el protocolo, este es un método muy versátil para interrogar diferentes procesos de tráfico de receptores, como la internalización y el reciclaje, y se puede adaptar fácilmente a las necesidades del investigador (Figura1) .

En primer lugar, se proporciona un método para la cuantificación de receptores expresados en la superficie neuronal. Este protocolo permite cuantificar la expresión superficial basal, así como estudiar los mecanismos moleculares por los cuales diferentes fármacos o mutaciones alteran los niveles basales de los receptores expresados por la superficie. Los receptores expresados en superficie se etiquetaron primero incubando con anticuerpos primarios y secundarios antes de la permeabilización. Después de la permeabilización con 0.25% Triton X-100, el grupo intracelular de receptores es accesible para el etiquetado de anticuerpos. Para ilustrar este protocolo, se llevó a cabo la tinción de superficie frente a intracelular de receptores AMPA (AMPARs) en cultivos de control y después de la inducción de cLTP. Específicamente, las células vivas fueron etiquetadas usando un anticuerpo contra un epítopo extracelular en la subunidad GluA1 del AMPAR, y las células fueron reparadas y luego etiquetadas con Alexa 555-conjugado secundario. Las células fueron permeabilizadas y etiquetadas con el mismo anticuerpo anti-AMPAR e incubadas con un anticuerpo secundario conjugado a Alexa 647. Este etiquetado dual permite una visualización clara de las dos poblaciones de GluA1.

Después de adquirir imágenes confocales, la señal fluorescente se puede cuantificar fácilmente para mostrar un aumento en la expresión superficial, en relación con la población intracelular, siguiendo cLTP (Figura2A,B). Como control, se omitió el paso de permeabilización (incubación con 0.25% Triton X-100) en un cubreobjetos hermanos y se utilizó un anticuerpo primario contra PSD-95, un marcador intracelular estándar para sinapsis excitatorias. Como se muestra en la Figura 2C,no se puede obtener ninguna señal para PSD-95 en células no permeabilizadas, lo que demuestra la integridad de la membrana plasmática. Esto indica que la señal obtenida para "glua1 de superficie" corresponde de hecho a receptores expresados en superficie (es decir, la señal para GluA1 expresado en superficie no incluye receptores intracelulares). Es importante destacar que se puede observar una señal mínima para "GluA1 interiorizado" en condiciones de no permeabilización, mostrando que todos los epítopos superficiales están ocupados por la ronda inicial de etiquetado de anticuerpos (es decir, la señal para GluA1 intracelular no incluye receptores expresados por la superficie).

Un segundo proceso que se puede examinar utilizando este protocolo es la internalización de los receptores expresados en superficie. Específicamente, los receptores de superficie se etiquetan en una célula viva, y las neuronas son devueltas a la incubadora durante un tiempo dado para someterse a la internalización del receptor por la endoocitosis mediada por clathrin. Siguiendo este paso, las células se fijan para preservar la expresión espacial de los receptores primarios etiquetados con anticuerpos (es decir, receptores basados en la superficie e internalizados). A continuación, los receptores de superficie (es decir, aquellos que no se han interiorizado en el período de tiempo de interés), se etiquetan con un anticuerpo secundario antes de la permeabilización. Después de la permeabilización, los receptores que han sido internalizados son etiquetados por un anticuerpo secundario con un fluoróforo diferente.

En este protocolo, se examinó cómo una fosforilación particular dentro del ligando PDZ de la subunidad GluN2B de NMDAR (en S1480) induce la internalización NMDAR. Para ello, los cultivos primarios se transfectó con un receptor fosfomimético, en el que la serina (S1480) había sido sustituida por glutamato (E). El mutante resultante, GluN2B S1480E, actúa como una forma "constitutivamente fosforilada" de GluN2B. Para facilitar el etiquetado de GluN2B e identificar al mutante fosfo-mimético, GFP se utilizó como etiqueta de epítopo en el lado extracelular de GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). Los receptores superficiales en células vivas fueron etiquetados con un anticuerpo anti-GFP durante 15 minutos a RT. A continuación, el exceso de anticuerpos se lavó con medios acondicionados y devolvió las células a 37 oC durante 30 minutos para permitir la endocitosis. Luego, las células se fijaron para congelar el movimiento del receptor. Los receptores que quedaban en la superficie fueron etiquetados con anticuerposecundario conjugado con Alexa 555 antes de la permeabilización.

Para identificar los receptores que habían sido internalizados durante el período de incubación de 30 minutos, las células fueron permeabilizadas, y los receptores internalizados (ya etiquetados con un anticuerpo primario) fueron etiquetados con anticuerpos conjugados alexa 647. Una vez más, esta estrategia de doble etiquetado permite cuantificar la proporción de receptores internalizados. Este ejemplo destaca que la fosforilación de GluN2B en S1480 promueve la internalización de receptores, ya que el mutante fosfo-mimético S1480E mostró una relación de internalización mucho mayor en comparación con los receptores WT (Figura3A,B). Como control, se mantuvo una cultura hermana a 4oC en medios acondicionados durante la internalización para ralentizar fuertemente el proceso. Como era de esperar, no se obtuvo ninguna señal para los receptores "internalizados" en estas condiciones (Figura3C).

Por último, este protocolo se puede utilizar para examinar el reciclaje de receptores previamente internalizados. Esta variación de protocolo es una continuación del protocolo de internalización, siguiendo estos receptores de vuelta a la superficie celular. Hay dos componentes cruciales para esta variación. En primer lugar, los receptores que permanecieron establemente expresados en la superficie durante todo el protocolo (es decir, los receptores que no fueron internalizados o reciclados) deben ser "bloqueados" para que no se confundan con receptores reciclados. Para ello, antes de realizar la etapa de reciclaje, las neuronas vivas se incuban con altas concentraciones de Fab que interactúan con receptores primarios etiquetados con anticuerpos expresados en la superficie para evitar una mayor unión del secundario conjugado con fluoroforó Anticuerpo. En segundo lugar, la internalización debe prevenirse durante la fase de reciclaje, de modo que los receptores reciclados no se repitan internalizados. Esto se hizo mediante la adición de dinastre a los medios de comunicación durante el reciclaje, ya que este fármaco bloquea los procesos que dependen de dinamina como la endodictosis mediada por la clatrina, como la internalización NMDAR. En este protocolo, se realizó el estudio del tráfico del mutante fosfo-mimético GluN2B S1480E, así como el etiquetado superficial de GFP-GluN2B en células vivas, lo que permitió la internalización durante un período de 30 minutos como se explicó anteriormente.

Después de esto, los receptores de superficie que no fueron internalizados durante este período fueron bloqueados por la incubación de las células con Fab durante 20 minutos a RT. A continuación, las células se incubaron de nuevo a 37 oC durante 45 minutos para permitir que GluN2B previamente internalizado se reciclase de nuevo a la superficie celular. Dynasore estuvo presente en los medios de comunicación durante la etapa de reciclaje. La fijación de las células que siguen a este paso permite la identificación de receptores reciclados (es decir, aquellos que están desbloqueados y expresados en la superficie celular) y receptores internalizados (es decir, aquellos que son anticuerpos primarios etiquetados e intracelulares). A 1) etiquetar receptores reciclados con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 555 antes de la permeabilización y 2) etiquetar los receptores internalizados, pero no reciclados, con anticuerpos secundarios conjugados alexa 647, se generó una relación de reciclaje para mostrar que GluN2B S1480E no tiene ningún efecto sobre el reciclaje NMDAR (Figura4A,B). Como control, se aseguró que el bloqueo completo de los receptores expresados en la superficie se produjo mediante la incubación de cubiertas hermanas en presencia o ausencia de Fab, seguido de la fijación de PFA. Como se muestra en la Figura 4C,se puede observar una señal fuerte para GluN2B expresado en superficie en ausencia de bloqueo Fab. Esta señal desaparece en cultivos tratados con Fab, lo que demuestra que el protocolo de bloqueo es suficiente para bloquear completamente los epítopos expresados en superficie y que las señales superficiales observadas después del reciclaje corresponden efectivamente a receptores la membrana plasmática.

Figure 1
Figura 1: Esquema de variaciones de protocolo para estudiar la expresión de la superficie del receptor, la internalización del receptor (endococitosis) y el reciclaje de receptores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: cLTP aumenta la expresión superficial de GluA1. Las neuronas primarias del hipocampo en DIV21 fueron sometidas a LTP química (cLTP) incubando con ECS que contiene glicina. El etiquetado diferenciado de las poblaciones de GluA1 expresadas en superficie (rojo) frente a intracelulares (azul) revela el aumento esperado de la expresión superficial de AMPAR. (A) Imágenes confocales apiladas en Z (proyección de intensidad máxima) de plano único y(B) apiladas en Z. Barras de escala a 50 m (célula entera) o 5 m (dendrita). El gráfico muestra el aumento de la expresión superficial de GluA1 después del protocolo cLTP. Indice de la expresión superficial: receptores de superficie/intracelulares (n a 3; número de células: con - 7; cLTP - 7; valores representan la media de SEM; ****p < 0.0001 utilizando la prueba Mann-Whitney U). (C) Experimento de control en el que se omitió el paso de permeabilización. Además de la superficie y el GluA1 interno, se evaluó el marcador sináptico excitatorio intracelular PSD-95. Barras de escala a 50 m (célula entera) o 5 m (dendrita). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La fosforilación de GluN2B en S1480 promueve la internalización NMDAR. Las neuronas del hipocampo primario fueron infectadas con GFP-GluN2B WT o con el mutante fosfo-mimético GFP-GluN2B S1480E en DIV11-12. Después de 3-4 días de expresión proteica, la GFP superficial fue etiquetada en células vivas con un anticuerpo anti-GFP de conejo y las células fueron devueltas a 37 oC para permitir la internalización de receptores por endocitosis. Los receptores exógenos expresados en superficie se visualizaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 555, y la población internalizada identificada después de la permeabilización utilizando anticuerpos conjugados Alexa 647. Para mayor claridad, la superficie GFP-GluN2B está pseudocoloren verde e internalizada GFP-GluN2B es pseudocolor en blanco. (A) Imágenes confocales apiladas en Z (proyección de intensidad máxima) de plano único y(B) apiladas en Z. Barras de escala a 50 m (célula entera) o 5 m (dendrita). El gráfico muestra la internalización elevada mostrada por el mutante fosfo-mimético GluN2B S1480E. Indice de internalización: receptores internalizados/receptores expresados en superficie (n a 6; número de células: WT a 34; S1480E 28; los valores representan la media de seM; p < 0.001 usando la prueba Mann-Whitney U). (C) Experimento de control en el que se realizó el paso de internalización (Intenaliz.) a 4oC. Barras de escala a 50 m (célula entera) o 5 m (dendrita). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La fosforilación de GluN2B en S1480 no modifica el reciclaje NMDAR. Las neuronas primarias del hipocampo se infectaron con GFP-GluN2B WT o con el mutante fosfo-mimético GFP-GluN2B S1480E en DIV11-12 como se muestra en la Figura3. Después de 3-4 días de expresión proteica, la GFP superficial fue etiquetada en células vivas con un anticuerpo anti-GFP de conejo y las células fueron devueltas a 37 oC para permitir la internalización de receptores por endocitosis. Los receptores restantes expresados en superficie fueron bloqueados por la incubación Fab y se permitió el reciclaje durante 45 min. Los receptores exógenos expresados en superficie disponibles (reciclados) se visualizaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 555, y los internalizados población identificada después de la permeabilización utilizando anticuerpos conjugados Alexa 647. Para mayor claridad, la superficie GFP-GluN2B está pseudocolor en blanco e interiorizada GFP-GluN2B es pseudocolor en verde.  (A) Imágenes confocales de un solo plano y (B) apiladas en Z (proyección de intensidad máxima). Barras de escala a 50 m (célula entera) o 5 m (dendrita). El gráfico muestra la falta de efecto que la fosforilación GluN2B S1480 tiene en el reciclaje. Indice de reciclaje: receptores reciclados/receptores internalizados (n a 5; número de células: WT a 27; S1480E 24; los valores representan la media de seM; n.s. - no significativo usando la prueba Mann-Whitney U). (C) Experimento de control en el que se omitió el paso de incubación Fab para bloquear epítopos expresados en superficie. Barras de escala a 50 m (célula entera) o 5 m (dendrita). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La interacción entre una célula y su entorno (por ejemplo, la comunicación con otras células, la respuesta a diferentes estímulos, etc.), depende en gran medida de la expresión correcta de los receptores en la superficie celular. La regulación rápida y ajustada en el contenido del receptor expresado en la superficie permite una respuesta celular adecuada a un entorno en constante cambio. En el caso particular de las neuronas, las alteraciones en el número, la localización y la composición de subunidades de los receptores expresados sinaptically influye en gran medida en la comunicación sináptica, la plasticidad sináptica, la sinaptogénesis y la poda sináptica3, 5,10. Por lo tanto, el análisis preciso de la expresión de la superficie del receptor y el mecanismo subyacente a su regulación es un tema importante de investigación.

Existen varias modalidades mediante las cuales se puede estudiar la expresión de la superficie del receptor. En general, se dividen en tres categorías principales: i) aislamiento bioquímico de la población de receptores expresada en superficie, ii) técnicas de diagnóstico por imágenes para visualizar receptores en la superficie y iii) técnicas funcionales para monitorear las consecuencias del receptor Activación. Estos enfoques son complementarios y se pueden utilizar conjuntamente para responder preguntas específicas sobre la expresión superficial de los receptores.

Ejemplos de aislamiento bioquímico de los receptores expresados en superficie incluyen protocolos de biotinylación en células cultivadas o rebanadas cerebrales y fraccionamiento subcelular de células cultivadas o tejido11. La biotinilación superficial se basa en el etiquetado de receptores expresados por la superficie con biotina mediante la incubación de los cultivos con biotina activada por éster. El grupo de éster reacciona con los grupos amino primarios (-NH2) para formar enlaces amida estables. Debido a que este reactivo es impermeable a las células, sólo las proteínas expresadas en la superficie se etiquetan con biotina. Después de la lisis celular usando detergentes, el receptor etiquetado se puede recuperar incubando el lisado celular con cuentas de Agarose conjugadas con avidina o sus variantes que tienen una fuerte afinidad por la biotina, luego evaluada por inmunoblotting. El fraccionamiento subcelular es un protocolo bioquímico que utiliza varios pasos de centrifugación para aislar diferentes compartimentos membranosas celulares basados en sus diferentes densidades12. Ambas técnicas son útiles para cuantificar los cambios en la expresión superficial de las proteínas endógenas y se pueden utilizar junto con enfoques farmacológicos (tanto in vivo como en cultivo) para determinar cómo las manipulaciones moleculares afectan a la expresión superficial de receptores. Son particularmente útiles porque los cambios en múltiples receptores endógenos, en relación con un estándar, se pueden cuantificar simultáneamente. Sin embargo, a diferencia de las modalidades de imagen, como la descrita en este protocolo, la resolución espacial se pierde mediante el procesamiento bioquímico de muestras.

El protocolo descrito aquí pertenece a la categoría de técnicas de imagen. Este grupo de enfoques (como el etiquetado de superficies y la creación de imágenes de células vivas de proteínas sobreexpresadas etiquetadas fluorescentemente) son útiles para dar resolución espaciotemporal a la expresión superficial de los receptores. Por ejemplo, examinando la superficie frente a la expresión intracelular de AMPAR, como se ha ejemplificado anteriormente, se puede examinar cómo se pronuncian los cambios en la expresión en las dendritas (el compartimento biológico de interés para esta aplicación en particular). Al igual que el fraccionamiento bioquímico, los medicamentos se pueden utilizar con técnicas de diagnóstico por imágenes para determinar los efectos de un medicamento en la expresión superficial. Además, la transfección de neuronas con receptores que contienen modificaciones (mutaciones o etiquetas) elabora aún más las posibilidades de la toma de imágenes. La transfección con receptores mutantes puede delinear los efectos de una mutación particular en la expresión superficial.

Otro enfoque útil para visualizar el tráfico de receptores es la microscopía de imágenes en vivo después de la transfección de cultivos primarios con construcciones etiquetadas fluorescentes, como PHluorin supereclipética (SEP)- u otras construcciones etiquetadas con fluoróforo13. Los receptores etiquetados con SEP pueden ser particularmente útiles para estudiar los receptores expresados en superficie, ya que este fluoróforo sólo fluoresce cuando se expone al medio extracelular. Al igual que los ejemplos anteriores, se pueden utilizar enfoques farmacológicos, o mutaciones en el receptor, para determinar si estos cambian las características de expresión superficial del receptor. En el caso de los medicamentos, las imágenes de células vivas se pueden utilizar para supervisar las modificaciones en la expresión superficial en tiempo real. Una limitación a las imágenes en vivo es la falta de información mecanicista sobre los cambios en la expresión superficial. Por ejemplo, una disminución de la expresión superficial podría ser el resultado de un aumento de la internalización del receptor, una reducción del reciclaje del receptor o de ambos.

Para responder a esta pregunta, se puede utilizar el protocolo descrito anteriormente. Otro evento importante de tráfico que puede ser monitoreo mediante enfoques de imágenes en vivo es la difusión lateral de receptores entre diferentes compartimentos de la membrana plasmática (por ejemplo, entre sitios sinápticos y extrainápticos). En este caso, la técnica de elección es el uso de enfoques de seguimiento de una sola partícula en los que un nanocristal semiconductor de fluorescencia [es decir, Quantum Dot (QD)] se une a un anticuerpo contra un epítopo extracelular en la proteína de interés. Los QD se caracterizan por una estabilidad notable (permitiendo mucho menos fotoblanqueo que las proteínas fluorescentes tradicionales), brillo fuerte y la alternancia entre el estado de encendido/apagado ("parpadeo"). Mediante el uso de los ajustes adecuados del microscopio, es posible realizar un seguimiento del movimiento de un solo QD (y, por lo tanto, una sola proteína de interés) a través de la membrana plasmática celular14.

El protocolo actual proporciona un examen de los receptores en la población de superficie, la población internalizada y la población reciclada, lo que permite el cálculo de las relaciones para determinar cómo estos procesos controlan la expresión total de la superficie. Además, detener los procesos de internalización o reciclaje en diferentes puntos de tiempo añade resolución temporal. Este método, por lo tanto, permite estudios de expresión superficial espaciotemporal. A diferencia de otras técnicas de diagnóstico por imágenes, también se pueden estudiar los niveles de expresión superficial endógena (por ejemplo, AMPAR), siempre que exista un anticuerpo contra la porción extracelular del receptor. Sin embargo, debido a que este método requiere la fijación de celdas, no es compatible con imágenes de células vivas y, por lo tanto, no puede proporcionar información en tiempo real.

Por último, los enfoques funcionales como la electrofisiología15 o las imágenes de calcio16 son modales poderosos, aunque a menudo indirectos, para estudiar la expresión superficial de los receptores. Estos métodos se basan en la cuantificación de los cambios funcionales en la célula después de la activación del receptor (por ejemplo, cambio en el potencial de la membrana o la concentración de calcio). Utilizando la farmacología para aislar la respuesta de un receptor dado, estos métodos permiten la estimación de los receptores expresados en la superficie celular de una manera precisa y espaciotemporal. Estos métodos son versátiles y permiten el estudio de las células en el cultivo y en condiciones más fisiológicas ex vivo (por ejemplo, rebanadas cerebrales agudas) e invivo. Sin embargo, como en el caso de los enfoques de imágenes en vivo, la información mecanicista a menudo se pierde cuando se utilizan enfoques funcionales.

En resumen, se puede emplear una combinación de técnicas para estudiar la expresión de la superficie del receptor para comprender completamente cómo se controla la expresión de superficie. El protocolo presentado aquí es particularmente potente, ya que proporciona una comprensión mecanicista de la expresión superficial espaciotemporal de los receptores en cultivos primarios disociados.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Northwestern Center for Advanced Microscopy por el uso del microscopio Nikon A1 Confocal y su asistencia en la planificación y análisis de los experimentos. Esta investigación fue apoyada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), y NIA (R00AG041225) y una Beca de Investigador Joven NARSAD de la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento (#24133) (A. S. -C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

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References

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Neurociencia Número 150 receptor de glutamato expresión superficial internalización de receptores reciclaje de receptores alimentación de anticuerpos transfección neuronas
Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados
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Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

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