Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.
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Artículo de método
Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados
En este artículo
Resumen
Resumen
Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de receptores expresados en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, la población de receptores expresados en superficie se está adaptando constantemente y sujeta a estrictos mecanismos de regulación. El ejemplo paradigmático y uno de los eventos de tráfico más estudiados en biología es el control regulado de la expresión sináptica de los receptores de glutamato (GluR). Los GluR median la gran mayoría de la neurotransmisión excitatoria en el sistema nervioso central y controlan los cambios funcionales y estructurales dependientes de la actividad fisiológica a los niveles sináptico y neuronal (por ejemplo, plasticidad sináptica). Las modificaciones en el número, la ubicación y la composición de la subunidad de los GluR expresados en superficie afectan profundamente la función neuronal y, de hecho, las alteraciones en estos factores se asocian con diferentes neuropatías. Presentado aquí es un método para estudiar el tráfico de GluR en las neuronas primarias del hipocampo disociadas. Se utiliza un enfoque de "alimentación de anticuerpos" para visualizar diferencialmente las poblaciones de GluR expresadas en la superficie y las membranas internas. Mediante el etiquetado de receptores de superficie en células vivas y la fijación en diferentes momentos para permitir la endotosis de receptores y / o reciclaje, estos procesos de tráfico pueden ser evaluados y estudiados selectivamente. Este es un protocolo versátil que se puede utilizar en combinación con enfoques farmacológicos o sobreexpresión de receptores alterados para obtener información valiosa sobre los estímulos y mecanismos moleculares que afectan el tráfico de GluR. Del mismo modo, se puede adaptar fácilmente para estudiar otros receptores o proteínas expresadas en la superficie.
Introducción
Las células utilizan el proceso activo de tráfico para movilizar proteínas a localizaciones subcelulares específicas y ejercer una estricta regulación espaciotemporal sobre su función1. Este proceso es especialmente importante para los receptores transmembrana, ya que las respuestas celulares a diferentes estímulos ambientales dependen de cascadas intracelulares desencadenadas por la activación del receptor. Las células son capaces de modificar estas respuestas alterando la densidad, localización y composición de subunidades de los receptores expresada en la superficie celular a través de la regulación del tráfico subcelular de receptores
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Protocolo
El Trabajo relacionado con la preparación del cultivo primario hipocampal fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern (protocolo #IS00001151).
1. Preparación antes del etiquetado
-
Preparación y mantenimiento de las culturas primarias del hipocampo
- Preparar cultivos primarios de hipocampo a una densidad de 150.000 células chapadas en gafas de cubierta recubiertas de poli-D-lisina (0,1 mg/ml) de 18 mm. Excelentes guías para la preparación disociada del cultivo neuronal están disponibles7,8.
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- Preparar cultivos primarios de hipocampo a una densidad de 150.000 células chapadas en gafas de cubierta recubiertas de poli-D-lisina (0,1 mg/ml) de 18 mm. Excelentes guías para la preparación disociada del cultivo neuronal están disponibles7,8.
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Resultados
Este protocolo para estudiar el tráfico de receptores de glutamato se basa en el etiquetado diferencial de los receptores expresados en la superficie celular y los expresados en membranas internas. La segregación se logra mediante el etiquetado de los receptores antes y después de la permeabilización de la membrana, utilizando el mismo anticuerpo primario pero un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo diferente. Como se describe en los pasos opcionales incluidos el protocolo, est.......
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Discusión
La interacción entre una célula y su entorno (por ejemplo, la comunicación con otras células, la respuesta a diferentes estímulos, etc.), depende en gran medida de la expresión correcta de los receptores en la superficie celular. La regulación rápida y ajustada en el contenido del receptor expresado en la superficie permite una respuesta celular adecuada a un entorno en constante cambio. En el caso particular de las neuronas, las alteraciones en el número, la localización y la composición de subunidades de los receptores.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Northwestern Center for Advanced Microscopy por el uso del microscopio Nikon A1 Confocal y su asistencia en la planificación y análisis de los experimentos. Esta investigación fue apoyada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), y NIA (R00AG041225) y una Beca de Investigador Joven NARSAD de la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento (#24133) (A. S. -C.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cubreobjetos de 18 mm de diámetro #1.5 de grosor | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugado cabra anti-ratón secundario | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugado cabra anti-conejo secundario | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugado cabra anti-ratón secundario | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647 conjugada cabra anti-conejo secundaria | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Placas de cultivo celular de fondo plano | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucosa | Sigma | G8270 | |
| Glicina | Tocris | 0219 | |
| Cabra anti-conejo Fab fragmentos | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamina | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | ||
| Ratón anticuerpo anti-GluA1 | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Medios Neurobasales | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxina | Tocris | 1128 | |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antidecoloración Mountant Life | Technologies | P36934 | |
| Anticuerpo anti-GFP de conejo | Invitrogen | A11122 | |
| Anticuerpo anti-PSD-95 de conejo | Señalización celular | 2507 | |
| Estricnina | Tocris | 2785 | |
| Sacarosa | Sigma | S0389 | |
| Superfrost más portaobjetos de microscopio | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
Referencias
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
- Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., H....
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Reimpresiones y permisos
