Summary
本文提出了一种研究分离原发海马培养物的谷氨酸受体(GluR)贩运的方法。使用抗体喂养方法将内源性或过度表达的受体与药理学方法相结合,该方法允许通过调节来识别调节GluR表面表达的分子机制内部化或回收过程。
Abstract
细胞对外部刺激的反应严重依赖在给定时刻在细胞表面表达的受体组。因此,表面表达受体的种群不断适应,并受到严格的调节机制的制约。生物学中研究最多的贩运事件是谷氨酸受体(GluRs)突触表达的调节控制。GluRs调解中枢神经系统的绝大多数兴奋性神经传递,并控制突触和神经元水平(例如,突触可塑性)的生理活动依赖性功能和结构变化。表面表达的GluRs的数量、位置和亚单位成分的修改深刻地影响神经元功能,事实上,这些因素的变化与不同的神经病变有关。这里介绍的是一个研究分离海马原神经元的GluR贩运的方法。"抗体喂养"方法用于对表面和内膜表示的 GluR 群体进行差异可视化。通过在活细胞上标记表面受体并在不同时间固定它们,以便受体内分泌和/或循环利用,可以评估并选择性地研究这些贩运过程。这是一个多功能的协议,可以结合药理学方法或过度表达改变的受体,以获得有关影响GluR贩运的刺激和分子机制的宝贵信息。同样,它可以很容易地适应研究其他受体或表面表达的蛋白质。
Introduction
细胞利用贩运的活性过程来将蛋白质动员到特定的亚细胞定位中,并对其功能进行严格的时空调节1。这个过程对于跨膜受体尤其重要,因为细胞对不同环境刺激的反应依赖于受体激活触发的细胞内级联。细胞可以通过改变受体亚细胞贩运调节2在细胞表面表达的受体的密度、定位和亚单位组成来改变这些反应。将新合成的受体插入血浆膜,以及内分泌和现有受体的循环利用,是确定表面表达受体2的净池的贩运过程的例子。许多分子机制合作调节蛋白质贩运,包括蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰,如磷酸化、泛化或棕榈化2。
在结构高度专业化的强极化细胞中,特别需要调节受体贩运。典型的例子是通过调节贩运谷氨酸受体(GluRs)控制神经元功能3,4。谷氨酸,主要兴奋神经递质,结合和激活表面表达的GluRs,以控制基本的生理神经元功能,如突触神经传递和突触可塑性。从神经发育障碍到神经退行性疾病,在广泛的神经病变中观察到了改变的GluR贩运,这一事实凸显了这个过程的重要性5。因此,了解控制GluR贩运的分子事件在许多研究领域是值得关注的。
在此协议中,使用基于抗体馈送的方法量化原海马神经元表面表达的GluRs水平,并评估内化和再循环的变化如何导致观察到的净表面表达。使用药理学和/或过度表达具有特定突变的外源受体,使该协议成为研究神经元适应不同环境刺激的分子机制的一种特别有力的方法。该协议效用的最后一个例子是研究环境中的多因素变化(如疾病模型中)通过检查此类模型中的表面表达如何影响 GluR 贩运。
使用具体的例子,初步演示了模仿生理突触刺激的药理学操作[化学LTP(cLTP)]如何增加AMPA型GluRs(AMPARs)内源性GluA1亚单位的表面表达6.还分析了NMDA型GluRs(NmDARs)的GluN2B亚单位的过度表达磷-模拟形式的贩运,以说明如何利用该协议研究特定翻译后对GluR贩运的管制修改。虽然使用这些具体的例子,该协议可以很容易地应用于其他GluRs和其他受体和蛋白质,具有抗原细胞外域。如果没有可用于细胞外域的抗体,过度表达细胞外表位标记(例如,标记、Myc-、GFP 标记等)蛋白质有助于蛋白质标记。
当前协议提供了使用特定抗体量化特定 GluR 亚型密度和贩运的说明。该协议可用于研究 1) 总 GluR 表面表达,2) GluR 内化,以及 3) GluR 回收。要单独研究每个过程,建议从第 1 节和第 2 节开始,然后继续第 3、4 或 5 节。在所有情况下,以第 6 和 8 节结束 (图 1)。
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Protocol
西北大学动物护理和使用委员会(协议#IS00001151)审查并批准了与海马原文化制备有关的工作。
1. 标签前的准备
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原始海马培养物的准备与维持
- 在聚D-Lysin--lysin涂层(0.1 mg/mL)18mm盖眼镜上镀有150,000个细胞的密度下制备原发海马培养物。用于分离神经元培养准备的优秀指南有7、8。
注:如果需要,可以使用青霉素(Ara-C,来自DIV1的10 mM)处理培养物,以避免在制备中胶质增殖。
注:替代涂层试剂,如纤维质(1毫克/mL)或层宁(5毫克/mL)可用于代替聚D-赖因。 - 在37°C和5%CO2的神经巴管培养基中保持培养物,辅以B27和2 mM L-谷氨酰胺。
注:如果需要,可以使用L-谷氨酰胺(例如谷氨酸)的替代品。 - 每周一次,去除一半的介质量,用相同体积的辅助神经巴塞介质替换。
- 在聚D-Lysin--lysin涂层(0.1 mg/mL)18mm盖眼镜上镀有150,000个细胞的密度下制备原发海马培养物。用于分离神经元培养准备的优秀指南有7、8。
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可选:突变和/或表位标记受体的转染
注:神经元应在分析时间点前至少3~4天转染,以允许受体表达。使用年轻神经元 [天体外 6_9 (DIV6_9)] 比较旧的 (DIV15_20) 神经元具有更好的转染效率,但无论采用的 DIV 如何,都可以实现足够数量的转染细胞 (>20)。- 对于12孔板的每口井,稀释1.5μg的质粒,含有100μL新鲜神经基质培养基的感兴趣结构,无需B27或微离心管中补充谷氨酰胺,并通过涡旋快速混合。
注:为了成功转染,使用的神经基质介质必须尽可能新鲜,最好是在瓶打开后不到1周。 - 在第二微离心管中,将1μL的适当脂蛋白试剂混合到100μL的新鲜神经基质介质中,然后轻轻混合。
注:不要涡旋利菲反应剂混合物。使用新鲜的脂裂试剂可以提高转染效率。 - 在室温 (RT) 下孵育管 5 分钟。
- 将唇裂试剂混合物滴入DNA混合物中,轻轻混合,在RT孵育20分钟。
- 将每个井中的介质音量调整到 1 mL 的调节介质。
- 将唇裂试剂-DNA混合物滴滴加入井中。
- 将细胞返回到培养箱,并留出至少3~4天的蛋白质表达。
注:为了进行下面概述的内部化和回收协议,海马神经元在DIV11-12处转染,其构造表示在细胞外域(GFP-GluN2B)中带有GFP标记的GluN2B,并在DIV15_16上成像。
- 对于12孔板的每口井,稀释1.5μg的质粒,含有100μL新鲜神经基质培养基的感兴趣结构,无需B27或微离心管中补充谷氨酰胺,并通过涡旋快速混合。
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可选:在条件介质中用药物(慢性或急性)孵育细胞,直到固定。
注:对于急性治疗,在贴标签前开始治疗细胞。根据所使用的药物治疗方案,细胞可在第2节期间保存在含药物介质中。在我们的示例中,DIV21 细胞受 cLTP 协议约束,以增加表面表达的 AMPAR9。- 交换细胞外溶液(ECS)的调节介质。
- 在RT处用ECS中300μM甘氨酸处理细胞3分钟。作为对照,用ECS(不含甘氨酸)处理姐妹盖玻片。
- 用37°C ECS清洗细胞3倍,在继续第2节之前,将ECS中的细胞(不含甘氨酸)返回到细胞培养箱20分钟。
注: ECS (以 mM 表示): 150 纳Cl, 2 CaCl2,5 KCl, 10 HEPES, 30 葡萄糖, 0.001 TTX, 0.01 石氨酸, 和 0.03 丙毒素在 pH 7.4.
2. 表面表达受体的实时标签
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准备用于标记的盖玻片
- 为了节省试剂和便于操作,将盖玻片细胞侧转移到石蜡薄膜覆盖的托盘上。
注:切勿让样品干燥,这一点至关重要。 - 在37°C下保存并维持调节介质,用于孵育和洗涤步骤。
注:对于 18 mm 盖玻片,建议使用 75–100 μL 介质进行孵育,用于抗体标记,120*150 μL 用于内化/回收。
- 为了节省试剂和便于操作,将盖玻片细胞侧转移到石蜡薄膜覆盖的托盘上。
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表面受体与原抗体的标记
- 在RT,在条件介质中稀释原抗体的孵育细胞15分钟。
注:对于GFP标记的受体,使用兔抗GFP抗体,稀释1:1000。对于内源性GluA1,使用鼠标抗GluA1在1:200稀释。 - 使用真空移液器小心吸出含抗体的介质,并用调节介质清洗细胞三次。
注:如果条件介质不可用,则可以使用 PBS* [磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 包含 1 mM MgCl2和 0.1 mM CaCl2] 进行所有洗涤步骤。如果没有温和的真空吸气,可以使用微移液器进行手动吸气。
- 在RT,在条件介质中稀释原抗体的孵育细胞15分钟。
3. 表面表情(图2)
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表面表达受体的二次抗体标记
- 用 PBS® 洗涤一次。
- 在PBS中用4%的甲醛(PFA)和4%蔗糖孵育7-8分钟,修复细胞。
注:与其他固定方法(如甲醇孵育)不同,PFA 不会渗透等离子膜,因此适用于表面表达分析。为获得最佳效果,请使用新鲜烹制的 PFA。在4°C或长期(30天)储存在-20°C时短期储存PFA,允许进行适当的固定。
警告:PFA 是一种已知的致癌物质。操作时,请使用适当的个人防护设备和安全罩。 - 用常规PBS清洗细胞三次。
注:或者,0.1M甘氨酸可用于洗涤PFA而不是PBS,因为甘氨酸将淬火任何剩余的固定剂,可能会增加制备的背景。 - 在RT用PBS中10%正常山羊血清(NGS)孵育30分钟,阻止非特异性结合位点。
注:可以延长阻塞时间,而不会对标签造成不利影响。 - 在RT处用荧光标记的二级抗体在PBS中稀释3%NGS1小时孵育,以标记原抗体标记受体(即表面表达)。
注:在这些示例中,使用 Alexa 555 结合二级抗体的 1:500 稀释:GFP 标记受体的山羊抗兔子和 GluA1 的山羊抗小鼠。 - 用PBS 3x清洗细胞。
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细胞内受体的标签
- 在PBS中用0.25%Triton X-100渗透细胞,在RT时进行5-10分钟。
注:为了检查第一轮抗体标记占据所有表面表位,可以在姐妹文化中跳过这个渗透步骤。在这种情况下,不应获得细胞内受体的信号。此外,为了检查前一节 2 中未标记任何内部受体(即,显示培养中血浆膜的完整性),可以在姐妹培养中跳过渗透步骤,以及针对细胞内蛋白(例如PSD-95或MAP2)可在步骤2.2.1中使用。在这些情况下,不应从该主数据库获得任何信号。在这种情况下,使用了兔子抗PSD-95抗体(1:500)。 - 在 RT 中用 10% NGS 块 30 分钟。
- 通过孵育渗透细胞,在RT时用PBS中3%NGS稀释的2.2部分中相同的原抗体,为细胞内受体贴上标签。
注:标记细胞内受体的抗体稀释可能与标记表面表达受体所需的抗体稀释不同。在GluA1的例子中,使用相同的抗体稀释(1:200)。 - 用PBS清洗细胞3倍。
- 标签与第二荧光标记二级抗体稀释在3%NGS在PBS在RT1小时。
注:在这些示例中,使用了山羊抗小鼠 Alexa 647 偶发二级抗体(用于 GluA1)的 1:500 稀释。 - 用PBS清洗细胞3倍。
- 在PBS中用0.25%Triton X-100渗透细胞,在RT时进行5-10分钟。
4. 内部化 (图 3)
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抗体标记表面受体的内部化
- 贴上表面表达的受体和抗体洗涤(第2.2节)后,在没有抗体的调节介质中保持细胞,并将其返回到培养箱(37°C),以便内化。
注:对于NMDA受体,建议30分钟内化。作为一种控制,在内部化过程中,可以使用4°C的调节介质维持姐妹培养。在这些条件下,应实现最小受体内化。
- 贴上表面表达的受体和抗体洗涤(第2.2节)后,在没有抗体的调节介质中保持细胞,并将其返回到培养箱(37°C),以便内化。
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表面受体的标签
- 用PBS+清洗一次细胞。
- 在PBS中用4%PFA和4%蔗糖修复细胞7-8分钟。
警告:处理 PFA 时,请使用适当的个人防护设备和安全罩。 - 用常规PBS清洗细胞3倍。
- 在 RT 处用 10% NGS 块 30 分钟,以防止非特异性结合。
- 在RT处用荧光标记的二级抗体在PBS中稀释3%NGS的孵育样品1小时,以标记原抗体标记受体(即未内化的表面表达受体)。
注:在本例中,Alexa 555 偶联山羊抗兔子二级抗体 (1:500) 用于标记。 - 用PBS清洗细胞3倍。
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内化受体的标签
- 在PBS中用0.25%Triton X-100渗透细胞5~10分钟。
- 在RT用10%NGS在PBS中孵育30分钟,阻止非特异性结合。
- 在PBS中用荧光标记的二级抗体在PBS中稀释1小时,在RT上孵育样品,以标记内化抗体标记受体。
注:对于此示例,Alexa 647 偶联山羊抗兔子二级抗体 (1:500) 用于标记。 - 用PBS清洗细胞3倍。
5. 回收(图4)
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抗体标记表面受体的内部化
- 贴上表面表达的受体和抗体洗涤(第2.2节)后,在没有抗体的调节介质中保持细胞,并将其返回到培养箱(37°C),以便内化。
注:对于NMDA受体,建议30分钟内化。
- 贴上表面表达的受体和抗体洗涤(第2.2节)后,在没有抗体的调节介质中保持细胞,并将其返回到培养箱(37°C),以便内化。
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阻止稳定表面表达受体
- 为了阻断附着在表面表达受体上尚未内化的主抗体上表位,用未结合的Fab抗IgG(H+L)抗体片段(针对第2.2节中使用的原发性)孵育细胞(20 μg/mL),在 RT 下 20 分钟。这种治疗可以防止将来与二级抗体的相互作用。
注:对于此示例,使用了山羊防兔法布碎片。
注:对照实验:为确保表面表达受体完全阻断,姐妹盖唇可以孵育,有法布和无法布。培养物应在 Fab 治疗后立即固定,并且两种培养物均使用 Alexa 555 结合的二次抗体孵育。Fab 孵化细胞中没有 Alexa 555 信号表示抗体阻塞正确。 - 用调节介质清洗细胞3倍。
- 用含有80μM发电机的调节介质孵育细胞,以防止进一步内化,并将细胞返回到孵化器(37°C),以便回收内化受体。Dynasore 是一种 GTPase 抑制剂,可抑制丁那明,从而防止内化。
注:建议 45 分钟进行 NMDAR 回收。请注意,Dynasore 专门阻止与发电机相关的内化过程(例如,NmDA 内部化)。然而,其他突触蛋白(独立于丁纳明)的内化仍然可能发生在Dynasore的存在。
- 为了阻断附着在表面表达受体上尚未内化的主抗体上表位,用未结合的Fab抗IgG(H+L)抗体片段(针对第2.2节中使用的原发性)孵育细胞(20 μg/mL),在 RT 下 20 分钟。这种治疗可以防止将来与二级抗体的相互作用。
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再生受体的标签
- 用PBS+清洗一次细胞。
- 在PBS中用4%PFA和4%蔗糖修复细胞7-8分钟。
警告:处理 PFA 时,请使用适当的个人防护设备和安全罩。 - 用PBS清洗细胞3倍。
- 在 RT 处用 10% NGS 块 30 分钟,以防止非特异性结合。
- 在RT时,在PBS中用3%NGS稀释的第一个荧光标记二级抗体的标记细胞1小时。
注:对于此示例,Alexa 555 偶联山羊抗兔子抗体 (1:500) 用于标记。 - 用PBS清洗细胞3倍。
注:使用 PBS 进行较长的处理(5-10 分钟)可能有助于减少准备中的背景。
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内化受体的标签
- 在PBS中用0.25%Triton X-100渗透细胞5~10分钟。
- 在 RT 中用 10% NGS 块 30 分钟。
- 标签与第二荧光标记二级抗体稀释在3%NGS在PBS在RT1小时。
注:对于此示例,Alexa 647 偶联山羊抗兔子抗体 (1:500) 用于标记。 - 用PBS清洗细胞3倍。
6. 样品的安装和成像
- 将盖玻片单元侧轻轻置于相应安装介质的 12~15 mL 上,以安装细胞。
注:过度安装介质的渴望将提高图像质量。 - 在适当的共聚焦显微镜上成像细胞。
注:建议以 60 倍放大倍率对 z 堆栈进行成像,步长为 0.35 μm,包括神经元的整个厚度。
7. 时间考虑
- 这是一个可以在多个点停止的长协议。如果需要,在潮湿腔室中4°C处进行阻断和原发抗体孵育步骤过夜。
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或者,如果需要,使用微波组织处理器可以大大加快固定后孵育时间。对于所有步骤,在 30°C 下使用 150 W 进行"打开"设置。
- 要阻止,在 2 分钟"开"、1 分钟"关闭"和 2 分钟"开"时运行处理器。
- 对于初级和二级抗体孵育步骤,在 3 分钟"开"、2 分钟"关闭"和 3 分钟"开"时运行处理器。
注:我们对协议进行上述修改,在质量上没有差异。
8. 图像分析
- 建议使用 FIJI
- 提供了一个宏脚本,用于轻松批量量化由 FIJI 预先选择的不同参数。宏中包括以下步骤:
注:对于这些示例,测量了"综合强度"。 - 在 FIJI 和单独的通道中打开图像文件。
- Z 将每个通道堆栈投影为最大强度投影。
- 为每个通道设置较低的阈值。
注:阈值应为每个实验数据集进行经验确定。虽然每个通道可以有单独的较低阈值,但对于同一数据集的所有图像,必须始终如一地维护通道阈值。 - 选择三到五个二级或三级树突,并将其保存为感兴趣的区域 (ROIs)。
- 测量每个 ROI 在表面和细胞内通道中的集成密度。
- 通过将表面通道的集成密度值除以细胞内通道来标准化每个 ROI 的信号。
- 对所有控制和实验图像重复测量,并标准化实验值以控制值(例如,GluN2B WT 或无甘氨酸条件)。
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Representative Results
研究谷氨酸受体贩运的这个方案基于细胞表面表达的受体和内部膜表达的受体的差分标记。分离是通过在膜渗透之前和之后标记受体,使用相同的原抗体,但二级抗体与不同的荧光团结合。正如包括协议在内的可选步骤所概述的,这是一种非常通用的方法,用于询问不同的受体贩运过程,如内部化和回收化,并可轻松适应调查人员的需求(图1).
首先,提供了一种在神经元表面表达的受体的定量方法。该协议允许定量基础表面表达,以及研究不同药物或突变改变表面表达受体基础水平的分子机制。表面表达受体首先在渗透前用原抗体和二级抗体进行孵育。使用 0.25% Triton X-100 渗透后,受体细胞内池可进行抗体标记。为了说明这一方案,在控制培养和诱导后,对控制培养物的AMPA受体(AMPARs)进行了表面与细胞内染色。具体来说,活细胞在AMPAR的GluA1亚单位中使用抗体标记细胞外表位,然后用Alexa 555结合的二次细胞进行固定。然后,细胞被渗透,并标记相同的抗AMPAR抗体,并与Alexa 647结合的二级抗体孵育。这种双标签允许对两个 GluA1 人群进行清晰的可视化。
获得共聚焦图像后,荧光信号可以很容易地量化,以显示表面表达的增加,相对于细胞内总体,跟随cLTP(图2A,B)。作为对照,在姐妹盖玻片中跳过渗透步骤(培养0.25%Triton X-100),并使用初级抗体对PSD-95,一种用于兴奋性突触的标准细胞内标记。如图2C所示,在非渗透细胞中无法获得PSD-95信号,表明血浆膜的完整性。这表明"表面GluA1"获得的信号确实对应于表面表达的受体(即表面表达的GluA1信号不包括细胞内受体)。重要的是,在非渗透条件下可以观察到"内化GluA1"的最小信号,表明所有表面表位都由初始抗体标记所占据(即,细胞内GluA1的信号不包括表面表达受体)。
利用该协议可以检查的第二个过程是表面表达受体的内部化。具体来说,表面受体被标记在活细胞上,神经元在给定时间内返回到培养箱,通过克拉氏素介导的内分泌进行受体内化。按照此步骤,细胞被固定,以保持主要抗体标记受体(即表面表达和内化受体)的空间表达。然后,表面受体(即,在感兴趣的时期内化的受体)在渗透前用二级抗体标记。渗透后,已内化的受体被具有不同荧光的二级抗体标记。
在本协议中,研究了NMDRGluN2B子单位(S1480)的PDZ配体内的特定磷酸化如何诱导NMDAR内化。为此,主要培养物被用磷-米米作用受体转染,其中丝氨酸(S1480)被谷氨酸(E)替代。由此产生的突变体,GluN2B S1480E,作为GluN2B的"组织磷酸化"形式。为了简化 GluN2B 的标签并识别磷敏体突变体,GFP 用作 GluN2B (GFP-GluN2B S1480E) 细胞外侧的表位标记。活细胞表面受体在RT处被标记为抗GFP抗体15分钟。接下来,用条件介质清洗多余的抗体,将细胞返回到37°C30分钟,以允许内分泌。然后,细胞被固定冻结受体运动。在渗透之前,留在表面的受体与Alexa 555结合的二级抗体一起标记。
为了识别在30分钟潜伏期内化的受体,细胞被渗透,内化受体(已经标有原抗体)然后贴上Alexa 647结合抗体的标签。同样,这种双标签策略允许对内化受体的比例进行量化。此示例强调 S1480 处的 GluN2B 磷酸化促进受体内化,因为磷酸二代突变体 S1480E 比 WT 受体表现出更高的内化比(图3A,B)。作为一种控制,在内部化期间,在条件介质中保持4°C的姐妹培养,以严重减缓这一过程。正如所料,在这些条件下,没有获得"内化"受体的信号(图3C)。
最后,该协议可用于检查先前内化受体的回收。此协议变异是内化协议的延续,通过跟随这些受体回到细胞表面。这种变化有两个关键组成部分。首先,在整个协议期间,在表面保持稳定表达的受体(即未内化或回收的受体)必须被"阻塞",以免被误认为是循环受体。为此,在执行回收步骤之前,活神经元在孵育时要育生高浓度的Fab,这些活性与表面表达的初级抗体标记受体相互作用,以防止荧光团结合二次荧光团的进一步结合抗体。其次,在回收阶段应防止内化,使回收受体不再重复内化。这是通过在回收过程中向介质添加发电机,因为这种药物阻断了依赖丁宁的过程,如克肌林介导的内分泌物,如NMDAR内化。在本协议中,研究了磷-米化突变体GluN2B S1480E的贩运,并在活细胞上进行了GFP-GluN2B的表面标记,从而允许在30分钟内进行内化,如前所述。
在此之后,在此期间未内化的表面受体通过在RT用Fab孵育细胞20分钟而受阻。接下来,细胞在37°C下再次孵育45分钟,使先前内化的GluN2B被回收回细胞表面。在回收过程中,Dynasore 出现在媒体中。按照此步骤的细胞固定允许识别回收受体(即那些被疏通并在细胞表面表达的受体)和内化受体(即那些被标记和细胞内的主要抗体)。通过 1) 在渗透前用 Alexa 555 结合二级抗体标记回收受体,2) 标记内化但未回收的具有 Alexa 647-结合二次抗体的受体,生成回收比率以表明GluN2B S1480E 对 NMDAR 回收没有任何影响(图 4A,B)。作为一种控制,它确保完全阻塞表面表达受体发生通过孵育姐妹盖玻片在存在或不存在Fab,其次是PFA固定。如图4C所示,在没有Fab阻塞的情况下,表面表达的GluN2B可以观察到强信号。此信号在 Fab 处理的培养物中消失,表明阻塞协议足以完全阻断表面表达的表位,并且回收后观察到的表面信号确实对应于被贩运回的受体等离子膜。
图1:研究受体表面表达、受体内化(内分泌)和受体循环的协议变异原理图。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:cLTP增加GluA1的表面表达。DIV21的原发海马神经元通过孵育含甘氨酸ECS进行化学LTP(cLTP)的培养。表面表达(红色)与细胞内(蓝色)GluA1种群的不同标记揭示了AMPAR表面表达的预期增加。(A)单平面和 (B) Z 堆叠(最大强度投影)共聚焦图片。刻度条 = 50 μm(整个细胞)或 5 μm(树突)。图显示了cLTP协议后GluA1表面表达的增加。表面表达指数:表面/细胞内受体(n = 3;细胞数:con = 7;cLTP = 7;值表示平均值 = SEM;使用 Mann-Whitney U 测试值为 0.0001)。(C)跳过渗透步骤的控制实验。除了表面和内部GluA1外,还评估了细胞内兴奋性突触标记PSD-95。刻度条 = 50 μm(整个细胞)或 5 μm(树突)。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:S1480处的绿二乙磷酸化促进NMDAR内化。在DIV11-12上,主海马神经元用GFP-GluN2B WT或磷-哑光突变体GFP-GluN2B S1480E转染。经过3-4天的蛋白质表达后,表面GFP被标记在活细胞上,带有兔子抗GFP抗体,然后细胞返回到37°C,允许内分泌受体内化。表面表达的外源受体与Alexa 555结合二级抗体可视化,并使用Alexa 647结合抗体渗透后识别内化总体。为清楚起见,表面 GFP-GluN2B 为绿色伪色,内化 GFP-GluN2B 为白色伪色。(A)单平面和 (B) Z 堆叠(最大强度投影)共聚焦图片。刻度条 = 50 μm(整个细胞)或 5 μm(树突)。图显示了磷-哑光突变体GluN2B S1480E显示的升高内化。内化指数:内化受体/表面表达受体(n = 6;细胞数量:WT = 34;S1480E = 28;值表示平均值 = SEM;p < 0.001 使用曼-惠特尼 U 测试)。(C)控制在4°C下进行内化步骤(内化)的实验。刻度条 = 50 μm(整个细胞)或 5 μm(树突)。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:S1480处的GluN2B磷酸化不改变NMDAR回收。在DIV11-12上,主海马神经元被转染为GFP-GluN2B WT或磷-哑光突变体GFP-GluN2B S1480E,如图3所示。经过3-4天的蛋白质表达后,表面GFP被标记在活细胞上,带有兔子抗GFP抗体,然后细胞返回到37°C,允许内分泌受体内化。剩余的表面表达受体被Fab孵化阻断,回收期为45分钟。 可用表面表达的外源受体(回收)与Alexa 555结合二次抗体一起可视化,并内化使用 Alexa 647 结合抗体渗透后识别的种群。为清楚起见,表面 GFP-GluN2B 为白色伪色,内化 GFP-GluN2B 为绿色伪色。 (A) 单平面和 (B) Z 堆叠 (最大强度投影) 共聚焦图片.刻度条 = 50 μm(整个细胞)或 5 μm(树突)。图表显示,GluN2B S1480磷酸化对回收缺乏影响。回收指数:再生受体/内化受体(n = 5;细胞数量:WT = 27;S1480E = 24;值表示平均值 = SEM;n.s. = 使用曼-惠特尼 U 测试,无显著)。(C) 控制实验,其中跳过了 Fab 孵化步骤以阻挡表面表达的表位。刻度条 = 50 μm(整个细胞)或 5 μm(树突)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
细胞与其环境之间的相互作用(例如,与其他细胞的沟通、对不同刺激的反应等)在很大程度上依赖于细胞表面受体的正确表达。表面表达受体含量的快速和微调调节使细胞能够对不断变化的环境做出适当的反应。在神经元的特殊情况下,合成表达受体的数量、定位和亚单位组成的变化严重影响突触交流、突触可塑性、突触发生和突触修剪3, 5,10.因此,准确分析受体表面表达及其调控机制是研究的重要课题。
研究受体表面表达的多种模式。一般来说,这些分为三大类:(一) 表面表达受体群的生化分离,(二) 成像技术,以可视化表面的受体,和(三) 监测受体后果的功能技术激活。这些方法是互补的,可以结合使用,回答有关受体表面表达的具体问题。
表面表达受体的生化分离的例子包括培养细胞或脑切片中的生物异化方案,以及培养细胞或组织11的亚细胞分馏。表面生物素化基于用生物素孵育培养物的表层表达受体与生物素。酯组与主要氨基酸组(-NH 2)发生反应,形成稳定的酰胺键。由于这种试剂是细胞不渗透的,只有表面表达的蛋白质被标记为生物素。使用洗涤剂进行细胞莱沙后,通过孵育与阿加罗斯珠结合的Agarose珠子的细胞酶分体,或其对生物素有很强的亲和力的变异体,通过免疫凝固来评价标记受体。亚细胞分馏是一种生物化学方案,它使用几个离心步骤来分离不同的细胞膜腔,基于它们不同的密度12。这两种技术都可用于量化内源性蛋白质表面表达的变化,并可与药理学方法(体内和培养)结合使用,以确定分子操作如何影响表面表达受体。它们特别有用,因为相对于标准,多个内源受体的变化可以同时量化。然而,与本议定书中描述的成像模式不同,通过样品的生化处理,空间分辨率会丧失。
此处描述的协议属于成像技术类别。这组方法(如荧光标记过度表达的蛋白质的表面标记和活细胞成像)有助于为受体的表面表达提供时空分辨率。例如,通过检查AMPAR的表面与细胞内表达(如前面所示),可以检查在树突(此特定应用感兴趣的生物隔间)中表达式的变化是如何发音的。与生化分馏一样,药物可与成像技术一起使用,以确定药物对表面表达的影响。此外,具有修饰(突变或标记)的受体的神经元转染进一步阐述了成像的可能性。与突变受体的转染可以划定特定突变对表面表达的影响。
另一种可视化受体贩运的有用方法是在转染具有荧光标记结构的原生培养物后进行活成像显微镜,如超黄道pHluorin(SEP)或其他荧光标记结构13。SEP 标记的受体对于研究表面表达受体特别有用,因为这种荧光剂只有在暴露于细胞外介质时才会荧光。与前面的例子一样,药理学方法可以使用,或对受体进行突变,以确定这些改变受体的表面表达特征。在药物的情况下,活细胞成像可用于实时监测表面表达的修改。活成像的一个限制是缺乏对表面表达变化的机械洞察力。例如,表面表达的减少可能是受体内化增加、受体循环利用减少的结果,或者两者兼而有之。
为了回答这个问题,可以使用上述协议。另一个可以使用活成像方法监测的重要贩运事件是受体在血浆膜的不同隔间之间横向扩散(例如,突触和突触外位点之间)。在这种情况下,选择的技术是使用单粒子跟踪方法,其中荧光半导体纳米晶体 [即量子点 (QD)]连接到抗体上,以对抗感兴趣的蛋白质上的细胞外表位。QD 具有显著的稳定性(允许比传统荧光蛋白少得多的光漂白)、强亮度以及开/关状态之间的交替("闪烁")。通过使用适当的显微镜设置,可以跟踪单个QD(因此,感兴趣的单个蛋白质)通过细胞血浆膜14的运动。
当前协议对表层、内化总体和回收总体中的受体进行检查,允许计算比率以确定这些过程如何控制总表面表达。此外,在不同时间点停止内部化或回收过程会增加时间分辨率。因此,此方法允许对时空曲面表达式进行研究。与其他成像技术不同,还可以研究内源性表面表达水平(例如AMPAR),前提是存在针对受体细胞外部分的抗体。但是,由于此方法需要固定细胞,因此与活细胞成像不兼容,因此无法提供实时信息。
最后,电生理学15或钙成像16等功能性方法对于研究受体的表面表达具有强大的功能性,但通常是间接的。这些方法基于受体激活后细胞功能变化的量化(例如,膜电位或钙浓度的变化)。使用药理学来分离给定受体的反应,这些方法允许以精确、时空的方式估计细胞表面表达的受体。这些方法是通用的,允许研究细胞在培养和更多的生理条件外(如急性脑切片)和体内细胞。但是,与实时成像方法一样,在使用功能方法时,通常会遗漏机械信息。
总之,研究受体表面表达的技术组合可以充分理解表面表达是如何控制的。这里提出的协议是特别强大的,因为它提供了一个机械理解的受体在分离的主要文化中的时空表面表达。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢西北高级显微镜中心使用尼康A1共聚焦显微镜,并协助规划和分析实验。这项研究得到了NIGMS(T32GM008061)和NIA(R00AG041225)以及脑与行为研究基金会(#24133)的NARSAD青年调查员资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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