Summary
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.
Abstract
Zelluläre Reaktionen auf äußere Reize hängen stark von der Reihe von Rezeptoren ab, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an der Zelloberfläche ausgedrückt werden. Dementsprechend passt sich die Population der oberflächenausgedrückten Rezeptoren ständig an und unterliegt strengen Regulationsmechanismen. Das paradigmatische Beispiel und eines der am meisten untersuchten Handelsereignisse in der Biologie ist die regulierte Kontrolle der synaptischen Expression von Glutamatrezeptoren (GluRs). GluRs vermitteln die überwiegende Mehrheit der exzitatorischen Neurotransmission im zentralen Nervensystem und steuern physiologische aktivitätsabhängige funktionelle und strukturelle Veränderungen auf synaptischer und neuronaler Ebene (z. B. synaptische Plastizität). Veränderungen in der Anzahl, Lage und UntereinheitZusammensetzung der Oberfläche ausgedrückt GluRs tief beeinflussen neuronale Funktion und in der Tat, Veränderungen in diesen Faktoren sind mit verschiedenen Neuropathien verbunden. Präsentiert hier ist eine Methode zur Untersuchung des GluR-Handels mit dissoziierten Hippocampus-Primärneuronen. Ein "Antikörper-Feeding"-Ansatz wird verwendet, um GluR-Populationen, die an der Oberfläche und den inneren Membranen ausgedrückt werden, differenziell zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren auf lebenden Zellen und deren Fixierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um Rezeptoren-Endozytose und/oder Recycling zu ermöglichen, können diese Handelsprozesse evaluiert und selektiv untersucht werden. Dies ist ein vielseitiges Protokoll, das in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen oder Überexpression veränderter Rezeptoren verwendet werden kann, um wertvolle Informationen über Reize und molekulare Mechanismen zu gewinnen, die den GluR-Handel beeinflussen. In ähnlicher Weise kann es leicht angepasst werden, um andere Rezeptoren oder oberflächenausgedrückte Proteine zu untersuchen.
Introduction
Zellen nutzen den aktiven Prozess des Menschenhandels, um Proteine zu bestimmten subzellulären Lokalisationen zu mobilisieren und eine strenge raumzeitliche Regulierung über ihre Funktion auszuüben1. Dieser Prozess ist besonders wichtig für Transmembran-Rezeptoren, da zelluläre Reaktionen auf verschiedene Umweltreize auf intrazellulären Kaskaden beruhen, die durch Dieoraktivierung ausgelöst werden. Zellen sind in der Lage, diese Reaktionen zu ändern, indem sie die Dichte, Lokalisierung und Zusammensetzung der Untereinheiten von Rezeptoren ändern, die an der Zelloberfläche über die subzelluläre HandelsverordnungdesRezeptors 2 ausgedrückt werden. Das Einsetzen von neu synthetisierten Rezeptoren in die Plasmamembran, zusammen mit Endozytose und Recycling bestehender Rezeptoren sind Beispiele für Menschenhandelsprozesse, die den Netzpool von oberflächenausgedrückten Rezeptoren bestimmen2. Viele molekulare Mechanismen arbeiten zusammen, um den Proteinhandel zu regulieren, einschließlich Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung, Ubiquitination oder Palmitoylierung2.
Die Regulierung des Rezeptorhandels ist insbesondere in stark polarisierten Zellen mit hochspezialisierten Strukturen erforderlich. Das paradigmatische Beispiel ist die Kontrolle der neuronalen Funktion durch regulierten Handel mit Glutamatrezeptoren (GluRs)3,4. Glutamat, der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter, bindet und aktiviert oberflächenexprimierte GluRs, um grundlegende physiologische neuronale Funktionen wie synaptische Neurotransmission und synaptische Plastizität zu steuern. Die Tatsache, dass veränderter GluR-Handel in einem breiten Spektrum von Neuropathien beobachtet wurde, von neuroentwicklungsbedingten Störungen bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen, unterstreicht die Bedeutung dieses Prozesses5. Daher ist das Verständnis der molekularen Ereignisse, die den GluR-Handel kontrollieren, in vielen Forschungsbereichen von Interesse.
In diesem Protokoll wird eine Antikörper-Fütterungsmethode verwendet, um den Gehalt an oberflächenausgedrückten GluRs in primären Hippocampus-Neuronen zu quantifizieren und zu bewerten, wie Veränderungen der Internalisierung und des Recyclings zur beobachteten Nettooberflächenexpression führen. Die Verwendung von Pharmakologie und/oder Überexpression von exogenen Rezeptoren mit spezifischen Mutationen macht dieses Protokoll zu einem besonders leistungsfähigen Ansatz für die Untersuchung molekularer Mechanismen, die der neuronalen Anpassung an verschiedene Umweltreize zugrunde liegen. Ein letztes Beispiel für den Nutzen dieses Protokolls ist die Untersuchung, wie sich multifaktorielle Veränderungen in der Umwelt (z. B. bei Krankheitsmodellen) durch die Untersuchung der Oberflächenexpression in solchen Modellen auf den GluR-Handel auswirkt.
Anhand spezifischer Beispiele wird zunächst demonstriert, wie eine pharmakologische Manipulation, die physiologische synaptische Stimulation imitiert [chemische LTP (cLTP)] die Oberflächenexpression der endogenen GluA1-Untereinheit des AMPA-Typs von GluRs (AMPARs) erhöht. 6. Der Handel mit einer überexprimierten phospho-mimetischen Form der GluN2B-Untereinheit von GluRs (NMDARs) vom Typ NMDA wird ebenfalls analysiert, um zu veranschaulichen, wie dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Regulierung des GluR-Handels durch spezifische posttranslationale Änderungen. Obwohl diese spezifischen Beispiele verwendet werden, kann dieses Protokoll leicht auf andere GluRs und andere Rezeptoren und Proteine angewendet werden, die antigene extrazelluläre Domänen besitzen. Für den Fall, dass keine Antikörper für extrazelluläre Domänen verfügbar sind, können Überexpression von extrazellulären Epitop-Tags (z. B. Flag-, Myc-, GFP-taggt, etc.) Proteine bei der Proteinkennzeichnung helfen.
Das aktuelle Protokoll enthält Anweisungen zur Quantifizierung der spezifischen GluR-Subtypdichte und des Menschenhandels mit spezifischen Antikörpern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 1) die gesamte GluR-Oberflächenexpression, 2) GluR-Internalisierung und 3) GluR-Recycling zu untersuchen. Um jeden Prozess einzeln zu studieren, wird empfohlen, mit den Abschnitten 1 und 2 zu beginnen und entweder mit Abschnitt 3, 4 oder 5 fortzufahren. In allen Fällen mit den Abschnitten 6 und 8 beenden (Abbildung 1).
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Protocol
Die Arbeiten im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Primärkultur im Hippocampus wurden vom Northwestern University Animal Care and Use Committee (Protokoll #IS00001151) überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung vor der Etikettierung
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Vorbereitung und Aufrechterhaltung der primären Hippocampuskulturen
- Bereiten Sie primäre Hippocampuskulturen mit einer Dichte von 150.000 Zellen vor, die auf poly-D-Lysin-beschichteten (0,1 mg/ml) 18 mm Deckgläsern plattiert sind. Ausgezeichnete Anleitungen für dissoziierte neuronale Kulturvorbereitung sind verfügbar7,8.
HINWEIS: Bei Bedarf können die Kulturen mit Zytosin-Arabinosid (Ara-C, 10 mM von DIV1) behandelt werden, um eine Gliaproliferation in der Zubereitung zu vermeiden.
HINWEIS: Anstelle von Poly-D-Lysin können alternative Beschichtungsreagenzien wie Fibronectin (1 mg/ml) oder Laminin (5 mg/ml) verwendet werden. - Bewahren Sie die Kulturen in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO2 in 2 ml/Well neurobasaler Medien, ergänzt durch B27 und 2 mM L-Glutamin.
HINWEIS: Ersatzstoffe für L-Glutamin (z.B. Glutamax) können auf Wunsch verwendet werden. - Auf wöchentlicher Basis, entfernen Sie die Hälfte der Menge der Medien und ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von ergänzten neurobasalen Medien.
- Bereiten Sie primäre Hippocampuskulturen mit einer Dichte von 150.000 Zellen vor, die auf poly-D-Lysin-beschichteten (0,1 mg/ml) 18 mm Deckgläsern plattiert sind. Ausgezeichnete Anleitungen für dissoziierte neuronale Kulturvorbereitung sind verfügbar7,8.
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OPTIONAL: Transfektion mutierter und/oder epitopmarkierter Rezeptoren
HINWEIS: Neuronen sollten mindestens 3 bis 4 Tage vor dem Analysezeitpunkt transfiziert werden, um eine Rezeptorexpression zu ermöglichen. Die Verwendung junger Neuronen [Tage in vitro 6–9 (DIV6–9)] führt zu einer besseren Transfektionseffizienz als ältere (DIV15–20) Neuronen, aber eine ausreichende Anzahl von transfizierten Zellen (>20) kann unabhängig von der verwendeten DIV erreicht werden.- Für jeden Brunnen einer 12-Well-Platte 1,5 g Plasmid verdünnen, das das Konstrukt von Interesse in 100 l frischen neurobasalen Medien ohne B27 oder Glutamin-Supplementierung in einem Mikrozentrifugenrohr enthält, und durch schnelles Wirbeln mischen.
HINWEIS: Für eine erfolgreiche Transfektion ist es wichtig, dass die verwendeten neurobasalen Medien so frisch wie möglich sind, idealerweise weniger als 1 Woche nach dem Flaschenöffnen. - In einem zweiten Mikrozentrifugenrohr 1 L eines geeigneten Lipofektionsreagenzes in 100 l frischen neurobasalen Medien mischen und sanft mischen.
HINWEIS: Wirbeln Sie die Lipofektionsreagenzmischung nicht. Die Verwendung von frischen Lipofektionsreagenzien kann die Transfektionseffizienz verbessern. - Inkubieren Sie die Rohre für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Fügen Sie die Lipofection Reagenz Mischung tropfenweise in die DNA-Mischung, mischen Sie sanft, und inkubieren für 20 min bei RT.
- Passen Sie die Medienlautstärke in jedem Brunnen auf 1 ml konditionierte Medien an.
- Fügen Sie das Lipofection-Reagenz -DNA-Mischung tropfenweise in den Brunnen.
- Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie mindestens 3 bis 4 Tage für die Proteinexpression ein.
HINWEIS: Für die zwecke der unten beschriebenen Internalisierungs- und Recyclingprotokolle wurden Hippocampus-Neuronen bei DIV11–12 mit Konstrukten transfiziert, die GluN2B mit GFP in der extrazellulären Domäne (GFP-GluN2B) kenngegliedert und bei DIV15–16 abgebildet sind.
- Für jeden Brunnen einer 12-Well-Platte 1,5 g Plasmid verdünnen, das das Konstrukt von Interesse in 100 l frischen neurobasalen Medien ohne B27 oder Glutamin-Supplementierung in einem Mikrozentrifugenrohr enthält, und durch schnelles Wirbeln mischen.
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OPTIONAL: Inkubation von Zellen mit Medikamenten (chronisch oder akut) in den konditionierten Medien bis zur Fixierung.
HINWEIS: Für die akute Behandlung beginnen Sie mit der Behandlung von Zellen vor der Etikettierung. Je nach verwendetem Arzneimittelbehandlungsprotokoll können Zellen in medikamentenhaltigen Medien während Abschnitt 2 aufrechterhalten werden. In unserem Beispiel waren DIV21-Zellen einem cLTP-Protokoll unterworfen, um die Oberfläche exprimierte AMPAR9zu erhöhen.- Exchange-Konditionierte Medien für extrazelluläre Lösung (ECS).
- Behandeln Sie Zellen mit 300 M Glycin in ECS für 3 min bei RT. Behandeln Sie als Kontrolle einen Schwesterdeckel mit ECS (ohne Glycin).
- Waschen Sie Zellen 3x mit 37 °C ECS und geben Sie die Zellen in ECS (ohne Glycin) 20 min lang in den Zellinkubator zurück, bevor Sie mit Abschnitt 2 fortfahren.
ANMERKUNG: ECS (in mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucose, 0.001 TTX, 0.01 Strychnine und 0.03 Picrotoxin bei pH 7.4.
2. Live-Etikettierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren
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Vorbereiten von Coverlips für die Etikettierung
- Um Reagenzien zu speichern und die Manipulation zu erleichtern, transferieren Sie Dielipse auf der Zellseite bis zu einem paraffinfilmbedeckten Fach.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Proben niemals austrocknen zu lassen. - Speichern und pflegen Sie konditionierte Medien bei 37 °C für Inkubations- und Waschschritte.
HINWEIS: Für einen 18-mm-Abdeckungsschlupf wird eine Inkubation mit 75–100 l Medien für die Antikörperkennzeichnung und 120–150 l für die Internalisierung/Recycling empfohlen.
- Um Reagenzien zu speichern und die Manipulation zu erleichtern, transferieren Sie Dielipse auf der Zellseite bis zu einem paraffinfilmbedeckten Fach.
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Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren mit Primärantikörpern
- Inkubieren Sie Zellen mit primärem Antikörper, der in konditionierten Medien für 15 min bei RT verdünnt wird.
HINWEIS: Für GFP-markierte Rezeptoren wurde ein Anti-GFP-Antikörper gegen Kaninchen bei einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Für endogenes GluA1 wurde Maus anti-GluA1 bei einer Verdünnung von 1:200 verwendet. - Saugen Sie die antikörperhaltigen Medien vorsichtig mit einer Vakuumpipette ab und waschen Sie Zellen dreimal mit konditionierten Medien.
HINWEIS: Wenn konditionierte Medien nicht verfügbar sind, können alle Waschschritte mit PBS+ [Phosphatgepufferte Saline (PBS) mit 1 mM MgCl2 und 0,1 mM CaCl2] durchgeführt werden. Die manuelle Aspiration mit einer Mikropipette kann durchgeführt werden, wenn keine schonende Vakuumaspiration verfügbar ist.
- Inkubieren Sie Zellen mit primärem Antikörper, der in konditionierten Medien für 15 min bei RT verdünnt wird.
3. Oberflächenausdruck (Abbildung 2)
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Sekundäre Antikörperkennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren
- Einmal mit PBS+ waschen.
- Fixzellen durch Inkubation mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und 4% Saccharose in PBS für 7–8 min.
HINWEIS: Im Gegensatz zu anderen Fixierungsmethoden wie der Methanolinkubisierung durchdringt PFA die Plasmamembran nicht und eignet sich daher für die Oberflächenexpressionsanalyse. Für optimale Ergebnisse verwenden Sie frisch zubereitetes PFA. Die kurzfristige Lagerung von PFA bei 4 °C oder eine Langzeitlagerung (bis zu 30 Tagen) bei -20 °C ist für eine angemessene Fixierung zulässig.
ACHTUNG: PFA ist ein bekanntes Karzinogen. Verwenden Sie bei der Handhabung die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube. - Waschen Sie Zellen dreimal mit regulären PBS.
HINWEIS: Alternativ kann 0,1 M Glycin zum Waschen von PFA anstelle von PBS verwendet werden, da Glycin alle verbleibenden Fixierungen, die den Hintergrund in der Zubereitung erhöhen können, abschrecken. - Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS für 30 min bei RT inkubieren.
HINWEIS: Die Sperrzeit kann ohne nachteilige Auswirkungen auf die Etikettierung verlängert werden. - Inkubieren Sie mit fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenausgedrückt) zu kennzeichnen.
HINWEIS: In diesen Beispielen wurde eine 1:500 Verdünnung von Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörpern verwendet: Ziegen-Anti-Kaninchen für GFP-markierte Rezeptoren und Ziegenantimaus für GluA1. - Waschen Sie Zellen mit PBS 3x.
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Kennzeichnung von intrazellulären Rezeptoren
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min bei RT.
HINWEIS: Um zu überprüfen, ob die anfängliche Runde der Antikörperkennzeichnung alle Oberflächenepitope einnimmt, kann dieser Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden. In diesem Fall sollte kein Signal für intrazelluläre Rezeptoren erhalten werden. Um zu überprüfen, ob im vorherigen Abschnitt 2 keine internen Rezeptoren gekennzeichnet wurden (d. h. die Integrität der Plasmamembranen in der Kultur zeigen), kann der Permeabilisierungsschritt in einer Schwesterkultur übersprungen werden, und ein primärer Antikörper gegen intrazelluläres Protein (z. B. PSD-95 oder MAP2) kann in Schritt 2.2.1 verwendet werden. Unter diesen Bedingungen sollte kein Signal von diesem Primär erhalten werden. In diesem Fall wurde ein Kaninchen Anti-PSD-95 Antikörper (1:500) verwendet. - Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.
- Etikettieren Sie intrazelluläre Rezeptoren durch Inkubation permeabilisierter Zellen mit demselben primären Antikörper, der in Abschnitt 2.2 verwendet wird, verdünnt in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT.
HINWEIS: Die Antikörperverdünnung zur Kennzeichnung intrazellulärer Rezeptoren kann anders sein als die, die für die Kennzeichnung oberflächenausgedrückter Rezeptoren erforderlich ist. Im Beispiel von GluA1 wurde die gleiche Antikörperverdünnung (1:200) verwendet. - Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
- Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird.
HINWEIS: In diesen Beispielen wurde eine 1:500 Verdünnung der Ziegenantimaus Alexa 647-konjugierten Sekundärantikörper (für GluA1) verwendet. - Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min bei RT.
4. Internalisierung (Abbildung 3)
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Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
- Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
HINWEIS: Für NMDA-Rezeptoren wird 30 min zur Internalisierung empfohlen. Als Kontrolle kann eine Schwesterkultur mit konditionierten Medien bei 4 °C während des Internalisierungsprozesses aufrechterhalten werden. Minimale Rezeptor-Internalisierung sollte unter diesen Bedingungen auftreten.
- Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
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Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren
- Einmal Zellen mit PBS+ waschen.
- Fix Zellen mit 4% PFA und 4% Saccharose in PBS für 7-8 min.
ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube. - Waschen Sie Zellen 3x mit regulären PBS.
- Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindung zu verhindern.
- Inkubieren Sie Proben mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wurde, um primäre Antikörper-markierte Rezeptoren (d. h. oberflächenausgedrückte Rezeptoren, die nicht internalisiert wurden) zu kennzeichnen.
HINWEIS: In diesem Beispiel wurde Alexa 555-konjugierter Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet. - Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
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Kennzeichnung von internalisierten Rezeptoren
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min.
- Blockieren Sie unspezifische Bindung durch Inkubation mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.
- Inkubieren Sie Proben mit fluoreszierend markiertem sekundären Antikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird, um internalisierte Antikörper-markierte Rezeptoren zu kennzeichnen.
HINWEIS: In diesem Beispiel wird Alexa 647-konjugierter Ziegenanti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet. - Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
5. Recycling (Abbildung 4)
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Internalisierung von Antikörper-markierten Oberflächenrezeptoren
- Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
HINWEIS: Für NMDA-Rezeptoren wird 30 min zur Internalisierung empfohlen.
- Nach der Kennzeichnung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren und Antikörperwäsche (Abschnitt 2.2) zellenin konditionierten Medien ohne Antikörper pflegen und an den Inkubator (37 °C) zurückgeben, um eine Internalisierung zu ermöglichen.
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Blockierung stabiler Oberflächenexprimoren
- Um die Epitope des primären Antikörpers zu blockieren, der an oberflächenexprimierten Rezeptoren befestigt ist, die nicht internalisiert wurden, inkubieren Zellen mit unkonjugierten Fab-Anti-IgG-Antikörperfragmenten (gegen die in Abschnitt 2.2 verwendeten primär verwendeten) in konditionierten Medien ( 20 g/ml) für 20 min bei RT. Diese Behandlung verhindert zukünftige Wechselwirkungen mit sekundären Antikörpern.
HINWEIS: Für dieses Beispiel wurden Ziegenanti-Kaninchen Fab-Fragmente verwendet.
HINWEIS: Kontrollexperiment: Um sicherzustellen, dass eine vollständige Blockierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren stattgefunden hat, können Schwesterabdeckungen mit und ohne Fab inkubiert werden. Kulturen sollten unmittelbar nach der Fab-Behandlung fixiert werden, und beide Kulturen werden mit Alexa 555-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert. Kein Alexa 555 Signal in den Fab-inkubierten Zellen weist auf eine ordnungsgemäße Antikörperblockierung hin. - Waschen Sie Zellen 3x mit konditionierten Medien.
- Inkubieren Sie Zellen mit konditionierten Medien, die 80 M Dynasore enthalten, um eine weitere Internalisierung zu verhindern und Zellen in den Inkubator (37 °C) zurückbringen, um das Recycling von internalisierten Rezeptoren zu ermöglichen. Dynasore ist ein GTPase-Hemmer, der Dynamin hemmt und somit eine Internalisierung verhindert.
HINWEIS: 45 min für NMDAR-Recycling wird empfohlen. Beachten Sie, dass Dynasore ausschließlich den dynaminabhängigen Internalisierungsprozess blockiert (z. B. NMDARs Internalisierung). Jedoch, Internalisierung von anderen synaptischen Protein (dynamin-unabhängig) kann immer noch in Gegenwart von Dynasore auftreten.
- Um die Epitope des primären Antikörpers zu blockieren, der an oberflächenexprimierten Rezeptoren befestigt ist, die nicht internalisiert wurden, inkubieren Zellen mit unkonjugierten Fab-Anti-IgG-Antikörperfragmenten (gegen die in Abschnitt 2.2 verwendeten primär verwendeten) in konditionierten Medien ( 20 g/ml) für 20 min bei RT. Diese Behandlung verhindert zukünftige Wechselwirkungen mit sekundären Antikörpern.
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Kennzeichnung von recycelten Rezeptoren
- Einmal Zellen mit PBS+ waschen.
- Fix Zellen mit 4% PFA und 4% Saccharose in PBS für 7-8 min.
ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit PFA die richtige persönliche Schutzausrüstung und eine Schutzhaube. - Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
- Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT, um unspezifische Bindung zu verhindern.
- Etikettzellen mit erstem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird.
HINWEIS: Für dieses Beispiel wurde Alexa 555-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet. - Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
HINWEIS: Längere Wässerungen mit PBS (5–10 min) können helfen, den Hintergrund in der Vorbereitung zu reduzieren.
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Kennzeichnung von internalisierten Rezeptoren
- Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,25% Triton X-100 in PBS für 5–10 min.
- Block mit 10% NGS in PBS für 30 min bei RT.
- Etikett mit zweitem fluoreszierend markiertem Sekundärantikörper, der in 3% NGS in PBS für 1 h bei RT verdünnt wird.
HINWEIS: Für dieses Beispiel wurde Alexa 647-konjugierter Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (1:500) zur Kennzeichnung verwendet. - Waschen Sie Zellen 3x mit PBS.
6. Montage und Bildgebung von Proben
- Montieren Sie Zellen, indem Sie die Abdeckungslipsen-Zellseite vorsichtig auf 12–15 ml des entsprechenden Montagemediums nach unten legen.
HINWEIS: Die Aspiration von überschüssigen Montagemedien wird die Qualität der Bilder verbessern. - Bildzellen auf einem geeigneten konfokalen Mikroskop.
HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Z-Stack bei 60-facher Vergrößerung mit 0,35 m Schritten abzubilden, der die gesamte Dicke des Neurons umfasst.
7. Zeitüberlegungen
- Dies ist ein langes Protokoll, das an mehreren Punkten angehalten werden kann. Wenn gewünscht, führen Sie Blockierungs- und Primärantikörperinkubationsschritte über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer durch.
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Alternativ, wenn gewünscht, verwenden Sie einen Mikrowellen-Gewebeprozessor, um die Inkubationszeiten nach der Fixierung erheblich zu beschleunigen. Verwenden Sie für alle Schritte 150 W bei 30 °C für die "Ein"-Einstellungen.
- Um zu blockieren, führen Sie den Prozessor bei 2 min "Ein", 1 min "Aus" und 2 min "Ein".
- Führen Sie den Prozessor für primäre und sekundäre Antikörperinkubationsschritte bei 3 min "Ein", 2 min "Aus" und 3 min "Ein" aus.
HINWEIS: Wir beobachten keinen Qualitätsunterschied, indem wir die oben genannten Änderungen am Protokoll vornehmen.
8. Bildanalyse
- Es wird empfohlen, FIJI
- Für die einfache Batch-Quantifizierung verschiedener Parameter, die von FIJI vorab ausgewählt wurden, wird ein Makroskript bereitgestellt. Die folgenden Schritte sind im Makro enthalten:
HINWEIS: Für diese Beispiele wurde die "integrierte Intensität" gemessen. - Öffnen Sie die Bilddateien in FIJI und separate Kanäle.
- Z-Projekt jedes Kanalstapels als maximale Intensitätsprojektion.
- Legen Sie einen niedrigeren Schwellenwert für jeden Kanal fest.
HINWEIS: Für jeden experimentellen Datensatz sollten empirisch Schwellenwerte ermittelt werden. Obwohl jeder Kanal einen separaten niedrigeren Schwellenwert haben kann, ist es entscheidend, dass Kanalschwellenwerte für alle Bilder desselben Datensatzes konsistent beibehalten werden. - Wählen Sie drei bis fünf sekundäre oder tertiäre Dendriten aus und speichern Sie sie als Interessengebiete (ROIs).
- Messen Sie die integrierte Dichte jedes ROI in Oberflächen- und intrazellulären Kanälen.
- Normalisieren Sie das Signal für jeden ROI, indem Sie den integrierten Dichtewert des Oberflächenkanals durch den intrazellulären Kanal dividieren.
- Wiederholen Sie die Messungen für alle Kontroll- und Versuchsbilder und normalisieren Sie experimentelle Werte, um Werte (z. B. GluN2B WT oder No-Glycin-Bedingungen) zu steuern.
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Representative Results
Dieses Protokoll zur Untersuchung des Schmieramrezeptorhandels basiert auf der Differentialkennzeichnung von Rezeptoren, die an der Zelloberfläche ausgedrückt werden, und solchen, die in internen Membranen ausgedrückt werden. Die Segregation wird durch die Kennzeichnung der Rezeptoren vor und nach der Membranpermeabilisierung unter Verwendung desselben primären Antikörpers, aber eines sekundären Antikörpers, der mit einem anderen Fluorophor konjugiert ist, erreicht. Wie in den optionalen Schritten des Protokolls dargelegt, ist dies eine sehr vielseitige Methode zur Abhörung verschiedener Rezeptorenhandelsprozesse, wie Internalisierung und Recycling, und kann leicht an die Bedürfnisse des Prüfers angepasst werden (Abbildung 1) .
Zunächst wird eine Methode zur Quantifizierung von Rezeptoren bereitgestellt, die an der neuronalen Oberfläche exprimiert werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der basalen Oberflächenexpression sowie die Untersuchung der molekularen Mechanismen, durch die verschiedene Medikamente oder Mutationen die Basalkonzentrationen von oberflächenexprimationsiven Rezeptoren verändern. Oberflächenexprimoren wurden vor der Permeabilisation zunächst durch Inkubation mit primärem und sekundärem Antikörper gekennzeichnet. Nach permeabilisierenmit 0,25% Triton X-100 ist der intrazelluläre Pool von Rezeptoren für die Antikörperkennzeichnung zugänglich. Zur Veranschaulichung dieses Protokolls wurde die Oberflächen- und intrazelluläre Färbung von AMPA-Rezeptoren (AMPARs) in Kontrollkulturen und nach Derinduktion von cLTP durchgeführt. Insbesondere wurden lebende Zellen mit einem Antikörper gegen ein extrazelluläres Epitop in der GluA1-Untereinheit des AMPAR beschriftet, und die Zellen wurden dann mit Alexa 555-konjugiertsekundär fixiert. Die Zellen wurden dann permeabilisiert und mit demselben Anti-AMPAR-Antikörper beschriftet und mit einem sekundären Antikörper, der mit Alexa 647 konjugiert ist, inkubiert. Diese doppelte Beschriftung ermöglicht eine klare Visualisierung der beiden GluA1-Populationen.
Nach dem Erfassen konfokaler Bilder kann das fluoreszierende Signal leicht quantifiziert werden, um eine Zunahme der Oberflächenexpression im Verhältnis zur intrazellulären Population nach cLTP zu zeigen (Abbildung 2A,B). Als Kontrolle wurde der Permeabilisationsschritt (Inkubation mit 0,25% Triton X-100) in einem Schwester-Coverslip übersprungen und ein primärer Antikörper gegen PSD-95, einen standardintrazellulären Marker für exzitatorische Synapsen, verwendet. Wie in Abbildung 2Cdargestellt, kann kein Signal für PSD-95 in nicht-permeabilisierten Zellen erhalten werden, was die Integrität der Plasmamembran demonstriert. Dies deutet darauf hin, dass das für "OberflächengluA1" erhaltene Signal tatsächlich oberflächenausgedrückten Rezeptoren entspricht (d. h. das Signal für oberflächenausgedrücktes GluA1 schließt keine intrazellulären Rezeptoren ein). Wichtig ist, dass ein minimales Signal für "internalisiertegluA1" unter Nicht-Permeabilisierungsbedingungen beobachtet werden kann, was zeigt, dass alle Oberflächenepitope durch die anfängliche Runde der Antikörperkennzeichnung belegt sind (d. h. das Signal für intrazelluläres GluA1 nicht oberflächenausgedrückten Rezeptoren).
Ein zweiter Prozess, der unter Verwendung dieses Protokolls untersucht werden kann, ist die Internalisierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren. Insbesondere werden Oberflächenrezeptoren auf einer lebenden Zelle beschriftet, und Neuronen werden für eine bestimmte Zeit in den Inkubator zurückgeführt, um sich einer Rezeptorinternalisierung durch clathrin-vermittelte Endozytose zu unterziehen. Nach diesem Schritt werden Zellen fixiert, um die räumliche Expression primärer antikörperbeschriftter Rezeptoren (d. h. oberflächenausgedrückte und internalisierte Rezeptoren) zu erhalten. Dann werden Oberflächenrezeptoren (d. h. solche, die im Zinszeitraum nicht verinnerlicht wurden) vor der Permeabilisierung mit einem sekundären Antikörper gekennzeichnet. Nach der Permeabilisierung werden die verinnerlichten Rezeptoren durch einen sekundären Antikörper mit einem anderen Fluorophor gekennzeichnet.
In diesem Protokoll wurde untersucht, wie eine bestimmte Phosphorylierung innerhalb des PDZ-Ligands der GluN2B-Untereinheit von NMDARs (bei S1480) eine NMDAR-Internalisierung induziert. Dazu wurden Primärkulturen mit einem phospho-mimetischen Rezeptor transfiziert, bei dem Serin (S1480) durch Glutamat (E) ersetzt worden war. Die resultierende Mutante, GluN2B S1480E, wirkt als "konstitutiv-phosphorylierte" Form von GluN2B. Um die Kennzeichnung von GluN2B zu erleichtern und den phospho-mimetischen Mutant zu identifizieren, wurde GFP als Epitop-Tag auf der extrazellulären Seite von GluN2B (GFP-GluN2B S1480E) verwendet. Oberflächenrezeptoren auf lebenden Zellen wurden bei RT 15 min lang mit einem Anti-GFP-Antikörper beschriftet. Als nächstes wurde der überschüssige Antikörper mit konditionierten Medien gewaschen und die Zellen 30 min lang auf 37 °C zurückgeführt, um eine Endozytose zu ermöglichen. Dann wurden Zellen fixiert, um die Bewegung des Rezeptors einzufrieren. Rezeptoren, die auf der Oberfläche verblieben waren, wurden dann vor der Permeabilisation mit Alexa 555-konjugiertem Sekundärantikörper beschriftet.
Um Rezeptoren zu identifizieren, die während der 30 min Inkubationszeit verinnerlicht worden waren, wurden die Zellen permeabilisiert, und die internalisierten Rezeptoren (bereits mit einem primären Antikörper gekennzeichnet) wurden dann mit Alexa 647-konjugierten Antikörpern gekennzeichnet. Auch diese Dual-Labeling-Strategie ermöglicht die Quantifizierung des Anteils der internalisierten Rezeptoren. Dieses Beispiel zeigt, dass die GluN2B-Phosphorylierung bei S1480 die Verininternalisierung des Rezeptors fördert, da der phospho-mimetische Mutant S1480E ein viel höheres Internalisierungsverhältnis im Vergleich zu WT-Rezeptoren aufweist (Abbildung 3A,B). Als Kontrolle wurde eine Schwesterkultur bei 4 °C während der Internalisierung in konditionierten Medien beibehalten, um den Prozess stark zu verlangsamen. Wie erwartet wurde kein Signal für "internalisierte" Rezeptoren unter diesen Bedingungen erhalten (Abbildung 3C).
Schließlich kann dieses Protokoll verwendet werden, um das Recycling von zuvor internalisierten Rezeptoren zu untersuchen. Diese Protokollvariation ist eine Fortsetzung des Internalisierungsprotokolls, indem diese Rezeptoren zurück zur Zelloberfläche folgen. Es gibt zwei entscheidende Komponenten für diese Variation. Erstens müssen Rezeptoren, die während des gesamten Protokolls stabil an der Oberfläche ausgedrückt wurden (d. h. Rezeptoren, die nicht internalisiert oder recycelt wurden), "blockiert" werden, damit sie nicht mit recycelten Rezeptoren verwechselt werden. Um dies zu tun, vor der Durchführung der Recycling-Schritt, werden lebende Neuronen mit hohen Konzentrationen von Fab inkubiert, die mit primären Antikörper-markierten Rezeptoren an der Oberfläche exprimiert interagieren, um eine weitere Bindung der Fluorophor-konjugierten sekundären antikörper. Zweitens sollte die Internalisierung während der Recyclingphase verhindert werden, damit recycelte Rezeptoren nicht wieder internalisiert werden. Dies geschah durch Hinzufügen von Dynasor zu den Medien während des Recyclings, da dieses Medikament Prozesse blockiert, die auf Dynamin angewiesen sind, wie clathrin-vermittelte Endozytose, wie NMDAR Internalisierung. In diesem Protokoll wurde der Handel mit dem phospho-mimetischen Mutanten GluN2B S1480E sowie die Oberflächenbeschriftung von GFP-GluN2B auf lebenden Zellen untersucht, was eine Internalisierung während einer 30-min-Periode ermöglichte, wie zuvor erläutert.
Danach wurden Oberflächenrezeptoren, die während dieser Zeit nicht verinnerlicht wurden, durch Inkubation der Zellen mit Fab für 20 min bei RT blockiert. Als nächstes wurden die Zellen 45 min lang wieder bei 37 °C inkubiert, damit zuvor verinnerlichtes GluN2B wieder auf die Zelloberfläche zurückgeführt werden konnte. Dynasore war während des Recyclingschritts in den Medien präsent. Die Fixierung der Zellen nach diesem Schritt ermöglicht die Identifizierung von recycelten Rezeptoren (d. h. solchen, die auf der Zelloberfläche entsperrt und exprimiert werden) und internalisierten Rezeptoren (d. h. solche, die primär antikörperbeschriftet und intrazellulär sind). Durch 1) Kennzeichnung von recycelten Rezeptoren mit einem Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörper vor der Permeabilisierung und 2) verinnerlichten, aber nicht recycelten Rezeptoren mit Alexa 647-konjugiertem Sekundärantikörper wurde ein Recycling-Verhältnis erzeugt, um zu zeigen, dass GluN2B S1480E hat keine Auswirkungen auf das NMDAR-Recycling (Abbildung 4A,B). Als Kontrolle wurde sichergestellt, dass eine vollständige Blockierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren durch Inkubation von Schwester-Coverlips in Gegenwart oder Abwesenheit von Fab erfolgte, gefolgt von PFA-Fixierung. Wie in Abbildung 4Cdargestellt, kann bei fehlender Fab-Blockierung ein starkes Signal für oberflächenausgedrücktes GluN2B beobachtet werden. Dieses Signal verschwindet in Fab-behandelten Kulturen, was zeigt, dass das Sperrprotokoll ausreicht, um die oberflächenausgedrückten Epitope vollständig zu blockieren, und dass die nach dem Recycling beobachteten Oberflächensignale tatsächlich Rezeptoren entsprechen, die Plasmamembran.
Abbildung 1: Schematische Protokollvariationen zur Untersuchung der Rezeptoroberflächenexpression, der Reinisierung des Rezeptors (Endozytose) und des Rezeptorrecyclings. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: cLTP erhöht die Oberflächenexpression von GluA1. Primäre Hippocampus-Neuronen bei DIV21 wurden der chemischen LTP (cLTP) durch Inkubation mit Glycin-haltigem ECS unterzogen. Die deutliche Beschriftung von oberflächenausgedrückten (roten) vs. intrazellulären (blauen) GluA1-Populationen zeigt den erwarteten Anstieg der Oberflächenexpression von AMPAR. (A) Einzelne Ebene und (B) Z-gestapelte (maximale Intensitätsprojektion) konfokale Bilder. Skalenbalken = 50 m (ganze Zelle) oder 5 m (Dendrit). Grafik zeigt die erhöhte Oberflächenexpression von GluA1 nach dem cLTP-Protokoll. Oberflächenexpressionsindex: Oberflächen-/intrazelluläre Rezeptoren (n = 3; Anzahl der Zellen: con = 7; cLTP = 7; Werte stehen für mittelwert - SEM; ****p < 0.0001 mit Mann-Whitney U-Test). (C) Kontrollexperiment, bei dem der Permeabilisierungsschritt übersprungen wurde. Neben der Oberfläche und dem inneren GluA1 wurde der intrazelluläre exzitatorische synaptische Marker PSD-95 ausgewertet. Skalenbalken = 50 m (ganze Zelle) oder 5 m (Dendrit). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Phosphorylierung von GluN2B bei S1480 fördert die NMDAR-Internalisierung. Primäre Hippocampus-Neuronen wurden entweder mit GFP-GluN2B WT oder dem phospho-mimetischen Mutanten GFP-GluN2B S1480E auf DIV11-12 transfiziert. Nach 3-4 Tagen Proteinexpression wurde das Oberflächen-GFP auf lebenden Zellen mit einem Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper beschriftet und die Zellen wurden dann auf 37 °C zurückgeführt, um eine Verinnerung des Rezeptors durch Endozytose zu ermöglichen. Oberflächenexprimus-exogene Rezeptoren wurden mit Alexa 555-konjugierten sekundären Antikörpern visualisiert und die verinnerlichte Population nach Permeabilisierung mit Alexa 647-konjugiertem Antikörper identifiziert. Zur Verdeutlichung ist die Oberfläche GFP-GluN2B in grün und verinnerlicht GFP-GluN2B ist pseudofarbig in weiß. (A) Einzelne Ebene und (B) Z-gestapelte (maximale Intensitätsprojektion) konfokale Bilder. Skalenbalken = 50 m (ganze Zelle) oder 5 m (Dendrit). Grafik zeigt die erhöhte Internalisierung, die durch den phospho-mimetischen Mutanten GluN2B S1480E angezeigt wird. Internalisierungsindex: internalisierte Rezeptoren/oberflächenausgedrückte Rezeptoren (n = 6; Anzahl der Zellen: WT = 34; S1480E = 28; Werte stehen für den Mittelwert von SEM; p < 0.001 mit Mann-Whitney U Test). (C) Kontrollexperiment, bei dem der Internalisierungsschritt (Intenaliz.) bei 4 °C durchgeführt wurde. Skalenbalken = 50 m (ganze Zelle) oder 5 m (Dendrit). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Phosphorylierung von GluN2B bei S1480 ändert das NMDAR-Recycling nicht. Primäre Hippocampus-Neuronen wurden entweder mit GFP-GluN2B WT oder dem phospho-mimetischen Mutanten GFP-GluN2B S1480E auf DIV11-12 transfiziert, wie in Abbildung 3dargestellt. Nach 3-4 Tagen Proteinexpression wurde das Oberflächen-GFP auf lebenden Zellen mit einem Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper beschriftet und die Zellen wurden dann auf 37 °C zurückgeführt, um eine Verinnerung des Rezeptors durch Endozytose zu ermöglichen. Verbleibende oberflächenexprimierte Rezeptoren wurden durch Fab-Inkubation blockiert und das Recycling war für 45 min erlaubt. Verfügbare oberflächenexogene Rezeptoren (recycelt) wurden mit Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörpern visualisiert und der verinnerlichte sekundäre Antikörper nach Permeabilisierung mit Alexa 647-konjugiertem Antikörper identifiziert. Zur Verdeutlichung ist die Oberfläche GFP-GluN2B in weiß pseudofarbig und verinnerlicht GFP-GluN2B ist pseudofarbig in grün. (A) Einzelne Ebene und (B) Z-gestapelte (maximale Intensitätsprojektion) konfokale Bilder. Skalenbalken = 50 m (ganze Zelle) oder 5 m (Dendrit). Grafik zeigt die mangelnde Wirkung der GluN2B S1480 Phosphorylierung auf das Recycling. Recyclingindex: recycelte Rezeptoren/internalisierte Rezeptoren (n = 5; Anzahl der Zellen: WT = 27; S1480E = 24; Werte stehen für den Mittelwert von SEM; n.s. = nicht signifikant mit Mann-Whitney U-Test). (C) Kontrollexperiment, bei dem der Fab-Inkubationsschritt zum Blockieren oberflächenausgedrückter Epitope übersprungen wurde. Skalenbalken = 50 m (ganze Zelle) oder 5 m (Dendrit). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Interaktion zwischen einer Zelle und ihrer Umgebung (z. B. Kommunikation mit anderen Zellen, Reaktion auf unterschiedliche Reize usw.) beruht stark auf der korrekten Expression von Rezeptoren an der Zelloberfläche. Die schnelle und fein abgestimmte Regulierung des oberflächenausgedrückten Rezeptorinhalts ermöglicht eine angemessene zelluläre Reaktion auf eine sich ständig verändernde Umgebung. Im besonderen Fall von Neuronen, Veränderungen in der Anzahl, Lokalisierung und Untereinheit Zusammensetzung der synaptisch exprimierenden Rezeptoren stark beeinflusst synaptische Kommunikation, synaptische Plastizität, Synaptogenese, und synaptische Beschnitt3, 5,10. Daher ist eine genaue Analyse der Rezeptoroberflächenexpression und des Mechanismus, der seiner Regulierung zugrunde liegt, ein wichtiges Forschungsthema.
Es gibt eine Reihe von Modalitäten, mit denen die Rezeptoroberflächenexpression untersucht werden kann. Im Allgemeinen fallen diese unter drei Hauptkategorien: (i) biochemische Isolierung der oberflächenausgedrückten Rezeptorpopulation, (ii) bildgebende Verfahren zur Visualisierung von Rezeptoren an der Oberfläche und (iii) funktionelle Techniken zur Überwachung der Folgen von Rezeptoren Aktivierung. Diese Ansätze ergänzen sich und können in Verbindung mit spezifischen Fragen zur Oberflächenexpression von Rezeptoren beantwortet werden.
Beispiele für die biochemische Isolierung von oberflächenausgedrückten Rezeptoren sind Biotinylierungsprotokolle in kultivierten Zellen oder Gehirnscheiben und subzelluläre Fraktionierung von kultivierten Zellen oder Gewebe11. Die Oberflächenbiotinylierung basiert auf der Kennzeichnung von oberflächenexprimierbaren Rezeptoren mit Biotin durch Inkubation der Kulturen mit esteraktiviertem Biotin. Die Estergruppe reagiert mit primären Aminogruppen (-NH2) und bildet stabile Amidbindungen. Da dieses Reagenz zellunperbar ist, werden nur oberflächenexprimierte Proteine mit Biotin gekennzeichnet. Nach der zellulären Lyse mit Reinigungsmitteln kann der markierte Rezeptor durch Inkubation des Zelllysats mit Agarose-Perlen, die zu Avidin konjugiert sind, oder seinen Varianten, die eine starke Affinität zu Biotin haben, zurückgewonnen werden, die dann durch Immunoblotting bewertet werden. Die subzelluläre Fraktionierung ist ein biochemisches Protokoll, das mehrere Zentrifugationsschritte verwendet, um verschiedene zelluläre membranöse Kompartimente basierend auf ihrer unterschiedlichen Dichte zu isolieren12. Beide Techniken sind nützlich, um Veränderungen in der Oberflächenexpression endogenes Proteine zu quantifizieren und können in Verbindung mit pharmakologischen Ansätzen (sowohl in vivo als auch in der Kultur) verwendet werden, um zu bestimmen, wie molekulare Manipulationen die Oberflächenexpression beeinflussen. Rezeptoren. Sie sind besonders nützlich, da Veränderungen in mehreren endogenen Rezeptoren, relativ zu einem Standard, gleichzeitig quantifiziert werden können. Im Gegensatz zu bildgebenden Modalitäten, wie sie in diesem Protokoll beschrieben werden, geht die räumliche Auflösung jedoch durch die biochemische Verarbeitung von Proben verloren.
Das hier beschriebene Protokoll gehört zur Kategorie bildgebende Verfahren. Diese Gruppe von Ansätzen (z. B. Oberflächenbeschriftung und Live-Zell-Bildgebung von fluoreszierend überdprimierten Proteinen) sind nützlich, um der Oberflächenexpression von Rezeptoren eine raumzeitliche Auflösung zu geben. Zum Beispiel kann man durch die Untersuchung der Oberflächen- und intrazellulären Expression von AMPAR, wie bereits gezeigt, untersuchen, wie Veränderungen in der Expression in den Dendriten (dem biologischen Fach, das für diese spezielle Anwendung von Interesse ist) ausgesprochen werden. Wie die biochemische Fraktionierung können Medikamente mit bildgebenden Verfahren verwendet werden, um die Auswirkungen eines Medikaments auf die Oberflächenexpression zu bestimmen. Darüber hinaus erarbeitet die Transfektion von Neuronen mit Rezeptoren, die Modifikationen (Mutationen oder Tags) enthalten, die Möglichkeiten für die Bildgebung weiter. Transfektion mit mutierten Rezeptoren kann die Auswirkungen einer bestimmten Mutation auf die Oberflächenexpression ableiten.
Ein weiterer nützlicher Ansatz zur Visualisierung des Rezeptorhandels ist die Live-Bildgebungsmikroskopie nach der Transfektion von Primärkulturen mit fluoreszierend getaggten Konstrukten, wie Superecliptic pHluorin (SEP)- oder anderen Fluorophor-getaggten Konstrukten13. SEP-markierte Rezeptoren können besonders nützlich für die Untersuchung von Oberflächenexprimoren sein, da dieses Fluorophor nur fluoreszieren datär ist, wenn es dem extrazellulären Medium ausgesetzt ist. Wie frühere Beispiele können pharmakologische Ansätze oder Mutationen am Rezeptor verwendet werden, um festzustellen, ob diese die Oberflächenexpressionseigenschaften des Rezeptors verändern. Bei Arzneimitteln kann die Live-Zell-Bildgebung verwendet werden, um die Veränderungen der Oberflächenexpression in Echtzeit zu überwachen. Eine Einschränkung der Live-Bildgebung ist der Mangel an mechanistischen Einblicken in Veränderungen im Oberflächenausdruck. Beispielsweise kann eine verminderte Oberflächenexpression entweder das Ergebnis einer erhöhten Rezeptorinternalisierung, eines reduzierten Rezeptorrecyclings oder beides sein.
Um diese Frage zu beantworten, kann das oben beschriebene Protokoll verwendet werden. Ein weiteres wichtiges Ereignis im Bereich des Menschenhandels, das mithilfe von Live-Imaging-Ansätzen überwacht werden kann, ist die laterale Diffusion von Rezeptoren zwischen verschiedenen Kompartimenten in der Plasmamembran (z. B. zwischen synaptischen und extrasynaptischen Standorten). In diesem Fall ist die Technik der Wahl die Verwendung von Single-Partikel-Tracking-Ansätzen, bei denen ein Fluoreszenz-Halbleiter-Nanokristall [d.h. Quantum Dot (QD)] an einem Antikörper gegen ein extrazelluläres Epitop auf dem Protein von Interesse befestigt ist. QDs zeichnen sich durch bemerkenswerte Stabilität (die viel weniger Photobleichung als herkömmliche fluoreszierende Proteine ermöglicht), eine starke Helligkeit und den Wechsel zwischen Ein-/Aus-Status ("Blinken") aus. Mit den entsprechenden Mikroskopeinstellungen ist es möglich, die Bewegung eines einzelnen QD (und damit eines einzelnen Proteins von Interesse) durch die Zellplasmamembran14zu verfolgen.
Das aktuelle Protokoll bietet eine Untersuchung von Rezeptoren in der Oberflächenpopulation, der internalisierten Population und der recycelten Population, so dass die Berechnung von Verhältnissen ermöglicht wird, um zu bestimmen, wie diese Prozesse die gesamte Oberflächenexpression steuern. Darüber hinaus führt das Stoppen der Internalisierungs- oder Recyclingprozesse zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu einer zeitlichen Auflösung. Diese Methode ermöglicht daher raumzeitliche Oberflächenexpressionsstudien. Im Gegensatz zu den anderen bildgebenden Verfahren können auch Spiegel der endogenen Oberflächenexpression untersucht werden (z.B. AMPAR), sofern ein Antikörper gegen den extrazellulären Teil des Rezeptors vorhanden ist. Da diese Methode jedoch eine Fixierung von Zellen erfordert, ist sie nicht mit der Live-Zell-Bildgebung kompatibel und kann daher keine Echtzeitinformationen liefern.
Schließlich sind funktionelle Ansätze wie Elektrophysiologie15 oder Kalzium-Bildgebung16 leistungsfähige, wenn auch oft indirekte Manieren, um die Oberflächenexpression von Rezeptoren zu untersuchen. Diese Methoden basieren auf der Quantifizierung funktioneller Veränderungen in der Zelle nach der Rezeptoraktivierung (z. B. Veränderung des Membranpotentials oder der Calciumkonzentration). Mit Hilfe der Pharmakologie, um die Reaktion eines bestimmten Rezeptors zu isolieren, ermöglichen diese Methoden eine genaue, räumlich-zeitliche Abschätzung der rezeptoren, die an der Zelloberfläche ausgedrückt werden. Diese Methoden sind vielseitig und ermöglichen die Untersuchung von Zellen in Kultur und unter physiologischeren Bedingungen ex vivo (z.B. akute Hirnscheiben) und in vivo. Wie bei den Live-Bildgebungsansätzen werden jedoch bei funktionalen Ansätzen häufig mechanistische Informationen übersehen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Kombination von Techniken zur Untersuchung der Rezeptoroberflächenexpression eingesetzt werden kann, um vollständig zu verstehen, wie die Oberflächenexpression gesteuert wird. Das hier vorgestellte Protokoll ist besonders mächtig, da es ein mechanistisches Verständnis der räumlich-zeitlichen Oberflächenexpression von Rezeptoren in dissoziierten Primärkulturen bietet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken dem Northwestern Center for Advanced Microscopy für den Einsatz des Nikon A1 Konfokalmikroskops und deren Unterstützung bei der Planung und Analyse der Experimente. Diese Forschung wurde von NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) und NIA (R00AG041225) und einem NARSAD Young Investigator Grant von der Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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