Summary
この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。
Abstract
外部刺激に対する細胞応答は、所定の瞬間に細胞表面で発現される受容体のセットに大きく依存する。したがって、表面発現受容体の集団は常に適応し、規制の厳格なメカニズムに従います。パラダイムの例と生物学で最も研究された人身売買イベントの一つは、グルタミン酸受容体(GluR)のシナプス発現の調節制御です。GluRsは、中枢神経系における興奮性神経伝達の大部分を媒介し、シナプスおよび神経レベル(例えば、シナプス可塑性)における生理活性依存的機能的および構造的変化を制御する。GLURを発現した表面の数、位置、およびサブユニット組成の変化は、神経機能に深く影響を及ぼし、実際には、これらの因子の変化は異なる神経因果関係に関連している。ここで提示される解離海馬原発性ニューロンにおけるGluR人身売買を研究する方法である。「抗体供給」アプローチは、表面および内部膜で発現されるGluR集団を差別的に可視化するために使用される。生細胞に表面受容体を標識し、異なる時間に固定して受容体のエンドサイトシスおよび/またはリサイクルを可能にすることで、これらの人身売買プロセスを評価し、選択的に研究することができます。これは、GluRの人身売買に影響を与える刺激および分子メカニズムに関する貴重な情報を得るために、薬理学的アプローチまたは改変された受容体の過剰発現と組み合わせて使用することができる汎用性の高いプロトコルです。同様に、他の受容体または表面発現タンパク質を研究するために容易に適合させることができる。
Introduction
細胞は、特定の細胞内局在度にタンパク質を動員し、その機能1に対して厳格な時空間調節を行うために、人身売買のアクティブなプロセスを利用する。異なる環境刺激に対する細胞応答は、受容体活性化によって引き起こされる細胞内カスケードに依存するように、このプロセスは、膜受容体にとって特に重要です。細胞は、受容体細胞内取引調節規則2を介して細胞表面で発現される受容体の密度、局在化、およびサブユニット組成を変化させることによって、これらの応答を修飾することができる。新たに合成された受容体を血漿膜に挿入し、既存の受容体のエンドサイトーシスおよびリサイクルと共に、表面発現受容体2のネットプールを決定する人身売買プロセスの例である。多くの分子機構は、タンパク質とタンパク質の相互作用やリン酸化、ユビキキテーション、またはパルミトイル化2などの翻訳後修飾を含むタンパク質の密売を調節するために協力する。
受容体の人身売買の調節は、高度に特殊化された構造を有する強い偏分細胞において特に必要とされる。パラダイムの例は、グルタミン酸受容体(GluR)3、4の規制された人身売買による神経機能の制御である。グルタミン酸は、主な興奮性神経伝達物質であり、シナプス神経伝達およびシナプス可塑性などの基本的な生理的神経機能を制御するために表面発現GluRを結合し、活性化する。変化したGluR人身売買が神経発達障害から神経変性疾患に至るまで、神経障害の広いスペクトルで観察されているという事実は、このプロセス5の重要性を強調している。したがって、GluRの人身売買を制御する分子事象を理解することは、研究の多くの分野で興味深い。
このプロトコルでは、抗体供給ベースの方法を使用して、一次海馬ニューロンにおける表面発現GLURのレベルを定量化し、内部化およびリサイクルの変化が観察された正味表面発現にどのように生じるかを評価する。特定の変異を持つ外因性受容体の薬理学および/または過剰発現の使用は、このプロトコルが異なる環境刺激に対するニューロン適応の基礎となる分子メカニズムを研究するための特に強力なアプローチになります。このプロトコルの有用性の最終的な例は、このようなモデルにおける表面発現の検査を通じて、環境の多因子変化(疾患モデルなど)がGluRの人身売買にどのように影響するかを調べている。
具体的な例を用いて、生理シナプス刺激を模倣する薬理学的操作[化学LTP(cLTP)]がAMPA型GluR(AMPA)の内因性GluA1サブユニットの表面発現を増加させる方法を最初に実証する。6.NMDA型GluR(NMA)のGluN2Bサブユニットの過剰発現リン模倣形態の人身売買も分析され、このプロトコルが特定の翻訳後のGluR人身売買の規制を研究するためにどのように使用できるかを示す。変更。これらの特定の例が使用されるが、このプロトコルは、抗原細胞外ドメインを有する他のGluRおよび他の受容体およびタンパク質に容易に適用することができる。細胞外ドメインに利用可能な抗体がない場合、細胞外エピトープタグ付き(例えば、フラグ、Myc-、GFPタグなど)タンパク質の過剰発現は、タンパク質標識を助けることができる。
現在のプロトコルは、特定のGluRサブタイプ密度を定量し、特定の抗体を使用して人身売買を行うための指示を提供する。このプロトコルは、1)総GluR表面発現、2)GluR内部化、および3)GluRリサイクルを研究するために利用することができる。各プロセスを個別に学習するには、セクション 1 と 2 から始め、セクション 3、4、または 5 のいずれかに進むことをお勧めします。いずれの場合も、セクション 6 と 8 (図1) で終了します。
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Protocol
海馬一次培養に関する研究は、ノースウェスタン大学動物ケア・使用委員会(プロトコル#IS00001151)によって検討され、承認されました。
1. ラベリング前の準備
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一次海馬培養の準備と維持
- ポリD-リジンコーティング(0.1 mg/mL)18mmカバーメガネでメッキされた150,000個の細胞の密度で一次海馬培養物を調製します。解離された神経培養製剤のための優れたガイドは7、8で利用可能です。
注:必要に応じて、培養物は、調製中のグリア増殖を避けるためにシトシンアラビノシド(Ara-C、DIV1から10mM)で処理することができる。
注:フィブロネクチン(1mg/mL)またはラミニン(5mg/mL)などの代替コーティング試薬は、ポリD-リジンの代わりに使用することができる。 - B27および2 mM L-グルタミンを補充した神経基性培地の2mL/ウェルで37°Cおよび5%CO2で細胞インキュベーターで培養を維持する。
注:L-グルタミンの代用品(例えば、グルタマックス)は、必要に応じて使用することができる。 - 毎週, メディアの半分のボリュームを削除し、補充された神経基性メディアの同じボリュームに置き換えます.
- ポリD-リジンコーティング(0.1 mg/mL)18mmカバーメガネでメッキされた150,000個の細胞の密度で一次海馬培養物を調製します。解離された神経培養製剤のための優れたガイドは7、8で利用可能です。
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オプション:変異および/またはエピトープタグ付き受容体のトランスフェクション
注:ニューロンは、受容体発現を可能にするために、分析時間ポイントの少なくとも3~4日前にトランスフェクトする必要があります。若いニューロン[日インビトロ6-9(DIV6-9)]の使用は、古い(DIV15-20)ニューロンよりも優れたトランスフェクション効率をもたらしますが、採用されたDIVに関係なく十分な数のトランスフェクション細胞(>20)を達成することができます。- 12ウェルプレートの各ウェルについて、B27またはグルタミン補充を伴わない新鮮な神経基性媒体の100 μLの目的の構築物を含むプラスミドの1.5 μgを微小遠心管で希釈し、迅速に渦を混ぜることによって混合する。
注:トランスフェクションを成功させるには、使用される神経基性媒体が可能な限り新鮮であり、理想的にはボトルの開封後1週間以内に行われることが重要です。 - 第2のマイクロ遠心管で、100μLの新鮮な神経基性媒体に適切なリポフェクション試薬の1 μLを混合し、穏やかに混合する。
注:リポフェクション試薬混合物を渦にしないでください。新鮮なリポフェクション試薬の使用は、トランスフェクション効率を向上させることができる。 - 室温(RT)で5分間チューブをインキュベートします。
- リポフェクション試薬混合物をDNA混合物に滴下して加え、穏やかに混合し、RTで20分間インキュベートする。
- 各ウェルのメディアの量を1 mLの条件付きメディアに調整します。
- リポフェクション試薬-DNA混合物をウェルに滴下して添加する。
- 細胞をインキュベーターに戻し、タンパク質発現を少なくとも3~4日許可する。
注:以下に概説する内部化およびリサイクルプロトコルの目的で、海馬ニューロンはDIV11-12でトランスフェクトされ、細胞外ドメイン(GFP-GluN2B)でGFPでタグ付けされたGluN2Bを発現する構成要素を用いてDIV15-16で画像化した。
- 12ウェルプレートの各ウェルについて、B27またはグルタミン補充を伴わない新鮮な神経基性媒体の100 μLの目的の構築物を含むプラスミドの1.5 μgを微小遠心管で希釈し、迅速に渦を混ぜることによって混合する。
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オプション:固定するまで条件付き培地中の薬物(慢性または急性)を用いた細胞のインキュベーション。
注:急性治療の場合は、標識する前に細胞の治療を開始してください。使用される薬物治療プロトコルに応じて、細胞はセクション2の間に薬物含有培養媒体で維持することができる。この例では、DIV21細胞は表面発現AMPAR9を増加させるためにcLTPプロトコルの対象となった。- 細胞外溶液(ECS)のための交換条件付き媒体。
- RTで3分間ECSで300 μMグリシンを有する細胞を治療する。コントロールとして、姉妹カバースリップをECSで扱います(グリシンなし)。
- 細胞を37°C ECSで3倍洗浄し、ECS(グリシンなし)で細胞を20分間細胞インキュベーターに戻し、セクション2を続行します。
注:ECS(mM):150 NaCl、2 CaCl 2、5 KCl、10 HEPES、30グルコース、0.001 TTX、0.01ストリキニン、およびpH 7.4で0.03ピクロトキシン。
2. 表面発現受容体のライブラベリング
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ラベル付け用のカバースリップの準備
- 試薬を節約し、操作を容易にするために、転写カバーはパラフィンフィルムで覆われた皿に細胞の側面を滑る。
注:サンプルを乾燥させないことは重要です。 - インキュベーションおよび洗浄ステップのための37 °Cで条件付き媒体を保存し、維持する。
注:18 mm カバースリップの場合は、抗体標識用のメディアの 75 ~ 100 μL と、内部化/リサイクル用の 120 ~150 μL のインキュベーションをお勧めします。
- 試薬を節約し、操作を容易にするために、転写カバーはパラフィンフィルムで覆われた皿に細胞の側面を滑る。
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一次抗体による表面受容体の標識
- RTで15分間条件付き培養培養剤で希釈した一次抗体を用いた細胞をインキュベートする。
注:GFPタグ付き受容体については、希釈1:1000のウサギ抗GFP抗体が用いられた。内因性GluA1については、1:200希釈時のマウス抗GluA1を用いて使用した。 - 真空ピペットを用いて抗体含有培体を慎重に吸引し、条件付き培養培具で細胞を3回洗浄する。
注:条件付き媒体が利用できない場合は、1 mM MgCl2および0.1mM CaCl2を含むPBS+[リン酸緩衝生理食べ物(PBS)]を用いてすべての洗浄工程を行ってもよい。マイクロピペットを用いた手動吸引は、穏やかな真空吸引が利用できない場合に行われてもよい。
- RTで15分間条件付き培養培養剤で希釈した一次抗体を用いた細胞をインキュベートする。
3. 表面表現(図2)
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表面発現受容体の二次抗体標識
- PBS+で一度洗います。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)と4%のショ糖をPBSで7~8分間インキュベートして細胞を固定します。
注:メタノールインキュベーションなどの他の固定方法とは異なり、PFAはプラズマ膜を透過しないため、表面発現解析に適しています。最適な結果を出すには、作りたてのPFAを使用してください。-20 °Cでの4°Cまたは長期(30日まで)の貯蔵のPFAの短期貯蔵は十分な固定のために許容される。
注意:PFAは既知の発癌物質である。取り扱い時には、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。 - 通常のPBSで細胞を3回洗浄する。
注:あるいは、0.1 Mグリシンは、PBSの代わりにPFAを洗浄するために使用することができ、グリシンは、調製中の背景を増加させる可能性のある残りの固定剤をクエンチする。 - RTで30分間PBSで10%正常なヤギ血清(NGS)をインキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックする。
注:ブロッキング時間は、ラベリングに悪影響を及ぼすことなく延長することができます。 - 蛍光タグ付き二次抗体をRTで1時間PBSで3%NGSで希釈してインキュベートし、一次抗体標識受容体(すなわち、表面発現)を標識する。
注:これらの実施例では、Alexa 555-共役二次抗体の1:500希釈:GFP標識受容体に対するヤギの抗ウサギおよびGluA1用ヤギ抗マウスが用いられた。 - PBS 3xで細胞を洗浄します。
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細胞内受容体の標識
- RTで5〜10分間PBSで0.25%トリトンX-100で細胞を透過化します。
注:抗体標識の最初のラウンドがすべての表面エピトープを占めていることを確認するために、この透過化ステップは姉妹培養においてスキップすることができる。この場合、細胞内受容体に対するシグナルは得られるべきではない。さらに、前項2(すなわち、培養中の血漿膜の完全性を示す)で内部受容体が標識されていないことを確認するために、透過化工程は姉妹培養においてスキップすることができ、かつ一次抗体を、細胞内タンパク質(例えば、PSD-95またはMAP2)は、ステップ2.2.1で利用することができる。これらの条件下では、このプライマリからシグナルを取得しないでください。この場合、ウサギ抗PSD-95抗体(1:500)を用いた。 - RTで30分間PBSで10%のNGSでブロックします。
- セクション2.2で使用されるのと同じ一次抗体を用いて透過性細胞をインキュベートすることにより細胞内受容体を標識し、RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した。
注:細胞内受容体を標識するための抗体希釈は、表面発現受容体の標識に必要とされるものと異なっていてもよい。GluA1の例では、同じ抗体希釈(1:200)が用いられた。 - PBSで細胞を3倍洗う。
- RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した第2の蛍光タグ付き二次抗体を有する標識。
注:これらの実施例では、ヤギの抗マウスAlexa 647結合二次抗体(GluA1用)の1:500希釈が用いられた。 - PBSで細胞を3倍洗う。
- RTで5〜10分間PBSで0.25%トリトンX-100で細胞を透過化します。
4. 内部化 (図3)
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抗体標識表面受容体の内部化
- 表面発現受容体および抗体洗浄(セクション2.2)の標識後、抗体なしで条件付き培地中の細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にする。
注:NMDA受容体の場合、内部化のために30分が推奨される。対照として、姉妹培養は、内部化プロセス中に4°Cで条件付き培養媒体で維持されてもよい。最小限の受容体の内部化は、これらの条件下で発生する必要があります。.
- 表面発現受容体および抗体洗浄(セクション2.2)の標識後、抗体なしで条件付き培地中の細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にする。
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表面受容体の標識
- PBS+で細胞を一度洗います。
- PBSで4%のPFAと4%のショ糖を7~8分間固定します。
注意:PFAを取り扱う際には、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。 - 通常のPBSで細胞を3倍洗います。
- 非特異的結合を防ぐためにRTで30分間PBSで10%のNGSをブロックします。
- 蛍光タグ付き二次抗体を有するサンプルを、RTで1時間PBSで3%NGSで希釈して、一次抗体標識受容体(すなわち、内部化されなかった表面発現受容体)を標識する。
注:この例では、Alexa 555-共役ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500)を標識に用いた。 - PBSで細胞を3倍洗う。
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内在性受容体の標識
- PBSで0.25%トリトンX-100で細胞を透過性5〜10分間。
- RTで30分間PBSで10%のNGSを持つインキュベーションによる非特異的結合をブロックする。
- RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した蛍光タグ付き二次抗体を用いたサンプルをインキュベートし、内在抗体標識受容体を標識する。
注:この例では、Alexa 647結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500)が標識に使用されます。 - PBSで細胞を3倍洗う。
5. リサイクル (図4)
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抗体標識表面受容体の内部化
- 表面発現受容体および抗体洗浄(セクション2.2)の標識後、抗体なしで条件付き培地中の細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にする。
注:NMDA受容体の場合、内部化のために30分が推奨される。
- 表面発現受容体および抗体洗浄(セクション2.2)の標識後、抗体なしで条件付き培地中の細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にする。
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安定な表面発現受容体の遮断
- 内部化されていない表面発現受容体に付着した一次抗体上のエピトープを遮断するには、非結合Fab抗IgG(H+L)抗体断片(セクション2.2で使用される一次に対して)を有する細胞をインキュベートし、条件付き培地(条件付き培地で希釈)RTで20分の20 μg/mL)。この治療は、二次抗体との将来の相互作用を防ぎます。
注:この例では、ヤギの抗ウサギファブ断片が使用された。
注:対照実験:表面発現受容体の完全な遮断が起こったことを確実にするために、姉妹カバースリップはFabの有無にかかわらずインキュベートすることができる。培養はFab処理の直後に固定されるべきであり、両方の培養物はAlexa 555結合二次抗体でインキュベートされる。Fabインキュベート細胞におけるAlexa 555シグナルは、適切な抗体ブロッキングを示さない。 - 条件付き培養物で細胞を3倍洗う。
- 80 μMダイナソーレを含む条件付き培養培養培養培養で細胞をインキュベートし、細胞のさらなる内部化を防止し、細胞をインキュベーター(37°C)に戻し、内部化された受容体のリサイクルを可能にします。ダイナソールは、ダイナミンを阻害し、したがって、内部化を防ぐGTPase阻害剤です。
注:NMDARリサイクルのために45分をお勧めします。Dynasore は、ダイナミン依存の内部化プロセス (NMDD の内部化など) を排他的にブロックします。しかし、他のシナプスタンパク質(ダイナミン非依存)の内部化は、ダイナソーレの存在下で依然として起こり得る。
- 内部化されていない表面発現受容体に付着した一次抗体上のエピトープを遮断するには、非結合Fab抗IgG(H+L)抗体断片(セクション2.2で使用される一次に対して)を有する細胞をインキュベートし、条件付き培地(条件付き培地で希釈)RTで20分の20 μg/mL)。この治療は、二次抗体との将来の相互作用を防ぎます。
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リサイクル受容体の標識
- PBS+で細胞を一度洗います。
- PBSで4%のPFAと4%のショ糖を7~8分間固定します。
注意:PFAを取り扱う際には、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。 - PBSで細胞を3倍洗う。
- 非特異的結合を防ぐためにRTで30分間PBSで10%のNGSをブロックします。
- RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した最初の蛍光タグ付き二次抗体を有する標識細胞。
注:この例では、Alexa 555-共役ヤギ抗ウサギ抗体(1:500)を標識に使用した。 - PBSで細胞を3倍洗う。
注:PBS(5-10分)で長い洗浄は、準備の背景を減らすのに役立ちます。
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内在性受容体の標識
- PBSで0.25%トリトンX-100で細胞を透過性5〜10分間。
- RTで30分間PBSで10%のNGSでブロックします。
- RTで1時間PBSで3%NGSで希釈した第2の蛍光タグ付き二次抗体を有する標識。
注:この例では、Alexa 647結合ヤギ抗ウサギ抗体(1:500)を標識に使用した。 - PBSで細胞を3倍洗う。
6. サンプルの取り付けとイメージング
- 適切な取り付け媒体の12-15 mLにセル側を静かに置くことによって細胞を取り付ける。
注:過剰な取り付けメディアの吸引は、画像の品質を向上させます。 - 適切な共焦点顕微鏡上の画像細胞。
注:ニューロンの厚さ全体を含む、0.35 μm ステップで 60 倍の倍率で Z スタックを画像化することをお勧めします。
7. 時間に関する考慮事項
- これは、いくつかの点で停止できる長いプロトコルです。必要に応じて、湿気のあるチャンバ内で4°Cで一晩ブロッキングおよび一次抗体インキュベーションステップを行う。
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あるいは、必要に応じて、マイクロ波組織プロセッサを使用して、固定後のインキュベーション時間を大幅に短縮します。すべてのステップで、「オン」設定のために30°Cで150 Wを使用してください。
- ブロックするには、プロセッサを2分「オン」、1分「オフ」、2分「オン」で実行します。
- 一次および二次抗体のインキュベーションステップの場合は、プロセッサを3分「オン」、2分「オフ」、3分「オン」で実行します。
注:上記の変更をプロトコルに加えることで、品質に違いはありません。
8. 画像解析
- 複数のファイル形式と互換性があるため、画像解析を行うには、FIJI
- マクロ スクリプトは、FIJI によって事前に選択された異なるパラメータを簡単にバッチ定量化するために用意されています。マクロには、次の手順が含まれています。
注:これらの例では、「集積強度」を測定した。 - FIJI と別々のチャネルでイメージ ファイルを開きます。
- Z は、各チャネル スタックを最大強度投影として投影します。
- 各チャネルのしきい値を下げる設定を行います。
注:しきい値は、実験データセットごとに経験的に決定する必要があります。各チャネルは個別の低いしきい値を持つことができますが、同じデータ・セットのすべてのイメージについてチャネルしきい値を一貫して維持できることが重要です。 - 3 ~ 5 個のセカンダリ デンドライトまたは三次デンドライトを選択し、対象地域 (ROI) として保存します。
- 表面および細胞内チャネルにおける各ROIの統合密度を測定します。
- 表面チャネルの統合密度値を細胞内チャネルで割ることによって、各ROIの信号を正規化します。
- すべての制御および実験画像の測定を繰り返し、実験値を正規化して値を制御します(GluN2B WTまたは非グリシン条件)。
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Representative Results
グルタミン酸受容体の密売を研究するこのプロトコルは、細胞表面で発現される受容体と内部膜で発現される受容体の差分標識に基づいている。分離は、膜透過前後の受容体を標識することによって達成され、同じ一次抗体を用いて、異なるフルオロフォアに結合した二次抗体を用いる。プロトコルを含むオプションの手順で概説されているように、これは内部化やリサイクルなどの異なる受容体の人身売買プロセスを尋問するための非常に汎用性の高い方法であり、研究者のニーズに簡単に適応することができます(図1).
まず、神経表面で発現する受容体の定量化方法が提供される。このプロトコルは、基底表面発現の定量化を可能にするだけでなく、異なる薬物または突然変異が表面発現受容体の基底レベルを変化させる分子機構を研究する。表面発現受容体は、透過化前に一次抗体と二次抗体の両方をインキュベートすることによって最初に標識された。0.25%トリトンX-100で透過化した後、受容体の細胞内プールは抗体標識のためにアクセス可能である。このプロトコルを例示するために、対照培養におけるAMPA受容体(AMPA)の表面対細胞内染色(ampA)およびcLTP誘導後に行った。具体的には、AMPARのGluA1サブユニットにおける細胞外エピトープに対する抗体を用いて生細胞を標識し、その後、Alexa 555-共役二次に標識した細胞を固定した。その後、細胞を透過化し、同じ抗AMPAR抗体で標識し、Alexa 647に結合した二次抗体でインキュベートした。このデュアルラベリングにより、2つのGluA1母集団を明確に可視化できます。
共焦点画像を獲得した後、蛍光シグナルを容易に定量し、cLTP(図2A、B)に続いて、細胞内集団に対する表面発現の増加を示すことができる。対照として、パーメバイゼーション工程を姉妹カバースリップでスキップ(0.25%トリトンX-100のインキュベーション)し、駆除シナプスの標準的な細胞内マーカーであるPSD-95に対して一次抗体を使用した。図2Cに示すように、非透過性細胞ではPSD-95に対するシグナルは得られないため、血漿膜の完全性を実証する。これは、「表面GluA1」のために得られたシグナルが実際に表面発現受容体に対応していることを示している(すなわち、表面発現GluA1に対するシグナルは細胞内受容体を含まない)。重要なことに、「内部化GluA1」の最小シグナルは、非透過化条件下で観察することができ、すべての表面エピトープが抗体標識の最初のラウンドによって占有されていることを示す(すなわち、細胞内GluA1のためのシグナルは含まれていない)表面発現受容体)。
このプロトコルを利用して調べることができる第2のプロセスは、表面発現受容体の内部化である。具体的には、表面受容体は生細胞上に標識され、ニューロンは、クラトリン媒介性エンドサイトーシスによって受容体の内部化を受けるために、一定の時間の間インキュベーターに戻されます。このステップに続いて、細胞は、一次抗体標識受容体(すなわち、表面発現および内部化された受容体)の空間発現を維持するために固定される。そして、表面受容体(すなわち、目的の期間に内部化されていないもの)は、透過化前に二次抗体で標識される。透過化に続いて、内部化された受容体は、異なるフルオロフォアを有する二次抗体によって標識される。
このプロトコルでは、NMDARのGluN2BサブユニットのPDZリガンド内の特定のリン酸化(S1480)がNMDAR内部化を誘導する方法を調べた。これを行うために、一次培養物はリン模倣受容体をトランスフェクトし、そこでセリン(S1480)はグルタミン酸(E)によって置換された。得生の変異体であるGluN2B S1480Eは、GluN2Bの「構成的にリン酸化された」形態として作用する。GluN2Bの標識を容易にし、リン模倣変異体を同定するために、GFPはGluN2B(GFP-GluN2B S1480E)の細胞外側のエピトープタグとして使用した。生細胞上の表面受容体をRTで15分間抗GFP抗体で標識した。次に、過剰な抗体を条件付き培養培養剤で洗浄し、細胞を30分間37°Cに戻し、エンドサイトアシスを可能にした。次いで、細胞を凍結受容体運動に固定した。表面に残った受容体は、透過化前にAlexa 555-共役二次抗体で標識した。
30分のインキュベーション期間中に内部化された受容体を同定するために、細胞を透過化し、内部化された受容体(既に一次抗体で標識されている)をAlexa 647-共役抗体で標識した。繰り返しますが、この二重標識戦略は、内部化された受容体の割合の定量を可能にします。この例では、S1480におけるGluN2Bリン酸化が受容体の内部化を促進することを強調し、リン模倣変異体S1480EはWT受容体と比較してはるかに高い内部化比を示した(図3A、B)。対照として、4°Cの姉妹培養は、プロセスを強く遅くするために内部化中に条件付き媒体で維持された。予想通り、これらの条件下で「内部化された」受容体に対するシグナルは得られなかった(図3C)。
最後に、このプロトコルは、以前に内部化された受容体のリサイクルを調べるために利用することができる。このプロトコルの変動は、これらの受容体を細胞表面に戻すことによって、内部化プロトコルの継続である。このバリエーションには、2 つの重要なコンポーネントがあります。第一に、プロトコル全体の間に表面で安定的に発現した受容体(すなわち、内部化またはリサイクルされなかった受容体)は、リサイクルされた受容体と間違われないように「ブロック」されなければならない。これを行うには、リサイクルステップを実行する前に、生きているニューロンは、蛍光蛍光結合二次のさらなる結合を防ぐために表面に発現される一次抗体標識受容体と相互作用する高濃度のFabでインキュベートされる。抗体。第二に、リサイクル段階で内部化を防止し、リサイクルされた受容体が内部化を繰り返さないようにする必要があります。これは、この薬剤がNMDARの内部化などのクラトリン媒介性エンドサイトーシスなどのダイナミンに依存するプロセスをブロックするリサイクル中にメディアにダイナソーを追加することによって行われました。このプロトコルでは、前述のように30分間の内部化を可能にした生細胞上のGFP-GluN2Bの表面標識と同様に、リン模倣変異体GluN2B S1480Eの人身売買を研究した。
これに続いて、この期間中に内部化されなかった表面受容体は、RTで20分間Fabで細胞をインキュベートすることによって遮断された。次に、細胞を再度37°Cで45分間インキュベートし、以前に内部化されたGluN2Bを細胞表面にリサイクルできるようにした。ダイナソールは、リサイクルステップ中にメディアに存在していました。このステップに続く細胞の固定は、リサイクルされた受容体(すなわち、細胞表面にブロック解除され、発現されたもの)および内部化された受容体(すなわち、標識された一次抗体および細胞内であるもの)の同定を可能にする。1)透過化前にAlexa 555-共役二次抗体を用いてリサイクルされた受容体を標識し、2)内在化したが、リサイクルされていない、Alexa 647結合二次抗体を有する受容体を有する受容体は、リサイクル比が生成されたことを示す。GluN2B S1480E は NMDAR リサイクルに影響を与えません (図 4A,B)。対照として、Fabの有無において姉妹カバーリップをインキュベートすることによって表面発現受容体の完全な遮断が起こり、続いてPFA固定が行われることが保証された。図4Cに示すように、Fabブロッキングがない場合に表面発現GluN2Bに対して強いシグナルが観察されうる。このシグナルはFab処理培養培養において消失し、ブロッキングプロトコルが表面発現エピトープを完全に遮断するのに十分であり、リサイクル後に観察される表面信号が実際に取引された受容体に対応していることを示している。プラズマ膜。
図1:受容体表面発現、受容体内在化(エンドサイトーシス)、および受容体リサイクルを研究するためのプロトコルバリエーションの概略図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: cLTP は GluA1 の表面発現を増加させます。DIV21における一次海馬ニューロンは、グリシン含有ECSをインキュベートすることにより化学LTP(cLTP)を行った。表面発現(赤)と細胞内(青)GluA1母集団の明確な標識は、AMPARの表面発現の予想される増加を明らかにする。(A)単一平面と(B) Z 積み上げ (最大強度投影) 共焦点画像。スケールバー = 50 μm (セル全体) または 5 μm (デンドライト)グラフは、cLTPプロトコル後のGluA1の表面発現の増加を示す。表面発現指数:表面/細胞内受容体(n=3;細胞数:con= 7;cLTP=7;値は、マンホイットニーU検定を用いた平均±SEM;****p<0.0001を表す)。(C)透過化工程をスキップした制御実験。表面および内部GluA1に加えて、細胞内興奮性シナプスマーカーPSD-95を評価した。スケールバー = 50 μm (セル全体) または 5 μm (デンドライト)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:S1480におけるGluN2Bのリン酸化は、NMDARの内部化を促進する。一次海馬ニューロンは、DIV11-12上のGFP-GluN2B WTまたはリン模倣変異体GFP-GluN2B S1480Eのいずれかでトランスフェクトされた。タンパク質発現の3〜4日後、表面GFPをウサギの抗GFP抗体を有する生細胞に標識し、細胞を37°Cに戻し、エンドサイトス症による受容体の内部化を可能にした。表面発現外因性受容体は、Alexa 555結合二次抗体で可視化し、Alexa 647-共役抗体を用いて透過化後に同定された内部化集団を用いた。明瞭さのために、表面GFP-GluN2Bは緑色で擬似着色され、内部化されたGFP-GluN2Bは白で擬似着色される。(A)単一平面と(B) Z 積み上げ (最大強度投影) 共焦点画像。スケールバー = 50 μm (セル全体) または 5 μm (デンドライト)グラフは、リン模倣変異体GluN2B S1480Eによって表示される高められた内部化を示す。内部化指数: 内部化された受容体/表面発現受容体 (n = 6; 細胞数: WT = 34;S1480E = 28;値は平均 ± SEM を表します。p < 0.001 マン・ホイットニーU検定を使用)。(C)内在工程(Intenaliz.)を4°Cで行った対照実験。スケールバー = 50 μm (セル全体) または 5 μm (デンドライト)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:S1480におけるGluN2Bのリン酸化は、NMDARリサイクルを修飾しない。一次海馬ニューロンは、図3に示すように、DIV11-12上のGFP-GluN2B WTまたはリン模倣変異体GFP-GluN2B S1480Eのいずれかでトランスフェクトされた。タンパク質発現の3〜4日後、表面GFPをウサギの抗GFP抗体を有する生細胞に標識し、細胞を37°Cに戻し、エンドサイトス症による受容体の内部化を可能にした。残りの表面発現受容体はFabインキュベーションによって遮断され、リサイクルは45分間許可された。Alexa 647-共役抗体を用いて透過化後に同定された集団。明瞭さのために、表面GFP-GluN2Bは白で擬似着色され、内部化されたGFP-GluN2Bは緑色で擬似着色される。 (A) 単一平面と (B) Z 積み上げ (最大強度投影) 共焦点画像。スケールバー = 50 μm (セル全体) または 5 μm (デンドライト)グラフは、GluN2B S1480リン酸化がリサイクルに及ぼす影響の欠如を示す。リサイクル指数: リサイクルされた受容体/内部化された受容体 (n = 5; 細胞数: WT = 27;S1480E = 24;値は平均 ± SEM を表します。n.s. = マン・ホイットニーU検定を用いて有意でない)。(C)表面発現エピトープを遮断するFabインキュベーションステップをスキップした制御実験。スケールバー = 50 μm (セル全体) または 5 μm (デンドライト)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細胞とその環境との相互作用(例えば、他の細胞との通信、異なる刺激への応答など)は、細胞表面における受容体の正しい発現に大きく依存する。表面発現受容体含有量の迅速かつ微調整された調節は絶えず変化する環境への適切な細胞応答を可能にする。ニューロンの特定のケースでは、シナプス発現受容体の数、局在化、およびサブユニット組成の変化は、シナプス伝達、シナプス可塑性、シナプス形成、シナプス剪定3に大きく影響します。 5,10.したがって、受容体表面発現の正確な分析とその調節の根底にあるメカニズムは、研究の重要なトピックである。
受容体表面発現を研究できるモダリティの数が存在する。一般に、これらは、(i)表面発現受容体集団の生化学的単離、(ii)表面における受容体を可視化するイメージング技術、および(iii)受容体の結果を監視する機能的手法の3つの主要なカテゴリーに分類される。活性 化。これらのアプローチは相補的であり、受容体の表面発現に関する特定の質問に答えるために組み合わせて利用することができる。
表面発現受容体の生化学的単離の例としては、培養細胞または脳スライスにおける生体化プロトコルおよび培養細胞または組織11の細胞分画が挙げられる。表面ビオチン化は、エステル活性化ビオチンで培養物をインキュベートすることにより、ビオチンを使用した表面発現受容体の標識に基づいている。エステル基は、一次アミノ基(-NH2)と反応して安定したアミド結合を形成する。この試薬は細胞不透過性であるため、表面発現タンパク質のみがビオチンで標識されます。洗剤を用いた細胞分解後、標識受容体は、アビジンまたはビオチンに強い親和性を有するアガローゼビーズを用いて細胞リサートをインキュベートして回収し、次いで免疫ブロッティングにより評価することができる。細胞内分画は、いくつかの遠心分離ステップを使用して、その異なる密度12に基づいて異なる細胞膜区画を単離する生化学的プロトコルである。どちらの技術も、内因性タンパク質の表面発現の変化を定量化するのに有用であり、薬理学的アプローチ(生体内および培養中)と組み合わせて、分子操作が表面発現に与える影響を決定するために使用することができる。受容体の。標準に対する複数の内因性受容体の変化を同時に定量することができるので、それらは特に有用である。しかし、このプロトコルで説明されているようなイメージングモダリティとは異なり、空間分解能はサンプルの生化学的処理によって失われます。
ここで説明するプロトコルは、イメージング技術カテゴリに属する。このアプローチのグループ(蛍光的にタグ付けされた過剰発現タンパク質の表面標識および生細胞イメージングなど)は、受容体の表面発現に時空間分解能を与えるのに有用である。例えば、前述のようにAMPARの表面対細胞内発現を調べることで、デンドライト(この特定のアプリケーションに対する関心のある生物学的区画)における発現の変化がどのように顕著であるかを調べることができる。生化学的分画と同様に、薬物は、表面発現に対する薬物の影響を決定するためにイメージング技術と共に使用することができる。さらに、修飾(変異またはタグ)を含む受容体を有するニューロンのトランスフェクションは、イメージングの可能性をさらに詳しく説明する。変異型受容体によるトランスフェクションは、表面発現に対する特定の変異の影響を線引きすることができる。
受容体の人身売買を可視化するもう一つの有用なアプローチは、蛍光タグ付き構造体を有する一次培養物のトランスフェクション後のライブイメージング顕微鏡検査である。SEPタグ付き受容体は、この蛍光色素が細胞外培地にさらされた場合にのみ蛍光を発するため、表面発現受容体の研究に特に有用である。前の実施例と同様に、薬理学的アプローチを使用することができ、または受容体に対して行われる変異は、これらが受容体の表面発現特性を変化させるかどうかを決定する。薬物の場合、生細胞イメージングを使用して、表面発現の改変をリアルタイムで監視することができます。ライブイメージングの限界は、表面発現の変化に対する機械的洞察の欠如である。例えば、表面発現の低下は、受容体の内部化の増加、受容体のリサイクルの減少、またはその両方の結果である可能性があります。
この質問に答えるために、上記のプロトコルを使用してもよい。ライブイメージングアプローチを使用して監視することができるもう一つの重要な人身売買イベントは、血漿膜内の異なるコンパートメント間の受容体の横拡散(例えば、シナプス部位とシナプス部位の間)である。この場合、選択する技術は、蛍光半導体ナノ結晶[すなわち、量子ドット(QD)]が目的のタンパク質上の細胞外エピトープに対する抗体に付着する単粒子トラッキングアプローチの使用である。QDsは、顕著な安定性(従来の蛍光タンパク質よりもはるかに少ない光漂白を可能にする)、強い明るさ、およびオン/オフ状態間の交互(「点滅」)によって特徴付けられます。適切な顕微鏡設定を使用することにより、細胞血漿膜14を介して単一のQD(および、したがって、目的の単一タンパク質)の動きを追跡することができる。
現在のプロトコルは、表面集団、内部化された集団、およびリサイクル集団の受容体の検査を提供し、これらのプロセスが全表面発現を制御する方法を決定する比率の計算を可能にする。さらに、異なるタイムポイントで内部化またはリサイクルプロセスを停止すると、時間的な解決が追加されます。したがって、この方法は、時空間表面発現研究を可能にする。他の撮像技術とは異なり、内因性表面発現のレベル(例えば、AMPAR)は、受容体の細胞外部分に対する抗体が存在する場合に関しても研究することができる。しかし、この方法では細胞の固定が必要なため、生細胞イメージングと互換性がないため、リアルタイムの情報を提供できません。
最後に、電気生理学15またはカルシウムイメージング16のような機能的アプローチは強力であるが、しばしば間接的であるが、受容体の表面発現を研究するマナーである。これらの方法は、受容体活性化後の細胞における機能的変化の定量化(例えば、膜電位またはカルシウム濃度の変化)に基づいている。これらの方法は、薬物学を用いて所定の受容体の応答を単離し、細胞表面で発現する受容体を正確かつ時空間的な方法で推定することを可能にする。これらの方法は汎用性が高く、培養中およびより多くの生理学的条件で生体(例えば、急性脳スライス)および生体内での細胞の研究を可能にする。しかし、ライブイメージングアプローチの場合と同様に、機能的アプローチを使用する場合、機械的な情報が欠落することがよくあります。
要約すると、受容体表面発現を研究する技術の組み合わせを用いて、表面発現がどのように制御されるかを完全に理解することができる。ここで提示されるプロトコルは、解離された一次培養における受容体の時空間表面発現の機械的理解を提供するので、特に強力である。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
我々は、ニコンA1共焦点顕微鏡の使用と実験の計画と分析における彼らの支援のためのノースウェスタン先端顕微鏡センターに感謝します。本研究は、NIGMS(T32GM008061)(A.M.C.)、NIA(R00AG041225)、および脳行動研究財団(#24133)のNARSAD若手研究者助成金(A. S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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