Denne artikkelen presenterer en metode for å studere glutamat reseptor (GluR) smugling i dissosiert primære hippocampus kulturer. Ved hjelp av en antistoff-fôring tilnærming til etiketten endogene eller overexpressed reseptorer i kombinasjon med farmakologiske tilnærminger, gjør denne metoden for identifisering av molekylære mekanismer som regulerer GluR overflate uttrykk ved modulerende internalisering eller resirkulerings prosesser.
Cellular svar på eksterne stimuli tungt stole på settet av reseptorer uttrykt på celleoverflaten på et gitt tidspunkt. Følgelig er befolkningen i overflaten-uttrykt reseptorer stadig tilpasning og underlagt strenge mekanismer for regulering. Paradigmatiske eksempel og en av de mest studerte menneskehandel hendelser i biologi er regulert kontroll av Synaptic uttrykk for glutamat reseptorer (GluRs). GluRs megle det store flertallet av eksitatoriske neurotransmission i sentralnervesystemet og kontrollere fysiologiske aktivitets avhengige funksjonelle og strukturelle endringer på Synaptic og neuronal nivåer (f. eks Synaptic plastisitet). Modifikasjoner i antall, plassering, og delenhet sammensetning av overflaten uttrykt GluRs dypt påvirke neuronal funksjon og, faktisk, endringer i disse faktorene er forbundet med ulike nevropatier. Presentert her er en metode for å studere GluR smugling i dissosiert hippocampus primære neurons. En “antistoff-fôring” tilnærming brukes til å differensielt visualisere GluR populasjoner uttrykt på overflaten og interne membraner. Ved å merke overflaten reseptorer på levende celler og fikse dem på ulike tidspunkter for å tillate reseptorer endocytose og/eller resirkulering, disse menneskehandel prosesser kan evalueres og selektivt studert. Dette er en allsidig protokoll som kan brukes i kombinasjon med farmakologiske tilnærminger eller overuttrykte av endrede reseptorer for å få verdifull informasjon om stimuli og molekylære mekanismer som påvirker GluR smugling. På samme måte kan det lett tilpasses til å studere andre reseptorer eller overflate uttrykt proteiner.
Celler utnytte den aktive prosessen med menneskehandel å mobilisere proteiner til bestemte subcellulære lokaliseringer og utøve streng spatiotemporal regulering over deres funksjon1. Denne prosessen er spesielt viktig for transmembrane reseptorer, som cellulære svar på ulike miljømessige stimuli stole på intracellulære kaskader utløst av reseptor aktivering. Celler er i stand til å endre disse svarene ved å endre tettheten, lokalisering, og delenhet sammensetning av reseptorer uttrykt på celleoverflaten via reseptor subcellulære smugling regulering2. Innsetting av nylig synthetized reseptorer i plasma membranen, sammen med endocytose og resirkulering av eksisterende reseptorer er eksempler på menneskehandel prosesser som bestemmer netto pool av overflate-uttrykt reseptorer2. Mange molekylære mekanismer samarbeider for å regulere protein smugling, inkludert protein-protein interaksjoner og posttranslational modifikasjoner som fosforylering, ubiqitinering, eller palmitoylation2.
Regulering av reseptor smugling er spesielt nødvendig i sterkt polarisert celler med høyt spesialiserte strukturer. Paradigmatiske eksempel er kontroll av neuronal funksjon av regulert smugling av glutamat reseptorer (GluRs)3,4. Glutamat, den viktigste eksitatoriske signalstoff, binder og aktiverer overflate-uttrykt GluRs å kontrollere fundamentale fysiologiske neuronal funksjoner som Synaptic neurotransmission og Synaptic plastisitet. Det faktum at endret GluR smugling har blitt observert i et bredt spekter av nevropatier, alt fra neurodevelopmental lidelser til nevrodegenerative sykdommer, fremhever viktigheten av denne prosessen5. Dermed forstå den molekylære hendelser som kontrollerer GluR smugling er av interesse i mange områder av forskningen.
I denne protokollen brukes et antistoff-basert metode for å kvantifisere nivået av overflaten-uttrykt GluRs i primære hippocampus neurons samt vurdere hvordan endringer i internalisering og resirkulering resultere i observert netto overflate uttrykk. Bruk av farmakologi og/eller overuttrykte av eksogene reseptorer harboring spesifikke mutasjoner gjør denne protokollen en spesielt kraftfull tilnærming for å studere molekylære mekanismer underliggende neuronal tilpasning til ulike miljømessige stimuli. Et siste eksempel på nytten av denne protokollen er å studere hvordan multifaktoriell endringer i miljøet (for eksempel i en sykdom modeller) påvirker GluR smugling gjennom undersøkelse av overflate uttrykk i slike modeller.
Ved hjelp av konkrete eksempler, er det i utgangspunktet demonstrert hvordan en Pharmacologic manipulasjon etterligne fysiologiske Synaptic stimulering [kjemiske LTP (cLTP)] øker overflaten uttrykk for den endogene GluA1 delenhet av AMPA-type GluRs (AMPARs) 6. smugling av en overexpressed fosfat-mimetisk form av GluN2B delenhet av NMDA-type GluRs (NMDARs) er også analysert for å eksempler på hvordan denne protokollen kan brukes til å studere regulering av GluR smugling av bestemte posttranslational Endringer. Selv om disse konkrete eksemplene brukes, kan denne protokollen enkelt brukes på andre GluRs og andre reseptorer og proteiner som besitter antigen ekstracellulære domener. I tilfelle at det ikke er antistoffer tilgjengelig for ekstracellulære domener, overuttrykte av ekstracellulære epitope-merket (for eksempel Flag-, myC-, GFP-Tagged, etc.) proteiner kan bistå i protein merking.
Den gjeldende protokollen gir instruksjoner for kvantifisere spesifikk GluR under type tetthet og smugling ved hjelp av spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan benyttes til å studere 1) totalt GluR overflate uttrykk, 2) GluR internalisering, og 3) GluR resirkulering. For å studere hver enkelt prosess individuelt, anbefales det å begynne med avsnitt 1 og 2 og fortsette med enten del 3, 4 eller 5. I alle tilfeller, avslutt med avsnittene 6 og 8 (figur 1).
Samspillet mellom en celle og dens miljø (f. eks, kommunikasjon med andre celler, respons på ulike stimuli, etc.), tungt avhengig av riktig uttrykk for reseptorer på celleoverflaten. Den raske og finjusterte reguleringen i overflate-uttrykt reseptor innhold muliggjør riktig cellulær respons på et stadig skiftende miljø. I det spesielle tilfelle av neurons, endringer i antall, lokalisering, og delenhet sammensetning av synaptically uttrykt reseptorer sterkt påvirkninger Synaptic kommunikasjon, Synaptic plastisitet…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Northwestern Center for Advanced mikroskopi for bruk av Nikon a1 Konfokalmikroskopi mikroskop og deres bistand i planlegging og analyse av eksperimenter. Denne forskningen ble støttet av NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), og NIA (R00AG041225) og en NARSAD unge etterforsker Grant fra Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
Dynasore | Tocris | 2897 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glycine | Tocris | 0219 | |
Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
HEPES | Sigma | H7006 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
NaCl | Sigma | S6546 | |
Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
NGS | Abcam | Ab7481 | |
Parafilm | Bemis | PM999 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
Strychnine | Tocris | 2785 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
TTX | Tocris | 1078 |