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Neuroscience

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Published: August 2, 2019 doi: 10.3791/59982
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

Summary

Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Abstract

Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull'insieme di recettori espressi sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, la popolazione di recettori espressi in superficie è costantemente adattandosi e soggetta a rigidi meccanismi di regolazione. L'esempio paradigmatico e uno degli eventi di traffico più studiati in biologia è il controllo regolato dell'espressione sinaptica dei recettori del glutammato (GluRs). I GluR mediano la stragrande maggioranza della neurotrasmissione eccitatoria nel sistema nervoso centrale e controllano i cambiamenti funzionali e strutturali dipendenti dall'attività fisiologica a livello sinaptico e neuronale (ad esempio, plasticità sinaptica). Le modifiche nel numero, posizione, e la composizione delle sottounità di superficie espressi GluRs influenzano profondamente la funzione neuronale e, infatti, le alterazioni in questi fattori sono associate a diverse neuropatie. Presentato qui è un metodo per studiare il traffico di GluR nei neuroni primari ippocampali dissociati. Un approccio di "alimentazione anticorpale" viene utilizzato per visualizzare in modo differenziale le popolazioni di GluR espresse nelle membrane superficiali e interne. Etichettando i recettori di superficie sulle cellule vive e fissandoli in momenti diversi per consentire l'endocitosi e/o il riciclaggio dei recettori, questi processi di traffico possono essere valutati e studiati in modo selettivo. Questo è un protocollo versatile che può essere utilizzato in combinazione con approcci farmacologici o sovraespressione di recettori alterati per ottenere informazioni preziose sugli stimoli e sui meccanismi molecolari che influenzano il traffico di GluR. Allo stesso modo, può essere facilmente adattato per studiare altri recettori o proteine espresse dalla superficie.

Introduction

Le cellule utilizzano il processo attivo di traffico per mobilitare le proteine a specifiche localizzazioni subcellulari ed esercitare una rigorosa regolazione spatiotemporale sulla loro funzione1. Questo processo è particolarmente importante per i recettori transmembrani, poiché le risposte cellulari a diversi stimoli ambientali si basano su cascate intracellulari innescate dall'attivazione del recettore. Le cellule sono in grado di modificare queste risposte alterando la densità, la localizzazione e la composizione delle sottounità dei recettori espressi sulla superficie cellulare tramite il regolamento del traffico subcellulare del recettore2 . L'inserimento di nuovi recettori sintetizzati nella membrana plasmatica, insieme all'endocitosi e al riciclaggio dei recettori esistenti sono esempi di processi di traffico che determinano il pool netto di recettori espressi in superficie2. Molti meccanismi molecolari cooperano per regolare il traffico di proteine, comprese le interazioni proteina-proteina e le modifiche post-traduzionali come il fosforo, l'ubiquitinazione o il palmitoylation2.

La regolazione del traffico dei recettori è particolarmente necessaria in cellule fortemente polarizzate con strutture altamente specializzate. L'esempio paradigmatico è il controllo della funzione neuronale mediante traffico regolato di recettori del glutammato (GluR)3,4. Glutamate, il principale neurotrasmettitore eccitatorio, lega e attiva GluR espressi in superficie per controllare le funzioni neuronali fisiologiche fondamentali come la neurotrasmissione sinaptica e la plasticità sinaptica. Il fatto che il traffico alterato di GluR sia stato osservato in un ampio spettro di neuropatie, che vanno dai disturbi del neurosviluppo alle malattie neurodegenerative, evidenzia l'importanza di questo processo5. Pertanto, comprendere gli eventi molecolari che controllano il traffico di GluR è di interesse in molte aree di ricerca.

In questo protocollo, viene utilizzato un metodo basato sull'alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di GluR espressi in superficie nei neuroni ippocampali primari, nonché per valutare come i cambiamenti nell'internalizzazione e nel riciclo si traducano nell'espressione della superficie netta osservata. L'uso di farmacologia e/o sovraespressione di recettori esogeni che ospitano mutazioni specifiche rende questo protocollo un approccio particolarmente potente per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'adattamento neuronale a diversi stimoli ambientali. Un ultimo esempio dell'utilità di questo protocollo è lo studio di come i cambiamenti multifattoriali nell'ambiente (come in un modello di malattia) influenzino il traffico di GluR attraverso l'esame dell'espressione superficiale in tali modelli.

Utilizzando esempi specifici, è inizialmente dimostrato come una manipolazione farmacologica che imita la stimolazione sinaptica fisiologica [LTP chimico (cLTP)] aumenti l'espressione superficiale della sottounità endogena GluA1 del tipo AMPA dei GluR (AMPAR) 6.Il traffico di una forma fosforo-mimetica sovraespressa della sottounità GluN2B di NLUDA-tipo di GluRs (NMDAR) viene analizzato anche per esemplificare come questo protocollo può essere utilizzato per studiare la regolazione del traffico di GluR da parte di specifiche post-traslazionali Modifiche. Anche se questi esempi specifici sono utilizzati, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altri GluR e altri recettori e proteine che possiedono domini extracellulari antigenici. Nel caso in cui non siano disponibili anticorpi per i domini extracellulari, la sovraespressione delle proteine con etichettatura epitope extracellulare (ad esempio, Flag-, Myc-, GFP-tagged, ecc.) può aiutare nell'etichettatura delle proteine.

L'attuale protocollo fornisce istruzioni per quantificare la densità e il traffico specifici di sottotipi di GluR utilizzando anticorpi specifici. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare 1) espressione di superficie GluR totale, 2) internalizzazione GluR e 3) riciclaggio di GluR. Per studiare ogni processo singolarmente, si consiglia di iniziare con le sezioni 1 e 2 e continuare con le sezioni 3, 4 o 5. In tutti i casi, terminare con le sezioni 6 e 8 (Figura 1).

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Protocol

Il lavoro per la preparazione della cultura primaria dell'ippocampo è stato esaminato e approvato dal Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocollo #IS00001151).

1. Preparazione prima dell'etichettatura

  1. Preparazione e manutenzione delle colture primarie dell'ippocampo
    1. Preparare colture primarie di ippocampali ad una densità di 150.000 cellule placcate su bicchieri di copertura rivestiti in poli-D-lysina (0,1 mg/mL). Eccellenti guide per la preparazione della cultura neuronale dissociata sono disponibili7,8.
      NOT: Se necessario, le colture possono essere trattate con citosina arabinoside (Ara-C, 10 mM da DIV1) per evitare la proliferazione gliale nella preparazione.
      NOT: Reagenti di rivestimento alternativo come fibronectina (1 mg/mL) o laminina (5 mg/mL) possono essere utilizzati al posto di poli-D-lysina.
    2. Mantenere le colture in un'incubatrice cellulare a 37 e 5% CO2 in 2 mL/po' di supporti neurobasali integrati con B27 e 2 mM L-glutamine.
      NOT: I sostituti per L-glutamine (ad esempio, Glutamax) possono essere utilizzati, se lo si desidera.
    3. Su base settimanale, rimuovere la metà del volume dei media e sostituire con lo stesso volume di supporti neurobasali integrati.
  2. OPTIONAL: Trasfezione di recettori mutati e/o marcati epitope
    NOTA:     I neuroni devono essere trafettati almeno 3-4 giorni prima del punto di tempo di analisi per consentire l'espressione del recettore. L'uso di giovani neuroni [Days in vitro 6–9 (DIV6–9)] si traduce in una migliore efficienza di trasfezione rispetto ai neuroni più vecchi (DIV15–20), ma un numero sufficiente di cellule trasfettate (>20) può essere raggiunto indipendentemente dal DIV impiegato.
    1. Per ogni pozzo di una piastra da 12 pozze, diluire 1,5 g di plasmide contenente il costrutto di interesse in 100 - L di supporti neurobasali freschi senza B27 o il completamento della glutammina in un tubo di microcentrifuga e mescolare vortice rapidamente.
      NOT: Per una trasfezione di successo, è fondamentale che i supporti neurobasali utilizzati sia il più fresco possibile, idealmente meno di 1 settimana dopo l'apertura della bottiglia.
    2. In un secondo tubo di microcentrifuga, mescolare 1 l di reagente lipofection appropriato in 100 : L di supporti neurobasali freschi e mescolare delicatamente.
      NOT: Non vortice la miscela reagente lipofection. L'uso di reagenti di lipofezione fresco può migliorare l'efficienza della trasfezione.
    3. Incubare i tubi per 5 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Aggiungere la miscela di reagente lipofection dropwise alla miscela di DNA, mescolare delicatamente e incubare per 20 min a RT.
    5. Regolare il volume dei supporti in ogni pozzo a 1 mL di supporti condizionati.
    6. Aggiungere il reagente di lipofection -DNA miscela dropwise al pozzo.
    7. Riportare le cellule all'incubatrice e attendere almeno 3-4 giorni per l'espressione proteica.
      NOT: Ai fini dei protocolli di internalizzazione e riciclaggio descritti di seguito, i neuroni ippocampali sono stati transinfettati al DIV11–12 con costrutti che esprimono GluN2B taggati con GFP nel dominio extracellulare (GFP-GluN2B) e immagini a DIV15–16.
  3. OPTIONAL: Incubazione di cellule con farmaci (cronicamente o acutamente) nel supporto condizionato fino alla fissazione.
    NOTA:     Per il trattamento acuto, iniziare a trattare le cellule prima dell'etichettatura. A seconda del protocollo di trattamento farmacologico utilizzato, le cellule possono essere mantenute in supporti contenenti droga durante la sezione 2. Nel nostro esempio, le cellule DIV21 sono state soggette a un protocollo cLTP per aumentare AMPAR9espresso dalla superficie.
    1. Scambio di supporti condizionati per soluzione extracellulare (ECS).
    2. Trattare le cellule con 300 m di glicina in ECS per 3 min presso RT. Come controllo, trattare un coverslip sorella con ECS (senza glicina).
    3. Lavare le cellule 3x con 37 c ECS e riportare le cellule in ECS (senza glicina) all'incubatrice cellulare per 20 minuti prima di continuare con la sezione 2.
      NOTA: ECS (in mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucose, 0.001 TTX, 0.01 strychnine e 0.03 picrotosina a pH 7.4.

2. Etichettatura live dei recettori espressi dalla superficie

  1. Preparare i coverlips per l'etichettatura
    1. Per salvare i reagenti e facilitare la manipolazione, trasferire il lato della cella coverlips fino a un vassoio coperto di pellicola di paraffina.
      NOT: È fondamentale non lasciare mai asciugare i campioni.
    2. Conservare e mantenere i supporti condizionati a 37 gradi centigradi per le fasi di incubazione e lavaggio.
      NOT: Per un coverslip da 18 mm, si raccomanda l'incubazione con 75-100 - L di supporti per l'etichettatura degli anticorpi e 120-150 -L per l'internalizzazione/riciclaggio.
  2. Etichettatura dei recettori superficiali con anticorpi primari
    1. Incubare cellule con anticorpo primario diluito in supporti condizionati per 15 min a RT.
      NOT: Per i recettori marcati GFP, è stato utilizzato l'anticorpo anti-GFP del coniglio con una diluizione di 1:1000. Per GluA1 endogeno, è stato utilizzato il topo anti-GluA1 ad una diluizione 1:200.
    2. Aspirare con attenzione i supporti contenenti anticorpi utilizzando una pipetta a vuoto e lavare le cellule tre volte con supporti condizionati.
      NOT: Se il supporto condizionato non è disponibile, tutte le fasi di lavaggio possono essere eseguite utilizzando PBS [phosphate buffered saline (PBS) contenente 1 mM MgCl2 e 0,1 mM CaCl2]. L'aspirazione manuale utilizzando una micropipetta può essere eseguita se non è disponibile una leggera aspirazione sottovuoto.

3. Espressione superficie (Figura 2)

  1. Etichettatura anticorpale secondaria dei recettori espressi in superficie
    1. Lavare una volta con PBS.
    2. Fissare le cellule incubando con 4% paraformaldeide (PFA) e 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min.
      NOT: A differenza di altri metodi di fissazione come l'incubazione del metanolo, la PFA non permeabilizza la membrana plasmatica ed è quindi adatta per l'analisi dell'espressione superficiale. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare PFA appena preparato. Lo stoccaggio a breve termine di PFA a 4 gradi centigradi o a lungo termine (fino a 30 giorni) di stoccaggio a -20 gradi centigradi è permissivo per un'adeguata fissazione.
      ATTENZIONE: La PFA è un noto cancerogeno. Utilizzare dispositivi di protezione personale adeguati e un cappuccio di sicurezza durante la manipolazione.
    3. Lavare le cellule tre volte con PBS regolare.
      NOT: In alternativa, la glicina da 0,1 M può essere utilizzata per il lavaggio di PFA invece di PBS, in quanto la glicina placherà qualsiasi fixative rimanente che possa aumentare lo sfondo nella preparazione.
    4. Bloccare i siti di legame non specifici incubando con il 10% di siero di capra normale (NGS) in PBS per 30 min a RT.
      NOT: Il tempo di blocco può essere esteso senza effetti negativi sull'etichettatura.
    5. Incubazione con anticorpo secondario con etichettafluenza fluorescente diluita nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT per etichettare i recettori primari con etichettatura anticorpo (cioè espressi dalla superficie).
      NOT: In questi esempi, è stata utilizzata una diluizione di 1:500 di anticorpi secondari coniugati ad Alexa 555: capra anti-coniglio per i recettori etichettati GFP e l'antitopo di capra per GluA1.
    6. Lavare le cellule con PBS 3x.
  2. Etichettatura dei recettori intracellulari
    1. Permeabilize cellule con 0.25% Triton X-100 in PBS per 5-10 min a RT.
      NOT: Per verificare che il round iniziale dell'etichettatura degli anticorpi occupi tutti gli epitopi superficiali, questa fase di permeabilizzazione può essere saltata in una cultura sorella. In questo caso, non dovrebbe essere ottenuto alcun segnale per i recettori intracellulari. Inoltre, per verificare che nessun recettore interno sia stato etichettato nella sezione precedente 2 (cioè, mostrando l'integrità delle membrane plasmatiche nella coltura), la fase di permeabilizzazione può essere saltata in una coltura sorella e un anticorpo primario contro un la proteina intracellulare (ad esempio, PSD-95 o MAP2) può essere utilizzata nel passaggio 2.2.1. Nessun segnale deve essere ottenuto da questo primario in queste condizioni. In questo caso, è stato utilizzato un anticorpo anti-PSD-95 del coniglio (1:500).
    2. Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT.
    3. Etichettare i recettori intracellulari incubando cellule permeabilizzate con lo stesso anticorpo primario utilizzato nella sezione 2.2 diluito nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT.
      NOT: La diluizione degli anticorpi per l'etichettatura dei recettori intracellulari può essere diversa da quella richiesta per l'etichettatura dei recettori espressi dalla superficie. Nell'esempio di GluA1, è stata utilizzata la stessa diluizione dell'anticorpo (1:200).
    4. Lavare le cellule 3x con PBS.
    5. Etichetta con secondo anticorpo secondario fluorescente diluito nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT.
      NOT: In questi esempi, è stata utilizzata una diluizione 1:500 di capra anti-topo Alexa 647 coniugato anticorpo secondario (per GluA1).
    6. Lavare le cellule 3x con PBS.

4. Internalizzazione (Figura 3)

  1. Internalizzazione dei recettori superficiali con etichettatura anticorpale
    1. Dopo l'etichettatura dei recettori espressi in superficie e del lavaggio degli anticorpi (sezione 2.2), mantenere le cellule in supporti condizionati senza anticorpi e restituirle all'incubatrice (37 gradi centigradi) per consentire l'internalizzazione.
      NOT: Per i recettori NMDA, si raccomanda 30 min per l'internalizzazione. Come controllo, una cultura sorella può essere mantenuta con mezzi di comunicazione condizionati a 4 gradi centigradi durante il processo di internalizzazione. L'internalizzazione minima del recettore dovrebbe avvenire in queste condizioni.
  2. Etichettatura dei recettori di superficie
    1. Lavare le cellule una sola volta con PBS.
    2. Fissare le celle con 4% PFA e 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min.
      ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione personale adeguati e un cofano di sicurezza durante la movimentazione PFA.
    3. Lavare le cellule 3x con PBS regolare.
    4. Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT per evitare attacchi non specifici.
    5. Incubare campioni con anticorpi secondari marcati fluorescentmente diluiti in 3% NGS in PBS per 1 h a RT per etichettare i recettori primari con etichette anticorpo (cioè i recettori espressi dalla superficie che non sono stati internalizzati).
      NOT: Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo secondario anti-coniglio alexa 555 con una capra coniugata (1:500).
    6. Lavare le cellule 3x con PBS.
  3. Etichettatura dei recettori internalizzati
    1. Permeabilize cellule con 0.25% Triton X-100 in PBS per 5-10 min.
    2. Bloccare l'associazione non specifica per incubazione con 10% NGS in PBS per 30 min a RT.
    3. Incubare campioni con anticorpi secondari marcati fluorescentmente diluiti in 3% NGS in PBS per 1 h a RT per etichettare i recettori con etichettatura anticorpo internalizzati.
      NOT: Per questo esempio, per l'etichettatura viene utilizzato l'anticorpo secondario anti-coniglio con capra autenticata Alexa 647 (1:500).
    4. Lavare le cellule 3x con PBS.

5. Riciclaggio (Figura 4)

  1. Internalizzazione dei recettori superficiali con etichettatura anticorpale
    1. Dopo l'etichettatura dei recettori espressi in superficie e del lavaggio degli anticorpi (sezione 2.2), mantenere le cellule in supporti condizionati senza anticorpi e restituirle all'incubatrice (37 gradi centigradi) per consentire l'internalizzazione.
      NOT: Per i recettori NMDA, si raccomanda 30 min per l'internalizzazione.
  2. Blocco dei recettori espressi di superficie stabile
    1. Per bloccare gli epitopi sull'anticorpo primario attaccato ai recettori espressi in superficie che non sono stati internalizzati, incubare le cellule con frammenti di anticorpi Fab anti-IgG (H-L) non coniugati (contro il primario utilizzato nella sezione 2.2) diluiti nei supporti condizionati ( 20 g/mL) per 20 min presso RT. Questo trattamento previene l'interazione futura con gli anticorpi secondari.
      NOT: Per questo esempio sono stati utilizzati frammenti di Fab anti-coniglio Capra.
      NOT: Esperimento di controllo: per garantire che si sia verificato il blocco completo dei recettori espressi in superficie, i coprigemelli sorella possono essere incubati con e senza Fab. Le colture devono essere fissate immediatamente dopo il trattamento Fab, ed entrambe le culture vengono incubate con anticorpo secondario coniugato ad Alexa 555. Nessun segnale Alexa 555 nelle cellule incubate Fab indica il corretto blocco degli anticorpi.
    2. Lavare le cellule 3x con supporti condizionati.
    3. Incubare cellule con supporti condizionati contenenti 80 diadore M per prevenire ulteriori internalizzazioni e restituire le cellule all'incubatrice (37 gradi centigradi) per consentire il riciclaggio dei recettori internalizzati. Dynasore è un inibitore GTPase che inibisce la dinamina e quindi impedisce l'internalizzazione.
      NOTA: si consiglia noto 45 min per il riciclo nmDAR. Si noti che Dynasore blocca in modo esclusivo il processo di internalizzazione dipendente dalla dinamina (ad esempio, l'internalizzazione di NMDAR). Tuttavia, l'internalizzazione di altre proteine sinaptiche (indipendenti dalla dinastia) può ancora verificarsi in presenza di Dynasore.
  3. Etichettatura dei recettori riciclati
    1. Lavare le cellule una sola volta con PBS.
    2. Fissare le celle con 4% PFA e 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min.
      ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione personale adeguati e un cofano di sicurezza durante la movimentazione PFA.
    3. Lavare le cellule 3x con PBS.
    4. Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT per evitare attacchi non specifici.
    5. Etichettare le cellule con il primo anticorpo secondario con etichettafluere fluorescentmente diluite nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT.
      NOT: Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo anti-coniglio di capra racchiuso tra Alexa 555 (1:500) per l'etichettatura.
    6. Lavare le cellule 3x con PBS.
      NOT: I fumi più lunghi con PBS (5-10 min) possono contribuire a ridurre lo sfondo nella preparazione.
  4. Etichettatura dei recettori internalizzati
    1. Permeabilize cellule con 0.25% Triton X-100 in PBS per 5-10 min.
    2. Blocco con 10% NGS in PBS per 30 min a RT.
    3. Etichetta con secondo anticorpo secondario fluorescente diluito nel 3% NGS in PBS per 1 h a RT.
      NOT: Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo anti-coniglio con capra Alexa 647 (1:500).
    4. Lavare le cellule 3x con PBS.

6. Montaggio e imaging di campioni

  1. Montare le celle posizionando delicatamente il lato della cella coverlips verso il basso su 12-15 mL del supporto di montaggio appropriato.
    NOT: L'aspirazione di supporti in eccesso migliorerà la qualità delle immagini.
  2. Cellule di immagine su un microscopio confocale appropriato.
    NOT: Si consiglia di immaginare uno z-stack a un ingrandimento di 60x con passi di 0,35 m, che comprende l'intero spessore del neurone.

7. Considerazioni sul tempo

  1. Si tratta di un protocollo lungo che può essere interrotto in diversi punti. Se lo si desidera, eseguire le fasi di blocco e di incubazione dell'anticorpo primario durante la notte a 4 gradi centigradi in una camera umida.
  2. In alternativa, se lo si desidera, utilizzare un processore di tessuto a microonde per accelerare notevolmente i tempi di incubazione post-fissazione. Per tutti i passaggi, utilizzare 150 W a 30 gradi centigradi per le impostazioni "On".
    1. Per bloccare, eseguire il processore a 2 min "On", 1 min "Off" e 2 min "On".
    2. Per i passaggi di incubazione anticorpi primari e secondari, eseguire il processore a 3 min "On", 2 min "Off" e 3 min "On".
      NOT: Non osserviamo alcuna differenza di qualità apportando le modifiche di cui sopra al protocollo.

8. Analisi dell'immagine

  1. Si consiglia di utilizzare FIJI per condurre l'analisi delle immagini, in quanto è compatibile con più formati di file. Per i nostri dati, sono state acquisite immagini nel formato di file Nikon ND2.
  2. Viene fornito uno script macro per facilitare la quantificazione batch di diversi parametri preselezionati da FIJI. Nella macro sono inclusi i seguenti passaggi:
    NOT: Per questi esempi è stata misurata l'"intensità integrata".
  3. Aprire i file di immagine in FIJI e canali separati.
  4. Ogni stack di canali viene proiettato a z come proiezione di intensità massima.
  5. Impostare una soglia inferiore per ogni canale.
    NOT: Le soglie devono essere determinate empiricamente per ogni set di dati sperimentali. Sebbene ogni canale possa avere un valore di soglia inferiore separato, è fondamentale che i valori di soglia del canale vengano mantenuti in modo coerente per tutte le immagini dello stesso set di dati.
  6. Selezionare da tre a cinque dendriti secondari o terziari e salvarli come aree di interesse (ROI).
  7. Misurare la densità integrata di ogni ROI nei canali di superficie e intracellulari.
  8. Normalizzare il segnale per ogni ROI dividendo il valore di densità integrato del canale di superficie per il canale intracellulare.
  9. Ripetere le misurazioni per tutte le immagini di controllo e sperimentali e normalizzare i valori sperimentali per controllare i valori (ad esempio, GluN2B WT o condizioni no-glycine).

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Representative Results

Questo protocollo per studiare il traffico dei recettori del glutammato si basa sull'etichettatura differenziale dei recettori espressi sulla superficie cellulare e su quelli espressi nelle membrane interne. La segregazione si ottiene etichettando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo diverso. Come delineato dalle fasi facoltative incluse il protocollo, questo è un metodo molto versatile per interrogare diversi processi di traffico dei recettori, come l'internalizzazione e il riciclaggio, e può essere facilmente adattato alle esigenze dello sperimentatore (Figura 1) .

In primo luogo, viene fornito un metodo per la quantificazione dei recettori espressi sulla superficie neuronale. Questo protocollo consente la quantificazione dell'espressione della superficie basale e lo studio dei meccanismi molecolari con cui diversi farmaci o mutazioni alterano i livelli di basale dei recettori espressi in superficie. I recettori espressi in superficie sono stati etichettati per la prima volta mediante incubazione con anticorpi primari e secondari prima della permeabilizzazione. Dopo la permeabilizzazione con 0.25% Triton X-100, il pool intracellulare di recettori è accessibile per l'etichettatura anticorpale. Per illustrare questo protocollo, è stata condotta la colorazione superficiale e intracellulare dei recettori AMPA (AMPA) nelle colture di controllo e dopo l'induzione di cLTP. In particolare, le cellule vive sono state etichettate usando un anticorpo contro un epitopo extracellulare nella sottounità GluA1 dell'AMPAR, e le cellule sono state fissate e poi etichettate con il secondario coniugato Alexa 555. Le cellule sono state poi permeabilizzate ed etichettate con lo stesso anticorpo anti-AMPAR e incubate con un anticorpo secondario coniugato ad Alexa 647. Questa doppia etichettatura consente una chiara visualizzazione delle due popolazioni di GluA1.

Dopo l'acquisizione di immagini confocali, il segnale fluorescente può essere facilmente quantificato per mostrare un aumento dell'espressione superficiale, rispetto alla popolazione intracellulare, seguendo cLTP (Figura 2A, B). Come controllo, il passo della permeabilizzazione è stato saltato (incubazione con 0,25% Triton X-100) in una coverslip sorella e un anticorpo primario è stato utilizzato contro PSD-95, un marcatore intracellulare standard per sinapsi estatiche. Come mostrato nella Figura 2C, nessun segnale per PSD-95 può essere ottenuto in cellule non permeabilizzate, dimostrando l'integrità della membrana plasmatica. Ciò indica che il segnale ottenuto per "superficie GluA1" corrisponde infatti ai recettori espressi in superficie (cioè, il segnale per GluA1 espresso in superficie non include i recettori intracellulari). È importante sottolineare che un segnale minimo per "GluA1 interno" può essere osservato in condizioni non di permeabilizzazione, dimostrando che tutti gli epitopi superficiali sono occupati dal ciclo iniziale dell'etichettatura degli anticorpi (cioè, il segnale per GluA1 intracellulare non include recettori espressi dalla superficie).

Un secondo processo che può essere esaminato utilizzando questo protocollo è l'internalizzazione dei recettori espressi in superficie. In particolare, i recettori superficiali sono etichettati su una cellula viva, e i neuroni vengono restituiti all'incubatrice per un dato tempo per sottoporsi all'internalizzazione del recettore per endocitosi mediata dalla clatra. Dopo questo passaggio, le cellule sono fissate per preservare l'espressione spaziale dei recettori primari con etichettatura anticorpale (cioè i recettori espressi dalla superficie e interiorizzati). Quindi, i recettori superficiali (cioè quelli che non sono stati interiorizzati nel periodo di tempo di interesse), sono etichettati con un anticorpo secondario prima della permeabilizzazione. Dopo la permeabilizzazione, i recettori che sono stati interiorizzati sono etichettati da un anticorpo secondario con un fluoroforo diverso.

In questo protocollo, è stato esaminato come una particolare fosfora lalicazione all'interno del ligando PDtm della sottounità GluN2B dei NMDAR (a S1480) induca l'internalizzazione di NMDAR. Per farlo, le colture primarie sono state trafettate con un recettore fosfo-mimetico, in cui la serina (S1480) era stata sostituita dal glutammato (E). Il mutante risultante, GluN2B S1480E, agisce come una forma "costitutivamente fosforesa" di GluN2B. Per facilitare l'etichettatura di GluN2B e identificare il mutante fosfo-mimetico, GFP è stato utilizzato come tag epitope sul lato extracellulare di GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). I recettori superficiali sulle cellule vive sono stati etichettati con un anticorpo anti-GFP per 15 min a RT. Successivamente, l'anticorpo in eccesso è stato lavato con supporti condizionati e ha restituito le cellule a 37 gradi centigradi per 30 min per consentire l'endocitosi. Quindi, le cellule sono state fissate per congelare il movimento del recettore. I ricettori rimasti in superficie sono stati poi etichettati con anticorpo secondario coniugato ad Alexa 555 prima della permeabilizzazione.

Per identificare i recettori che erano stati internalizzati durante il periodo di incubazione di 30 min, le cellule sono state permeabilizzate e i recettori interiorizzati (già etichettati con un anticorpo primario) sono stati poi etichettati con anticorpi coniugati con Alexa 647. Ancora una volta, questa strategia di doppia etichettatura permette la quantificazione della proporzione di recettori interiorizzati. Questo esempio evidenzia che il fosforolo GluN2B a S1480 promuove l'internalizzazione del recettore, poiché il mutante fosfo-mimetico S1480E ha mostrato un rapporto di internalizzazione molto più elevato rispetto ai recettori WT (Figura 3A, B). Come controllo, una cultura sorella a 4 gradi centigradi è stata mantenuta in mezzi condizionati durante l'internalizzazione per rallentare fortemente il processo. Come previsto, non è stato ottenuto alcun segnale per i recettori "internalizzati" in queste condizioni (Figura 3C).

Infine, questo protocollo può essere utilizzato per esaminare il riciclaggio dei recettori precedentemente internalizzati. Questa variazione del protocollo è una continuazione del protocollo di internalizzazione, seguendo questi recettori fino alla superficie cellulare. Ci sono due componenti cruciali per questa variazione. In primo luogo, i recettori che sono rimasti stabilmente espressi in superficie durante l'intero protocollo (cioè, i recettori che non sono stati internalizzati o riciclati) devono essere "bloccati" in modo che non vengano scambiati per recettori riciclati. Per farlo, prima di eseguire la fase di riciclo, i neuroni vivi vengono incubati con alte concentrazioni di Fab che interagiscono con i recettori primari con etichettatura anticorpale espressa in superficie per prevenire un ulteriore legame del secondario coniugato con fluoroforo anticorpo. In secondo luogo, l'internalizzazione dovrebbe essere prevenuta durante la fase di riciclaggio, in modo che i recettori riciclati non si ripetano internalizzati. Questo è stato fatto aggiungendo dinamiore ai media durante il riciclaggio come questo farmaco blocca i processi che si basano sulla dinamina come l'endocitosi mediata dalla clatra, come l'internalizzazione di NMDAR. In questo protocollo, è stato eseguito lo studio del traffico del mutante fosfo-mimetico GluN2B S1480E e l'etichettatura superficiale di GFP-GluN2B sulle cellule vive, che ha permesso l'internalizzazione durante un periodo di 30 min, come spiegato in precedenza.

In seguito, i recettori superficiali che non sono stati internalizzati durante questo periodo sono stati bloccati dall'incubazione delle cellule con Fab per 20 min a RT. Successivamente, le cellule sono state nuovamente incubate a 37 gradi centigradi per 45 min per consentire il riciclo di GluN2B precedentemente internalizzato sulla superficie cellulare. Dynasore era presente nei media durante la fase di riciclaggio. La fissazione delle cellule che segue questo passaggio consente l'identificazione di recettori riciclati (cioè quelli sbloccati ed espressi sulla superficie cellulare) e dei recettori interiorizzati (cioè quelli che sono anticorpi primari etichettati e intracellulari). Di 1) etichettare i recettori riciclati con un anticorpo secondario coniugato Alexa 555 prima della permeabilizzazione e 2) etichettatura dei recettori internalizzati, ma non riciclati, con anticorpi secondari coniugati con Alexa 647, è stato generato un rapporto di riciclaggio per dimostrare che GluN2B S1480E non ha alcun effetto sul riciclo di NMDAR (Figura 4A, B). Come controllo, è stato assicurato che il blocco completo dei recettori espressi in superficie si è verificato incubando sorella coverlips in presenza o assenza di Fab, seguito con fissazione PFA. Come illustrato nella Figura 4C, è possibile osservare un segnale forte per GluN2B espresso in superficie in assenza di blocco Fab. Questo segnale scompare nelle colture trattate con Fab, dimostrando che il protocollo di blocco è sufficiente a bloccare completamente gli epitopi espressi in superficie e che i segnali superficiali osservati dopo il riciclaggio corrispondono effettivamente ai recettori trafficati la membrana plasmatica.

Figure 1
Figura 1: Schematiche delle variazioni del protocollo per studiare l'espressione superficiale del recettore, l'internalizzazione del recettore (endocitosi) e il riciclaggio del recettore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: cLTP aumenta l'espressione superficiale di GluA1. I neuroni ippocampali primari al DIV21 sono stati sottoposti a LTP chimico (cLTP) mediante incubazione con ECS contenente glicina. L'etichettatura distinta delle popolazioni GluA1 espresse in superficie (rosso) e intracellulare (blu) rivela il previsto aumento dell'espressione superficiale di AMPAR. (A) Piano singolo e(B) immagini confocali impilate (proiezione di intensità massima). Barre della scala: 50 m (cella intera) o 5 m (dendrite). Il grafico mostra l'espressione superficiale aumentata di GluA1 dopo il protocollo cLTP. Indice di espressione della superficie: i recettori di superficie/intracellulare (n - 3; numero di cellule: con s 7; cLTP - 7; i valori rappresentano la media , SEM; , p < 0,0001 utilizzando il test Mann-Whitney U). (C) Esperimento di controllo in cui è stata ignorata la fase di permeabilizzazione. Oltre alla superficie e al GluA1 interno, è stato valutato il marcatore sinaptico intracellulare PSD-95. Barre della scala: 50 m (cella intera) o 5 m (dendrite). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Il fosforo lalizzazione di GluN2B a S1480 promuove l'internalizzazione di NMDAR. I neuroni ippocampali primari sono stati trafettati con GFP-GluN2B WT o con il mutante fosfo-mimetico GFP-GluN2B S1480E su DIV11-12. Dopo 3-4 giorni di espressione proteica, la GFP superficiale è stata etichettata su cellule vive con un anticorpo e cellule anti-GFP del coniglio sono state poi restituite a 37 gradi centigradi per consentire l'internalizzazione del recettore per endocitosi. I recettori esogeni espressi in superficie sono stati visualizzati con anticorpi secondari coniugati ad Alexa 555, e la popolazione internalizzata identificata dopo la permeabilizzazione usando anticorpi coniugati alexa 647. Per chiarezza, la superficie GFP-GluN2B è pseudocolorata in verde e gFP-GluN2B interiorizzata è pseudocolorata in bianco. (A) Piano singolo e(B) immagini confocali impilate (proiezione di intensità massima). Barre della scala: 50 m (cella intera) o 5 m (dendrite). Il grafico mostra l'internalizzazione elevata visualizzata dal mutante fosfo-mimetico GluN2B S1480E. Indice di internalizzazione: recettori internalizzati/recettori espressi dalla superficie (n - 6; numero di cellule: WT - 34; S1480E - 28; i valori rappresentano media : SEM; p < 0.001 utilizzando il test Mann-Whitney U). (C) Esperimento di controllo in cui la fase di internalizzazione (Intenaliz.) è stata eseguita a 4 gradi centigradi. Barre della scala: 50 m (cella intera) o 5 m (dendrite). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Il fosforo lalazione di GluN2B a S1480 non modifica il riciclaggio NMDAR. I neuroni ippocampali primari sono stati trasfettati con GFP-GluN2B WT o con il mutante fosfo-mimetico GFP-GluN2B S1480E su DIV11-12 come mostrato nella Figura 3. Dopo 3-4 giorni di espressione proteica, la GFP superficiale è stata etichettata su cellule vive con un anticorpo e cellule anti-GFP del coniglio sono state poi restituite a 37 gradi centigradi per consentire l'internalizzazione del recettore per endocitosi. I restanti recettori espressi in superficie sono stati bloccati dall'incubazione di Fab e il riciclaggio è stato consentito per 45 min. popolazione identificata dopo la permeabilizzazione usando anticorpi coniugati alexa 647. Per chiarezza, la superficie GFP-GluN2B è pseudocolorata in bianco e GFP-GluN2B interiorizzata è pseudocolorata in verde.  (A) Singolo piano e (B) immagini confocali sovrapposte (proiezione di intensità massima). Barre della scala: 50 m (cella intera) o 5 m (dendrite). Il grafico mostra la mancanza di effetto del fosforo l'anaggio GluN2B S1480 sul riciclaggio. Indice di riciclo: recettori riciclati/recettori internalizzati (n - 5; numero di cellule: WT - 27; S1480E - 24; i valori rappresentano media : SEM; n.s. - Non significativo con il test Mann-Whitney U). (C) Esperimento di controllo in cui è stata saltata la fase di incubazione di Fab per bloccare gli epitopi espressi in superficie. Barre della scala: 50 m (cella intera) o 5 m (dendrite). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'interazione tra una cellula e il suo ambiente (ad esempio, la comunicazione con altre cellule, la risposta a diversi stimoli, ecc.), si basa fortemente sulla corretta espressione dei recettori sulla superficie cellulare. La regolazione rapida e messa a punto nel contenuto del recettore espresso in superficie consente una risposta cellulare adeguata a un ambiente in continua evoluzione. Nel caso particolare dei neuroni, le alterazioni del numero, la localizzazione e la composizione delle sottounità di recettori sinatici espressi influenzano pesantemente la comunicazione sinaptica, la plasticità sinaptica, la sinaptogenesi e la potatura sinaptica3, 5,10. Pertanto, un'analisi accurata dell'espressione superficiale del recettore e del meccanismo alla base della sua regolamentazione è un importante argomento di ricerca.

Esiste una serie di modalità con cui è possibile studiare l'espressione della superficie del recettore. In generale, queste rientrano in tre categorie principali: (i) isolamento biochimico della popolazione di recettori espressi dalla superficie, (ii) tecniche di imaging per visualizzare i recettori in superficie e (iii) tecniche funzionali per monitorare le conseguenze del recettore attivazione f. Questi approcci sono complementari e possono essere utilizzati in combinazione per rispondere a domande specifiche sull'espressione superficiale dei recettori.

Esempi di isolamento biochimico dei recettori espressi dalla superficie includono protocolli di biotinylazione in cellule coltivate o fette cerebrali e frazionazione subcellulare di cellule coltivate o tessuto11. La biotinylazione superficiale si basa sull'etichettatura dei recettori espressi in superficie con la biotina incubando le colture con biotina attivata dall'ester. Il gruppo ester ester estere reagisce con i gruppi di amminometri primari (-NH2) per formare legami stabili. Poiché questo reagente è impermeabile nelle cellule, solo le proteine espresse in superficie sono etichettate con biotina. Dopo la lisi cellulare utilizzando detergenti, recettore etichettato può essere recuperato incubando la lisata cellulare con perline di Agarose coniugate all'avidin o alle sue varianti che hanno una forte affinità per la biotina, quindi valutate da immunoblotting. La frazione subcellulare è un protocollo biochimico che utilizza diversi passaggi di centrifugazione per isolare diversi compartimenti cellularri in base alle loro diverse densità12. Entrambe le tecniche sono utili per quantificare i cambiamenti nell'espressione superficiale delle proteine endogene e possono essere utilizzate in combinazione con approcci farmacologici (sia in vivo che in coltura) per determinare come le manipolazioni molecolari influenzino l'espressione superficiale recettori. Sono particolarmente utili perché i cambiamenti nei recettori endogeni multipli, rispetto a uno standard, possono essere quantificati contemporaneamente. Tuttavia, a differenza delle modalità di imaging, come quella descritta in questo protocollo, la risoluzione spaziale viene persa attraverso l'elaborazione biochimica di campioni.

Il protocollo qui descritto appartiene alla categoria delle tecniche di imaging. Questo gruppo di approcci (come l'etichettatura della superficie e l'imaging a cellule vive di proteine sovraespresse fluorescenti) sono utili per dare una risoluzione spatiotemporale all'espressione superficiale dei recettori. Ad esempio, esaminando l'espressione superficiale contro quella intracellulare di AMPAR, come esemplificato in precedenza, si può esaminare come i cambiamenti di espressione sono pronunciati nei dendriti (il compartimento biologico di interesse per questa particolare applicazione). Come la frazione biochimica, i farmaci possono essere utilizzati con tecniche di imaging per determinare gli effetti di un farmaco sull'espressione superficiale. Inoltre, la trasfezione di neuroni con recettori contenenti modifiche (mutazioni o tag) elabora ulteriormente le possibilità di imaging. La trasfezione con i recettori mutanti può delineare gli effetti di una particolare mutazione sull'espressione della superficie.

Un altro approccio utile per visualizzare il traffico di recettori è la microscopia di imaging dal vivo dopo la trasfezione delle colture primarie con costrutti con tag fluorescenti, come la pHluorina superecliptica (SEP) o altri costrutti con etichetta fluoroforo13. I recettori marcati SEP possono essere particolarmente utili per studiare i recettori espressi in superficie, poiché questo fluoroforo fluorescerà solo quando esposto al mezzo extracellulare. Come esempi precedenti, gli approcci farmacologici possono essere utilizzati, o mutazioni fatte sul recettore, per determinare se questi cambiano le caratteristiche di espressione superficiale del recettore. Nel caso dei farmaci, l'imaging a cellule vive può essere utilizzato per monitorare le modifiche nell'espressione della superficie in tempo reale. Una limitazione all'imaging dal vivo è la mancanza di informazioni meccanicistiche sui cambiamenti nell'espressione della superficie. Per esempio, un'espressione superficiale in diminuzione potrebbe essere il risultato di una maggiore internalizzazione del recettore, riduzione del riciclaggio del recettore o entrambi.

Per rispondere a questa domanda, può essere utilizzato il protocollo descritto in precedenza. Un altro importante evento di traffico che può essere monitorato utilizzando approcci di imaging dal vivo è la diffusione laterale dei recettori tra diversi compartimenti nella membrana plasmatica (ad esempio, tra siti sinaptici ed extrasinaptici). In questo caso, la tecnica di scelta è l'uso di approcci di tracciamento a particelle singole in cui un nanocristallo a semiconduttore a fluorescenza [cioè, Quantum Dot (QD)] è attaccato a un anticorpo contro un epitopo extracellulare sulla proteina di interesse. I QD sono caratterizzati da una notevole stabilità (che consente molto meno fotosbiancamento rispetto alle tradizionali proteine fluorescenti), una forte luminosità e l'alternanza tra lo stato di accensione/slittamento ("blinking"). Utilizzando le impostazioni appropriate del microscopio, è possibile monitorare il movimento di un singolo QD (e, quindi, una singola proteina di interesse) attraverso la membrana plasmatica cellulare14.

Il protocollo attuale fornisce un esame dei recettori nella popolazione superficiale, nella popolazione interiorizzata e nella popolazione riciclata, consentendo il calcolo dei rapporti per determinare in che modo questi processi controllano l'espressione totale della superficie. Inoltre, l'arresto dei processi di internalizzazione o riciclaggio in diversi momenti aggiunge una risoluzione temporale. Questo metodo, quindi, consente studi di espressione della superficie spatiotemporale. A differenza delle altre tecniche di imaging, possono essere studiati anche i livelli di espressione endogena della superficie (ad esempio, AMPAR), a condizione che esista un anticorpo contro la porzione extracellulare del recettore. Tuttavia, poiché questo metodo richiede la fissazione delle cellule, non è compatibile con l'imaging delle cellule vive e pertanto non è in grado di fornire informazioni in tempo reale.

Infine, gli approcci funzionali come l'elettrofisiologia15 o l'imaging al calcio16 sono potenti, anche se spesso indiretti, per studiare l'espressione superficiale dei recettori. Questi metodi si basano sulla quantificazione dei cambiamenti funzionali nella cellula dopo l'attivazione del recettore (ad esempio, cambiamento nel potenziale della membrana o concentrazione di calcio). Utilizzando la farmacologia per isolare la risposta di un determinato recettore, questi metodi consentono di stimare i recettori espressi sulla superficie cellulare in modo preciso e patiotemporale. Questi metodi sono versatili e consentono lo studio delle cellule in coltura e in condizioni più fisiologiche ex vivo (ad esempio, fette di cervello acute) e in vivo. Tuttavia, come nel caso degli approcci di imaging live, le informazioni meccanicistiche sono spesso perse quando si utilizzano approcci funzionali.

In sintesi, una combinazione di tecniche per studiare l'espressione superficiale del recettore può essere utilizzata per comprendere appieno come viene controllata l'espressione della superficie. Il protocollo qui presentato è particolarmente potente in quanto fornisce una comprensione meccanicistica dell'espressione della superficie spatiotemporale dei recettori nelle culture primarie dissociate.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Northwestern Center for Advanced Scopy per l'uso del microscopio Nikon A1 Confocal e la loro assistenza nella pianificazione e nell'analisi degli esperimenti. Questa ricerca è stata supportata da NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e da un NARSAD Young Investigator Grant della Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

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References

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Neuroscienze Problema 150 Recettore del glutammato espressione superficiale internalizzazione del recettore riciclaggio del recettore alimentazione anticorpale trasfezione neuroni
Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate
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Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

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