Summary
Mekaniske kræfter er vigtige for at kontrollere celle migration. Denne protokol demonstrerer brugen af elastiske silicagelrogeler, der kan deformeres ved hjælp af en glas mikropipette og en micromanipulator for at stimulere celler med en lokal stivhed gradient til at fremkalde ændringer i cellestruktur og migration.
Abstract
Durotaxis er den proces, hvorved cellerne fornemmer og reagerer på gradienter af spændinger. For at studere denne proces in vitro, skal stivheden af substratet underliggende en celle manipuleres. Mens silicagelrogeler med gradueret stivhed og langtids migration assays har vist sig nyttige i durotaxis undersøgelser, umiddelbare, akutte reaktioner på lokale ændringer i substrat spændinger tillader fokuseret undersøgelse af individuelle celle bevægelser og subcellulære signalering begivenheder. For at gentage test af cellernes evne til at fornemme og reagere på den underliggende substrat stivhed anvendes en modificeret metode til anvendelse af akutte stigninger i øget spænding til individuelle celler, der dyrkes på deformerbare silicagelrogeler, hvilket giver mulighed for realtid manipulation af styrken og retningen af stivhed gradienter skiltes på celler pågældende. Ved finjustering af analysens detaljer og parametre, såsom mikropipettens form og dimensioner eller den relative placering, placering og retning af den anvendte gradient, kan analysen desuden optimeres til studiet af enhver mekanisk følsom celletype og system. Disse parametre kan ændres til pålideligt at ændre den anvendte stimulus og udvide funktionaliteten og alsidigheden af analysen. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af både langsigtede durotaktisk bevægelse samt mere umiddelbare ændringer i cellulære signalering og morfologiske dynamik som reaktion på skiftende stivhed.
Introduction
I løbet af de sidste par årtier har betydningen af de mekaniske egenskaber af en celles miljø vundet stigende anerkendelse i cellebiologi. Forskellige væv og ekstracellulære matricer har forskellige relative stivhed og, som celler migrere i hele kroppen, de navigerer disse ændringer, ved hjælp af disse mekaniske egenskaber til at vejlede dem1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. cellerne bruger stivheden i et givet væv til at informere deres motile sædceller adfærd under processer som udvikling, sårheling og kræft metastaser. De molekylære mekanismer, der giver mulighed for at føle og reagere på disse mekaniske indgange, er dog stort set ukendte1,2,3,4,5, 6 , 7.
For at studere de mekanismer, hvorigennem cellerne reagerer på fysiske Miljøsignaler, skal stivhed eller stivhed af substratet underliggende celler manipuleres. I 2000 udviklede Chun-min Lo, Yu-Li Wang og kollegaer en assay8 , hvorved en individuel celles motile sædceller respons på skiftende mekaniske signaler kunne testes direkte ved at strække deformerbare ekstracellulære matrix (ECM)-belagt polyacrylamid silicagelrogeler, som cellerne blev belagt på. Celler udviser en betydelig præference for at migrere mod stivere substrater, et fænomen, de døbt "durotaxis."
Siden den oprindelige rapport i 2000, mange andre teknikker har været ansat til studiet af durotaxis. Stejle stivhed gradienter er blevet fremstillet ved støbning geler over stive funktioner såsom polystyren perler9 eller stiv polymer stillinger10 eller ved polymeriserende substrat omkring kanterne af et glas dæksedler11 at skabe mekaniske ' trin-grænser «. Alternativt, silicagelrogeler med lavvandede men faste stivhed gradienter er blevet fremstillet af en række forskellige metoder såsom gradienter af krydsbinderens skabt af mikrofluidisk enheder12,13 eller side-by-side hydrogel opløsning dråber af forskellig stivhed8, eller silicagelrogeler med foto aktiv krydsbinderens behandlet med klassificeret UV lys eksponering for at skabe en lineær stivhed gradient14,15. Disse teknikker er blevet brugt til stor effekt til at undersøge durotaktisk cellulære bevægelse en masse over tid. Men, typisk disse funktioner er fremstillet i forvejen af celle plating og deres egenskaber forbliver konsekvent i løbet af eksperimentet, afhængige af tilfældige celle bevægelse for prøvetagning af mekaniske gradienter. Ingen af disse teknikker er modtagelig for observation af hurtige ændringer i cellulære adfærd som reaktion på akut mekanisk stimulus.
For at observere cellulære reaktioner på akutte ændringer i det mekaniske miljø, enkelt celle durotaxis assays tilbyder flere fordele. I disse analyser får individuelle celler en akut, mekanisk stimulus ved at trække det underliggende substrat væk fra cellen med en glas mikropipette, hvorved der indføres en retningsbestemt gradient af cellematrix spændinger. Ændringer i den motile sædceller adfærd, såsom hastighed eller retning af migration, er derefter observeret af levende celle fasekontrast mikroskopi. Denne fremgangsmåde letter direkte observation af årsag og virkning forholdet mellem mekaniske stimuli og celle migration, da det giver mulighed for hurtig, iterativ manipulation af retningen og størrelsen af spændings gradient og vurdering af deraf følgende cellulære svar i realtid. Desuden kan denne metode også anvendes til mekanisk stimulering af celler, der udtrykker fluorescerende fusions proteiner eller biosensorer, for at visualisere ændringer i mængden, aktiviteten eller den subcellulære lokalisering af proteiner, der mistænkes for at være involveret i mekaniserende og durotaxis.
Denne teknik har været anvendt af grupper, der studerer durotaxis8,16 og er beskrevet her, da det er blevet tilpasset af Howe Laboratory til at studere durotaktisk opførsel af skov-3 ovariecancerceller og de molekylære mekanismer, der bagvedlig durotaxis17. Derudover beskrives en modificeret metode til fremstilling af silicagelrogeler med et enkelt, jævnt lag af fluorescerende mikrosfærer nær celle kulturens overflade; Dette letter visualisering og optimering af mikropipette genererede stamme gradienter og kan tillade vurdering af celle kontraktilitet ved trækkraft mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikation af deformerbare polyacrylamid Hydrogels med indlejrede fluorescerende mikrokugler
Bemærk: Vejledning beskriver polymerisering af en 25 kPa hydrogel, der er 22 μm i diameter og ca. 66 μm tyk. Hver eller alle af disse parametre kan ændres og anvisninger til at gøre det kan findes i tabel 1 og i noterne17.
- Aktivering af glasbund retter eller dæksedler
- Forbered bind silan-arbejdsopløsningen til aktivering af en glasbunden billedbehandlings skål eller en dækseddel, der passer ind i et live-Cell billed kammer. Bland 950 μl 95% ethanol, 50 μl iseddike og 5 μl binde silan (y-Methacryloxypropyltrimethoxysilane).
Bemærk: Brug af en større bund dækseddel sammenlignet med den øverste dækseddel vil give ekstra plads til at arbejde, når du forbereder gelen og vil lette positionering af glas mikropipetten i senere trin. Hvis du bruger en dækseddel i stedet for en billed skål med glasbund, rengør du også dæksedlen som beskrevet i det følgende afsnit. - Aktiver overfladen af glasset for 20 s med en Corona stav og straks overlejre 50 μl af binde silan arbejdsopløsning. Lad opløsningen tørre i 10 minutter.
- Skyl to gange med 95% ethanol, derefter to gange med isopropanol og lad derefter dæksedlerne til airdry i ca. 20 minutter.
Bemærk: aktiveret glas kan opbevares i op til en uge i en desiccator.
- Forbered bind silan-arbejdsopløsningen til aktivering af en glasbunden billedbehandlings skål eller en dækseddel, der passer ind i et live-Cell billed kammer. Bland 950 μl 95% ethanol, 50 μl iseddike og 5 μl binde silan (y-Methacryloxypropyltrimethoxysilane).
- Rensning af topdæksedler
- Rengør 22 mm topdæksedler ved at inkube i 2% HCl ved 70 °C i 30 minutter, og vask derefter i ddH2O i 10 min. to gange.
- Påsæt dæksedlerne i en opløsning på 2% cuvette-rengørings koncentrat i ddH2o ved 50 °c i 30 minutter, og vask derefter i DDH2o i 10 min. to gange.
- Dæksedlerne skal inkubere i ddH2O ved 90 °c i 30 min, derefter i 70% ethanol ved 70 °c i 10 min, og derefter lufttørre ved 60 °c i mindst 2 timer.
Bemærk: Rengjorte dæksedler kan opbevares på ubestemt tid i en ren desiccator.
- Fluorescerende mikrosfære/perle aflejring på top dæksedler
- Sonik stamopløsningen af fluorescerende mikrokugler i 1 time i et ultralydvandbad. Lav en fungerende perle løsning ved at fortynde perle bestand 1:200 i 100% ethanol og Sonik igen i 1 time.
- 15 min før perle opløsningen er færdig med at sonikere, skal du rengøre dækglideren grundigt ved at placere dem lodret i en keramisk dækseddel holder og behandle med rum-luft plasma i 3 minutter i en bordplade plasma renser.
- For at lette håndteringen og forhindre, at dæksedlen glider i de efterfølgende trin, skal du anbringe et stykke parafilm i et 60 mm Petri skål eller en lignende beholder. Anbring dæksedlen i Stabilisatoren, og tryk let ned for at sikre god kontakt mellem parafilm og dæksedlen.
- For en 22 mm dækseddel tilsættes 150 μL af arbejds perlens opløsning til toppen af dæksedlen. Indsug straks ethanolopløsningen fra siden af dæksedlen, og efterlader perlerne på dæksedlen. Lad dæksedlen til airdry.
Bemærk: mængden af arbejder perle opløsning tilsættes skal være ~ 4 μl/cm2 og kan skaleres til at rumme enhver størrelse Cover slip.
- Støbning silicagelrogeler med indlejrede fluorescerende perler
- Hydrogel opløsningen af acrylamid og bis-acrylamid fremstilles. Bland opløsningen i henhold til tabel 1, og tilsæt derefter 2,5 μl 10% APS og 0,5 ΜL af TEMED. Bland godt. Straks gå videre til næste trin.
Bemærk: blandingen af hydrogel opløsningen kan ændres for at variere den unges modulus eller stivhed af hydrogel ved at ændre forholdet mellem acrylamid og bis-acrylamid som vist i tabel 1. Disse værdier er blevet verificeret til brug i Howe-laboratoriet ved hjælp af atomkraften mikroskopi, men bør bekræftes inden for ens institution. - Umiddelbart efter fremstilling af hydrogel opløsningen tilsættes en 25 μL dråbe til den aktiverede side af glasset-bund skålen eller bundcoveret, så Placer straks den perle belagte dækseddel på opløsningen, vulst side ned. Hvis du kontakter faldet med den yderste side af dæksedlen efterfulgt af langsom sænkning, undgår du at fange luftbobler i hydrogel.
Bemærk: højden af hydrogel skal være godt inden for arbejdsafstanden af objektivlinsen, der skal anvendes i det senere eksperiment. En hydrogel højde på 66 μm fungerer godt for de fleste systemer. Hydrogelens størrelse kan skaleres ved at tilføje mere eller mindre hydrogel opløsning afhængigt af størrelsen af dæksedlen. For at beregne den passende volumen af hydrogel opløsning, brug ligningen for volumen af en cylinder, V = πr2h hvor r er dækglas radius og h er den ønskede hydrogel højde. Typisk, denne beregning forudsiger med rimelig nøjagtighed den faktiske højde af hydrogel, som målt ved at forberede en gel med perle belagte dæksedler på både top og bund og ved hjælp af en confokal mikroskop til at måle afstanden mellem de to perler fly. Det er imidlertid blevet bemærket, at den faktiske højde af hydrogel kan afvige fra denne beregning med ± 20 μm (f. eks. afhængigt af tykkelsen og fabrikanten af den øverste glas dækseddel). Direkte måling af gel højde ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode anbefales. - Lad gelen polymerisere i 30 minutter, og fjern forsigtigt den øverste dækseddel med pincet. Tilsætning 50 mM HEPES pH 8,5 til skålen kan lette fjernelse. Vask i 5 min i 50 mM HEPES pH 8,5 tre gange.
- Hydrogel opløsningen af acrylamid og bis-acrylamid fremstilles. Bland opløsningen i henhold til tabel 1, og tilsæt derefter 2,5 μl 10% APS og 0,5 ΜL af TEMED. Bland godt. Straks gå videre til næste trin.
- Hydro gel aktivering og ekstracellulær matrix belægning
- Aktiver hydrogel overfladen ved at inkube i 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat) i 50 mM HEPES pH 8,5. Straks udsættes for en UV-bue lampe i et lukket område.
Bemærk: Beskyt sulfo-sanpah mod lys før aktivering. For en 400 W lampe, Placer gelen 10 cm væk fra pære i lysboksen og belyse for 100 s. Sulfo-SANPAH-opløsningen vil skifte fra lyse orange til mørkebrun. - Vask i 5 min i 50 mM HEPES pH 8,5 tre gange.
Bemærk: hydrerede geler kan opbevares ved 4 °c i op til en uge. - Den aktiverede hydrogel inkubaterer i 20 μg/ml fibronektin i 50 mm Hepes pH 8,5 for 1 t ved 37 °c.
- Aspirere fibronektin opløsning og vask i 5 min i fosfat-Buffered saltvand (PBS) tre gange. Steriliser hydrogel og låget på skålen i 15 min under UV-lys i en vævskultur hætte med en lav volumen af PBS. Vask en gang i sterile PBS.
Bemærk: andre typer ECM-protein kan bruges til at belægge hydrogel, herunder kollagen og Laminin.
- Aktiver hydrogel overfladen ved at inkube i 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat) i 50 mM HEPES pH 8,5. Straks udsættes for en UV-bue lampe i et lukket område.
2. plating celler
- Tilsæt 3 mL medier indeholdende 21.000 celler til at fylde en 60 mm skål for en endelig celletæthed på ~ 1000 celler/cm2. Juster sånings tætheden efter behov for at forhindre fortrængning og tillade fri bevægelighed for individuelle celler.
- Lad cellerne restituere ved 37 °C i mindst 4 timer og op til 18 timer før billeddannelse. Forbered billeddannelse ved at skylle med billedmedier to gange, før du tilføjer billedmedier. Lad cellerne ækvibrere i mindst 30 minutter før billeddannelse.
Bemærk: skærm medie forhold på forhånd for at bestemme forhold, der optimerer migreringen i den cellelinje, der bruges. For SKOV-3 celler, DMEM uden phenol rød, indeholdende 20 mM HEPES og 12,5 ng/mL epidermal vækstfaktor stimulerer den mest migration. Optimale betingelser for Ref52 celler er Ringer's buffer med 10% føtal bovin serum (FBS) og 25 ng/mL trombocytafledt vækstfaktor.
3. fremstilling af glas mikropipette: pipette trækning og smedning
- Træk 100 mm lange borosilicatglas Mikropipetter med en 1,0 mm udvendig og 0,58 mm indvendig diameter i en to-trins proces for at opnå en tilspidsning over 2 mm, der reducerer til ~ 50 μm i den første millimeter og strækker sig til en lang, parallel 10 μm diameter rør i den sidste millimeter.
- Belastning trukket pipet ind i en microforge. Form pipet til at have en 15 μm sløret spids, der er omsluttet af enden af en 250 μm sektion bøjet i en ~ 35 ° vinkel fra resten af pipet. Den omtrentlige diameter ved bøjningen skal være omkring 30 μm for at give spidsen en styrke.
Bemærk: koner-og spids dimensioner kan justeres for at anvende den ønskede kraft korrekt (Se trin 5). Ved at trække Mikropipetter ved 65 °C i det første trin i 3 mm og 60 °C i andet trin produceres de dimensioner, der er beskrevet i trin 3,1. Resultater ved hjælp af forskellige pipet pullere kan variere. - Steriliser mikropipetten i 70% ethanol før brug.
4. placering af micromanipulatoren og mikropipetten
- Fjern parabol låget og læg skålen på mikroskopet og centrer. Brug en 10X eller tilsvarende lav forstørrelse mål. Dække medierne med mineralolie for at forhindre fordampning af medierne.
-
Indsættelse af trukket pipet
- Indsæt den trukne pipet i mikropipetten kappe, peger krogen ned mod skålen. Spidsen af krogen vil være det laveste punkt, når sænket til gel.
- Indsæt kappe i micromanipulator og Juster indtil spidsen af pipet er centreret over objektivlinsen i både X og Y retninger.
- Sænk pipet ved hjælp af grov manipulator, indtil det bare rører overfladen af væsken.
- Brug fasekontrast eller brightfield, fokusere mikroskopet på vulst lag i toppen af gelen. Dette vil være referenceplanet.
- At sikre, at målet ikke er i fare for at ramme prøven eller scenen, bringe fokus over gelen for at finde spidsen af mikropipetten, ved hjælp af små justeringer af den grove manipulator i X og Y retninger til at kaste skygger på brændplanet. Kun sænke mikropipetten, når det er sikkert, at selve spidsen af pipet er i synsfeltet.
- Sørg for, at den slørede spids af mikropipetten peger nedad ved at rotere pipetten i hylsteret eller rotere kappe i micromanipulatoren, indtil spidsen er vinkelret på brændplanet. Gentag trin 4,4 og 4,5 efter behov. Fokuser på spidsen af pipet.
- Fokus tilbage ned til toppen vulst lag af gel til at måle, hvor langt pipet er fra gelen overflade. Fokus tilbage op til et fly, der er en del vej mellem gelen og spidsen af pipet. Sænk langsomt pipet for at nå det mellemliggende brændfly.
- Gentag trin 4,6, indtil meget svage skygger fra spidsen af mikropipetten kan værdsættes, når der fokuseres på hydrogel. Øges til den næsthøjeste forstørrelse.
- Sænk micromanipulatoren, indtil skygger og refraktioner af selve spidsen af mikropipetten kan værdsættes inden for vulst laget brændplanet.
- Forøg forstørrelsen til det, der vil blive brugt i eksperimentet. Sænk pipet, indtil det svæver lige over overfladen af hydrogel.
5. kalibrering af micromanipulator og Force generation
- Sænk den svævende mikropipette i fase eller brightfield for at røre ved overfladen af hydrogel. Vær opmærksom på, hvordan pipet ser ud ved kontakt med hydrogel. Fortsæt med at sænke mikropipetten i Z, indtil justeringer i X og Y forårsager træk og afbøjning af hydrogel i disse retninger. Brug mikrosfærer eller nærliggende celler som forvaltnings mærker.
Bemærk: Hvis micromanipulatoren er fastgjort til fase kondensator armen eller bænken og ikke selve prøvestadiet, skal du altid frigøre gelen, før du flytter scenen for at undgå at bryde pipet eller forstyrrende celler. Hvis pipet bryder sammen, skal du gå tilbage til trin 3 og trin 4. - Find et område blottet for celler til at engagere gelen. Træk det i alle retninger og blive fortrolig med den måde micromanipulation oversætter til deformation af gelen.
- Tag fluorescerende billeder af vulst feltet uden manipulation, med pipet, der engagerer gelen, og med det engagerede pipet, der trækker gelen. Gentag dette flere gange tager gode noter om aksemærkerne på micromanipulator, den måde, pipet spidsen ser i fase eller lysfelt på hvert trin i træk, og afstanden spidsen bevæger sig ved hjælp af denne manipulation.
- Brug ImageJ som tidligere beskrevet16,17 til at beregne relative perle forskydninger og kraft anvendt på perlerne ved at sammenligne null perle feltet til vulst feltet uden pipet engagement, vulst feltet med gelen engageret, og trukket gel.
- For at finjustere den træk stimulus, Sammenlign Force ansøgning ved hjælp af forskellige mikropipette spids dimensioner, afstande fra cellen, eller afstand trukket af micromanipulator fra indledende punkt af touchdown. Effekten af mikropipette spids dimensionen på Force-applikationen giver stor fleksibilitet for brugeren, men viser også behovet for at generere kraft kort til nye Mikropipetter, selv når dimensionerne og formen ligner tidligere kalibrerede spidser.
6. udførelse af durotaxis-analysen
- Før du udfører forsøget, øve at engagere gelen i nærheden af en celle og observere deformation af cellen, når micromanipulator er omplaceret.
- Overvåg en gruppe celler, der har tydelig polaritet og ser ud til at bevæge sig i 30 minutter for at identificere celler, der bevæger sig på en målrettet måde.
- Vælg en celle, der bevæger sig i en enkelt, klar retning og overvåge det på den ønskede frame rate for yderligere 30 min.
- Hvis bestemmelse af kræfter, der udøves på cellen eller spændinger udøvet af cellen ønskes, fange perle feltbilleder ved hver erhvervelse. Hvis cellen ændrer sin retning under overvågningen, skal du vælge en anden celle for at overvåge, da dette vil gøre det vanskeligt at bestemme effekten af stimulation.
- Kast hydrogel ca. 50 μm væk fra cellen. Placer pipet foran den yderste side af forkant og flytte micromanipulator sådan, at gelen er deformeret ortogonalt til cellens kørselsretning. Observere cellen over tid, da det reagerer på den akutte, lokale gradient af stivhed.
Bemærk: den timing, der gives her, er effektiv ved overvågning af SKOV3 eller Ref52 fibroblaster, men intervallet og det samlede tidsforløb skal justeres, så det passer til den celletype og den biologiske hændelse, der observeres. Hvis parring med Fluorescens mikroskopi, pause fluorescerende erhvervelse umiddelbart før trin 6,5., brug fasekontrast eller lysfelt til position mikropipette og træk, og genstart fluorescerende erhvervelse umiddelbart efter. - Hvis pipet glider, eller hvis forløbet på anden måde er afslappet eller frigivet, skal du finde en ny celle ved at gentage trin 6,2 og 6,3.
7. bestemmelse af det durotaktiske migrations respons
- Ved hjælp af ImageJ19 eller et andet billedanalyse program kan du beregne drejevinklen ved at tegne en linje mellem midten af cellens forkant ved 0 min og 30 min. post Monitor (som afspejler cellens oprindelige bane) og en anden linje mellem midten af den førende kant lige før og 80 min efter stimulation og måling af vinklen mellem disse to linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at tilberede Mikropipetter (figur 1) og normalisere kraft genereringen af træk (figur 2 og figur 3) som beskrevet ovenfor er der identificeret optimale durotaktiske betingelser for flere cellelinjer. Ved hjælp af denne teknik, som beskrevet i figur 4, BEVÆGER både skov-3 ovariecancerceller17 og Ref52 rotte embryonale fibroblaster (figur 5) sig mod øget stivhed i gradienter anvendt af en glas mikropipette. Ud over durotaxis, denne metode kan bruges til at studere dynamiske signalering begivenheder ved hjælp af fluorescerende biosensorer og markører. For eksempel kan strukturen af og signalering inden for fokale vedhæftnings strukturer observeres ved durotaktisk stimulation. Vinculin spændings sensor (VinTS) er en FRET-baseret biosensor, der lokaliserer til fokale adhæsioner, hvilket giver mulighed for fluorescerende observation af fokale vedhæftnings dynamik og måling af ændringer i spændinger inden for disse strukturer19. Ref52 celler transitivt udtrykker VinTS på 125 kPa polyacrylamid gels viser dannelsen af fokale sammenvoksninger i retning af stræk over tidsperioden på 40 min (figur 6a). FRET Analysis20 afslører, at vinculin lokaliseret til fokale sammenvoksninger oplever en umiddelbar ændring i spændinger, når de præsenteres med akut durotaktisk stimulation (figur 6b), der udvider nytten af denne analyse til observation af subcellulære signalering af hændelser som reaktion på durotaktisk stimulation.
Figur 1. Diagrammer af typiske trukket (A) og smedede (B) Mikropipetter. A) Mikropipetter trækkes ved hjælp af en to-trins protokol for at opnå en tilspidsede fra 1 mm til 10 μm over 2 mm.B) Mikropipetter indlæses derefter i mikroforge, og deres spidser bøjes, omsluttes og forkortes, således at de sidste 250 μm af mikropipetten er bøjet i en ~ 35 ° vinkel og tilspidsere fra ~ 30 μm til en afrundet spids, der måler ~ 15 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Forbedret perle felt efter ethanol belægning i forhold til traditionel metode ved hjælp af poly-L-lysin. Repræsentative hydrogel perle felter fra poly-L-lysin og ethanol (EtOH) fordampning Cover slip belægning metoder ved hjælp af gul-grøn, rød, og mørkerød fluorescerende perler. Skala bjælke: 25 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Generering af force Map for et eksempel durotaktisk stræk. A) placeringen af fluorescerende mikrosfærer før og efter (henholdsvis pseudo farvet grøn og rød), der deformerende hydrogel med en mikropipette (placeret uden for panelets højre kant). Skala bjælke: 25 μm. Forskydnings vektorer (B) og forskydnings varmekort (C) mellem null og trak perle felter genereret af trækkraft mikroskopi plugins i ImageJ Fremhæv hældningen af perle afbøjning og hydrogel stamme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Skematisk af durotaxis analyse og bestemmelse af afbøjning vinkel. A) der observeres en celle i mindst 30 minutter for at bestemme dens oprindelige forløb. B) mikropipetten anbringes i ortogonalt til cellens bane, 50 μm fra cellens kant. Hydrogel er engageret af mikropipetten, således at flytning af mikropipetten vil udøve kraft på overfladen af hydrogel. C) mikropipetten trækkes yderligere 20 μm væk fra cellen, ortogononal til cellens bane, hvilket skaber en akut, lokal gradient af spændinger (angivet med blåt), som stiger mod mikropipetten. D) cellen observeres over tid, når den navigerer i den anvendte gradient. (E) i ImageJ eller et billedanalyse program markeres den oprindelige bane (stiplede linje) af en linje, der trækkes fra midten af cellen gennem midten af forkant i den første ramme. Den endelige bane (massiv linje) markeres med en streg, der tegnes, efter at cellen har tilladelse til at navigere i den anvendte spændings gradient. Vinklen mellem disse to linjer mod stimulus kaldes "turn Angle", der er markeret her af ε. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Rotte embryonale fibroblaster bevæger sig mod regioner med øget substrat stivhed i durotaxis. Time kursus viser durotaktisk bevægelse af en Ref52 celle 10 min før pull (panel 1), 1 min før pull (panel 2), på tidspunktet for pull (panel 3), og 1 h efter træk (panel 4). Pil angiver retningen af stræk. Skala bjælke: 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Protein lokalisering og-aktivitet under durotaktisk stimulation ved hjælp af fluorescerende markører eller biosensorer. Ref52 celler transitivt udtrykker Vinculin spændings sensor (VinTS)19 migrerende på 125 kPa polyacrylamid geler præsenteres med akut durotaktisk stimulation. (A) efter stimulation, nye fokale sammenvoksninger form i retning af stræk som celler re-Orient langs stivhed gradient. For 2 10 min perioder, startende 20 min før mekanisk stimulation og 21 min efter stimulation, celle morfologi (top) og fokale vedhæftning dannelse (bund) blev overvåget. Rød farve angiver det første tidspunkt inden for tidsperioden, og grøn farve angiver tidspunktet 10 min senere. Nye fokale sammenvoksninger dannet inden for 10 min periode er vist med grønt. Før stimulation, nye fokale sammenvoksninger form i retning af rejse. Efter stimulation, nye fokale sammenvoksninger form i retning af stretch. Pil angiver retningen af stræk. Arrowheads indikerer områder med fokale sammenvoksninger dannet over den 10 min periode. Skala bjælke: 25 μm. (B) fret analyse af vints fluorescens indikerer en ændring i spændinger inden for fokale sammenvoksninger proksimalt til durotaktisk strækning. Kontur af celle membran før og efter stræk højdepunkt deformation af celle ved stimulation. Arrowheads indikerer eksempler på fokale sammenvoksninger, som oplever ændringer i FRET ratio ved stræk. Skala bjælke: 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Ønsket hydrogel stivhed | 3 kPa | 25 kPa | 125 kPa |
| 7,5% acrylamid | 100 μL | 100 μL | 160 μL |
| 0,5% bis-acrylamid | 10 μL | 100 μL | 100 μL |
| ddH2O | 287 μL | 197 μL | 137 μL |
Tabel 1. Akrylamid gel opløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Demonstreret her er en gentagelig, enkelt celle durotaxis assay, der giver mulighed for vurdering af en celles evne til at ændre sin migration adfærd som reaktion på akutte mekaniske signaler. Denne teknik kan også anvendes i kombination med Fluorescens mikroskopi og passende fusions proteiner eller biosensorer til at undersøge subcellulære signalering og cytoskeletale hændelser inden for sekunder af mekanisk stimulation eller over en længere tidshorisont under durotaktisk bevægelse. Forståelse af en celles forhold til dens omgivelser indebærer undersøgelse af virkningen af både de kemiske og mekaniske aspekter af dette miljø. Selv om det er potentielt vanskeligt at mestre, denne durotaxis assay kan være almindeligt anvendt til at forstå den cellulære respons på ændringer i sin mekaniske mikromiljø.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Som tidligere nævnt er denne mikropipette baserede metode til durotaktisk stimulation meget manipulerbar, hvilket giver en høj grad af spatiotemporel kontrol over mekaniske stimuli, en stor fordel i forhold til andre teknikker, såsom præ-formede lineære eller trin-gradienter af stivhed. Størrelsen og retningen af de afparterede stamme gradienter kan visualiseres ved at spore forskydningen af fluorescerende perler indlejret i hydrogel, nær cellekulturen overflade.
Begrænsning af disse fiducial markører til et enkelt lag lige under kultur overfladen øger nøjagtigheden af denne sporing. Mikrosfærer placeret under afbøjnings planet (der er fremstillet enten af mikropipetten eller, for trækkraft mikroskopi, ved cellulær kontraktilitet), som ville forekomme med at blande mikrosfærerne jævnt i hele hydrogel, vil bevæge sig mindre end i-plane mikrosfærer, hvilket kan føre til undervurdering af de anvendte kræfter. Også, denne modifikation er lettere at udføre og mere pålidelige end metoder, hvor perler er over lejet i et ekstremt tyndt lag af polyacrylamid støbt på toppen af en pre-dannet gel21 eller bragt til hydrogel overfladen ved tyngdekraften-assisteret afregning22 og producerer en mere jævn spredning af perler på tværs af hydrogel end tidligere beskrevne metoder17,23.
Ændring og fremtidige anvendelser
Detaljerne i denne analyse kan ændres, så de passer bedst til celle linjen af interesse. For eksempel kan en række ekstracellulære matrix molekyler (f. eks. kollagen i, kollagen IV, Laminin) eller andre klæbe ligander bruges til at funktionalisere hydrogel. Desuden kan start stivhed af hydrogel let hæves eller sænkes ved at justere forholdet mellem acrylamid og bis-acrylamid (Se tabel 1). Ved at ændre dimensionerne af mikropipetten spids og størrelsen af pull, kan denne analyse optimeres til at give en gentagelig og effektiv durotaktisk stimulus for den pågældende celletype.
Kritiske trin og fejlfinding
Kun celler efter en stabil, lineær bane af migration forud for hydro gel manipulation bør stimuleres for at sikre, at ændringer i bane skyldes den mekaniske stimulus og ikke tilfældige udsving. Der skal udvises forsigtighed for at fabrikere en glas mikropipette, som engagerer hydrogel overfladen uden at glide, men ikke rive gelen, når den trækkes. Det er vigtigt at anvende en stabil, konstant strækning til hydrogel i løbet af eksperimentet for at opnå rene resultater, hvilket betyder, at brugeren skal praktiseres ved placering og flytning af mikropipetten, før der støder en celle. Enhver utilsigtet bevægelse af mikropipetten, der fører til ændringer i spændings forløbet, kan påvirke cellens evne til at durotax. Tilsvarende bør manipulation af gelen praktiseres med hver ny mikropipette, der er smedet som små ændringer i pipet form kan forårsage pipet/gel interaktion til at variere.
Hvis du ikke placerer mikropipetten i mikroskopisk synsfelt, før forstørrelse øges, kan det medføre utilsigtet beskadigelse af den skrøbelige glasspids. Sørg for, at spids højden og X-Y-positionen er kendt, før du sænker mikropipetten med micromanipulatoren. Overhold altid mikropipettens position for at reducere risikoen for brud. Det anbefales, at forstørrelsen sænkes ned til 10x for hver ny mikropipette, der er indlæst i micromanipulatoren, da små bevægelser af micromanipulatoren og pipet kappe kan føre til store synlige ændringer i positionen af den nyligt belastede mikropipette.
Før du finder celler til at observere, er det vigtigt først at teste mikropipetten for at bekræfte, at det vil engagere hydrogel som forventet, og at det er egnet til at anvende den ønskede strækning. At finde tip-dimensioner, der passer til eksperimentet og celle typen, er afgørende for succes med at anvende durotaktisk stimulation. Enden af mikropipetten skal være afrundet nok, så den ikke bryder gennem gelen, men ikke så afrundet, at den ikke griber fat i den. Hvis pipet ikke trækker gel effektivt, kan det glide langs overfladen. Formen på mikropipette spidsen kan være for afrundet til korrekt at interagere med gelens overflade. Dimensionerne på selve spidsen af mikropipetten skal justeres, indtil fast, stabil kontakt kan opnås konsekvent. I nogle tilfælde, hvor mikropipetten glider over gelens overflade, kan det være nødvendigt at sænke mikropipetten yderligere ind i hydrogel for at opnå mere trækkraft. Hvis mikropipetten går gennem gel, kan spidsen være for fin eller for skarp. Gel rive kan også indikere for meget kraft bliver anvendt, mens du trækker. Mikropipetten skal hæves en smule for at reducere gel deformation og trække kortere afstande.
Ofte, hvis cellen eller kanten af cellen trækkes ud af fokus ved mikropipetten, er spidsen af mikropipetten engageret for tæt på cellen, eller strækningen er for kraftig. Flyt mikropipetten længere væk fra cellen, så cellen kun er lidt deformat i X-Y-flyene. Flytning af cellen ud af fokus vil ikke kun gøre cellulære begivenheder umuligt at overvåge og forårsage optiske aberrationer, men det vil få cellen til at opleve mere stimulation end den 2-dimensionelle spændings gradient beregnet.
Vigtigst er det, at det er afgørende at registrere og analysere kun svar, der har konsekvent durotaktisk manipulation med minimal menneskelig fejl. Hvis sænkningen af spidsen er upræcis, eller hvis mikropipetten er flyttet, vil resultaterne af forsøget blive overskyet. Da denne analyse er kompleks, og mange trin er tilbøjelige til at fejl, skal der udvises forsigtighed ved hvert trin for at undgå utilsigtede ændringer i stimulering af celler. Svigt på ethvert trin kan føre til inkonsekvent stretch ansøgning og upålidelige resultater.
Begrænsninger
Der er begrænsninger for denne teknik, der bør overvejes. Den mest fremtrædende, præcise smedning og manipulation af glas mikropipetterne kan præsentere en stejl indlæringskurve for nye brugere. Desuden skal positionen og størrelsen af hydrogel pull optimeres til forskellige cellelinjer. Undersøge fluorescerende perle forskydninger før og efter hydrogel manipulation kan hjælpe med dette aspekt af teknikken. Også, mens teknikken tillader høj spatiotemporale observation af durotaktisk adfærd i individuelle celler, dette gør det en low-gennemløb analyse. Det er derfor vigtigt at påpege, at denne analyse også kan suppleres med andre teknikker med lavere manipulerbarhed, men højere gennemløb, såsom brug af silicagelrogeler med præ-formede gradienter af stivhed, til at analysere durotaktisk opførsel af større populationer af celler på én gang. Sammenfattende gør den høje grad af spatiotemporale kontrol af mekaniske signaler, der ydes af enkelt-celle durotaktisk analyse, det meget nyttigt til parsing af de molekylære mekanismer, der bidrager til durotaktisk opførsel af mange forskellige celletyper under mange Betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
