Summary
Mekaniska krafter är viktiga för att styra cell migration. Detta protokoll visar användningen av elastiska hydrogeler som kan deformeras med hjälp av en glasmikropipett och en micromanipulator för att stimulera celler med en lokal styvhet gradient för att framkalla förändringar i cellstruktur och migration.
Abstract
Durotaxis är den process genom vilken celler mening och reagera på gradienter av spänningar. För att studera denna process in vitro måste styvheten hos underlaget som ligger bakom en cell manipuleras. Medan hydrogeler med graderad styvhet och långsiktig migration analyser har visat sig användbara i durotaxis studier, omedelbara, akuta svar på lokala förändringar i substrat spänning tillåta fokuserad studie av enskilda cell rörelser och subcellulära signalering händelser. För att repeterbart testa cellernas förmåga att känna av och reagera på underliggande substrat stelhet, används en modifierad metod för applicering av akuta gradienter av ökad spänning till enskilda celler som odlas på deformerbara hydrogeler som möjliggör realtids manipulation av styrkan och riktningen av styvhet gradienter förmedlas på celler i fråga. Dessutom, genom att finjustera detaljerna och parametrarna för analysen, såsom form och dimensioner av mikropipett eller den relativa positionen, placering och riktning av den tillämpade gradienten, kan analysen optimeras för studier av alla mekaniskt känslig celltyp och system. Dessa parametrar kan ändras för att tillförlitligt ändra den tillämpade stimulansen och utöka funktionaliteten och mångsidigheten hos analysen. Denna metod möjliggör undersökning av både långsiktig durotaktisk rörelse samt mer omedelbara förändringar i cellulära signalering och morfologisk dynamik som svar på förändrade styvhet.
Introduction
Under de senaste decennierna har vikten av de mekaniska egenskaperna hos en cells miljö samlat allt större erkännande i cellbiologi. Olika vävnader och extracellulära matriser har olika relativa styvheter och, som celler migrerar i hela kroppen, de navigerar dessa förändringar, med hjälp av dessa mekaniska egenskaper för att vägleda dem1,2,3 , 4 , ,5 , 6 , 7. celler använder styvheten hos en given vävnad för att informera deras motila beteende under processer som utveckling, sårläkning, och cancermetastaser. Men de molekylära mekanismer som gör att känslan av och reaktionen på dessa mekaniska ingångar är i stort sett okänd1,2,3,4,5, 6 , 7.
För att studera de mekanismer genom vilka celler reagerar på fysiska Miljösignaler, måste styvheten eller styvheten hos det substrat som underliggande vidsittande celler manipuleras. I 2000, Chun-min Lo, Yu-Li Wang och kollegor utvecklat ett test8 där en enskild cells motila svar på förändrade mekaniska signaler kan testas direkt genom sträckning deformerbara extracellulära matrix (ECM)-belagda polyakrylamid hydrogeler på vilka cellerna var pläterade. Celler uppvisar en betydande preferens för att migrera mot styvare substrat, ett fenomen som de dubbade "durotaxis."
Sedan den ursprungliga rapporten i 2000, många andra tekniker har varit anställd för studiet av durotaxis. Branta styvhet gradienter har tillverkats av gjutning geler över stela funktioner såsom polystyren pärlor9 eller styv polymer inlägg10 eller genom att polymerisera underlaget runt kanterna på ett glas täckband11 för att skapa mekaniska " steg gränser ". Alternativt, hydrogeler med grundare men fast styvhet gradienter har tillverkats av en mängd olika metoder såsom gradienter av crosslinker skapas av mikroflödessystem enheter12,13 eller sida-vid-sida hydrogel lösning droppar av olika styvhet8, eller hydrogeler med fotoreaktiv crosslinker behandlas med graderad UV-ljus exponering för att skapa en linjär styvhet lutning14,15. Dessa tekniker har använts till stor effekt för att undersöka durotaktisk cellulära rörelse en masse över tiden. Emellertid, typiskt dessa funktioner är fabricerade i förväg av cellplätering och deras egenskaper förblir konsekvent under loppet av experimentet, förlitar sig på slumpmässiga cellförflyttning för provtagning av mekaniska gradienter. Ingen av dessa tekniker är mottagliga för observation av snabba förändringar i cellulära beteende som svar på akut mekanisk stimulans.
För att observera cellulära svar på akuta förändringar i den mekaniska miljön, enda cell durotaxis analyser erbjuder flera fördelar. I dessa analyser, enskilda celler ges en akut, mekanisk stimulans genom att dra det underliggande substratet bort från cellen med en glasmikropipett, därigenom införa en riktad gradient av cell-matris spänning. Förändringar i motila beteende, såsom hastighet eller riktning av migration, observeras sedan av levande cell faskontrast mikroskopi. Denna metod underlättar direkt observation av orsak och verkan samband mellan mekaniska stimuli och cell migration, eftersom det möjliggör snabb, iterativ manipulation av riktningen och omfattningen av spänningen lutning och bedömning av åtföljande cellulära svar i realtid. Vidare kan denna metod också användas för att mekaniskt stimulera celler som uttrycker fluorescerande fusions proteiner eller biosensorer för att visualisera förändringar i mängden, aktiviteten eller den subcellulära lokaliseringen av proteiner som misstänks vara involverade i mechanosensing och durotaxis.
Denna teknik har varit anställd av grupper som studerar durotaxis8,16 och beskrivs här som det har anpassats av Howe laboratorium för att studera det durotaktiska beteendet hos SKOV-3 äggstockscancer celler och de molekylära mekanismer som un durotaxis17. Dessutom beskrivs en modifierad metod för tillverkning av hydrogeler med ett enda, jämnt skikt av fluorescerande mikrosfärer nära cellkultur ytan; Detta underlättar visualisering och optimering av mikropipett-genererade stam gradienter och kan möjliggöra bedömning av cell kontraktilitet genom dragkraft mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av deformerbara Polyakrylamidhydrogels med inbäddade fluorescerande mikrosfärer
Anmärkning: Riktningar beskriver polymerisation av en 25 kPa hydrogel som är 22 μm i diameter och cirka 66 μm tjockt. Varje eller alla dessa parametrar kan ändras och riktningar för att göra det kan hittas i tabell 1 och i noterna17.
- Aktivering av glasbotten rätter eller täckband
- Förbered bind silan arbetslösning för aktivering av en glasbotten avbildning skålen eller en täckglas som passar in i en levande cell Imaging Chamber. Blanda 950 μL av 95% etanol, 50 μL isättika och 5 μL bindsilan (y-metakryloxypropyltrimethoxysilane).
Anmärkning: Med hjälp av en större botten täckslip jämfört med den övre täckglas kommer att ge ytterligare utrymme att arbeta när du förbereder gelen och kommer att underlätta positionering av glasmikropipett i senare steg. Om du använder en täckslip i stället för en glasbotten, rengör du täckglaset enligt beskrivningen i följande avsnitt. - Aktivera glasytan i 20-talet med en koronar stav och överlägg omedelbart 50 μl av bindnings lösningen för silan. Låt lösningen torka i 10 min.
- Skölj två gånger med 95% etanol, sedan två gånger med isopropanol och låt täckglas till lufttorka i ca 20 min.
Obs: aktivt glas kan förvaras i en exsickator upp till en vecka.
- Förbered bind silan arbetslösning för aktivering av en glasbotten avbildning skålen eller en täckglas som passar in i en levande cell Imaging Chamber. Blanda 950 μL av 95% etanol, 50 μL isättika och 5 μL bindsilan (y-metakryloxypropyltrimethoxysilane).
- Rengöring topp täckglas
- Rengör 22 mm övre täckglas genom att inkuberas i 2% HCl vid 70 ° c i 30 min, tvätta sedan i ddH2O i 10 min två gånger.
- Inkubera täckglas i en lösning av 2% kyvetten rengöringskoncentrat i DDH2o vid 50 ° c i 30 min, tvätta sedan i DDH2o i 10 min två gånger.
- Inkubera täckglas i ddH2O vid 90 ° c i 30 min, sedan i 70% etanol vid 70 ° c i 10 min, och sedan lufttorka vid 60 ° c i minst 2 h.
Anmärkning: Rengjorda täcklappar kan förvaras på obestämd tid i en ren exsickator.
- Fluorescerande Microsphere/Bead deposition på topp täckglas
- Sonikera beståndet lösning av fluorescerande mikrosfärer för 1 h i ett ultraljud vattenbad. Gör en fungerande pärla lösning genom att späda pärla lager 1:200 i 100% etanol och Sonikera igen för 1 h.
- 15 min innan pärla lösningen har avslutat sonikering, grundligt rengöra täckglas genom att placera dem vertikalt i en keramisk täckglas hållare och behandla med rum-luft plasma för 3 min i en bordsskiva plasma renare.
- För att underlätta hantering och förhindra glidning av täckglas under efterföljande steg, placera en bit parafilm i ett 60 mm petriskål eller en liknande behållare. Placera täckglapp i stabilisatorn och lätt knacka ner, vilket garanterar god kontakt mellan parafilm och täckslip.
- För en 22 mm täckslip, tillsätt 150 μL av arbets pärla lösningen till toppen av täckslip. Sug genast upp etanollösningen från sidan av täckglasdet, och lämna pärlorna på täckglas. Låt täckglan lufttorka.
Obs: mängden arbets pärla lösning läggas bör ~ 4 μl/cm2 och kan skalas för att rymma alla storlekar täckslip.
- Gjutning hydrogeler med inbäddade fluorescerande pärlor
- Bered Hydro gellösningen av akrylamid och BIS-akrylamid. Blanda lösningen enligt tabell 1och tillsätt sedan 2,5 μl 10% APS och 0,5 μl TEMED. Blanda väl. Omedelbart gå vidare till nästa steg.
Anmärkning: hydrogel-lösningsmeten kan ändras för att variera den ungas Modulus eller styvhet hos Hydrogelen genom att ändra förhållandet mellan akrylamid och BIS-akrylamid som visas i tabell 1. Dessa värden har verifierats för användning i Howe laboratorium med atomkraft mikroskopi men bör bekräftas inom en institution. - Omedelbart efter att hydrogel lösningen, tillsätt en 25 μL droppe till den aktiverade sidan av glasbotten skålen eller botten täckglas, sedan omedelbart placera pärlbelagda täckglas på lösningen, pärla sida ner. Att kontakta Drop med den bortre sidan av täckslip följt av långsam sänkning hjälper till att undvika att fånga luftbubblor i hydrogel.
Observera: hydrogelens höjd bör vara väl inom arbetsavståndet för objektivlinsen som ska användas i det senare experimentet. En hydrogelhöjd på 66 μm fungerar bra för de flesta system. Storleken på hydrogel kan skalas genom att tillsätta mer eller mindre hydrogel lösning beroende på storleken på täckslip. För att beräkna lämplig volym av hydrogel lösning, Använd ekvationen för volymen av en cylinder, V = πr2h där r är täckslip radie och h är önskad hydrogel höjd. Typiskt, denna beräkning förutspår med rimlig noggrannhet den faktiska höjden av hydrogel, mätt genom att förbereda en gel med pärlbelagda täckglas på både toppen och botten och med hjälp av ett konfokala Mikroskop för att mäta avståndet mellan de två pärlplan. Det har emellertid konstaterats att hydrogelens faktiska höjd kan avvika från denna beräkning med ± 20 μm (t. ex. beroende på tjockleken och tillverkaren av den övre glas täckglaset). Direkt mätning av gelhöjd med den metod som beskrivs ovan rekommenderas. - Låt gelen att polymerisera i 30 min, ta sedan bort den övre täckslip försiktigt med tång. Lägga till 50 mM HEPES pH 8,5 till skålen kan underlätta avlägsnande. Tvätta i 5 min i 50 mM HEPES pH 8,5 tre gånger.
- Bered Hydro gellösningen av akrylamid och BIS-akrylamid. Blanda lösningen enligt tabell 1och tillsätt sedan 2,5 μl 10% APS och 0,5 μl TEMED. Blanda väl. Omedelbart gå vidare till nästa steg.
- Hydrogel aktivering och extracellulär matris beläggning
- Aktivera hydrogelytan genom att inkuberas i 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoate) i 50 mM HEPES pH 8,5. Exponera omedelbart för en UV-ljusbåge i ett slutet område.
Obs: skydda sulfo-sanpah från ljus före aktiveringen. För en 400 W lampa, placera gelen 10 cm bort från glödlampan i ljudosan och belysa för 100 s. Sulfo-SANPAH-lösningen kommer att ändras från ljust orange till mörkbrun. - Tvätta i 5 min i 50 mM HEPES pH 8,5 tre gånger.
Observera: hydrerade geler kan förvaras vid 4 ° c i upp till en vecka. - Inkubera den aktiverade Hydrogelen i 20 μg/ml Fibronektin i 50 mm Hepes pH 8,5 för 1 h vid 37 ° c.
- Aspirera på Fibronektin-lösningen och tvätta i 5 minuter i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger. Sterilisera hydrogel och locket på skålen i 15 min under UV-ljus i en vävnad kultur huva med en låg volym av PBS. Tvätta en gång i steril PBS.
Anmärkning: andra typer av ECM-protein kan användas för att belägga hydrogel inklusive kollagen och laminin.
- Aktivera hydrogelytan genom att inkuberas i 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoate) i 50 mM HEPES pH 8,5. Exponera omedelbart för en UV-ljusbåge i ett slutet område.
2. bordläggningen celler
- Tillsätt 3 mL media som innehåller 21 000 celler för att fylla en 60 mm maträtt för en slutlig celltäthet av ~ 1000 celler/cm2. Justera sådd tätheten som behövs för att förhindra trängsel och tillåta fri förflyttning av enskilda celler.
- Låt cellerna återhämta sig vid 37 ° c i minst 4 h och för upp till 18 h före avbildning. Förbered för avbildning genom att skölja med Imaging Media två gånger innan du lägger till Imaging media. Låt cellerna jämvikt i minst 30 min före avbildning.
Anmärkning: skärm Media villkor i förväg för att fastställa villkor som optimerar migreringen i den cellrad som används. För SKOV-3 celler, DMEM utan fenol röd, innehållande 20 mM HEPES och 12,5 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor stimulerar mest migration. Optimala förhållanden för Ref52 celler är Ringers buffert med 10% foster bovint serum (FBS) och 25 ng/mL trombocytderivat tillväxtfaktor.
3. beredning av glasmikropipett: pipettdragning och smide
- Drag 100 mm lång borosilikatglas micropipetter med en 1,0 mm Utvändig och 0,58 mm innerdiameter i en tvåstegsprocess för att få en Kona över 2 mm som minskar till ~ 50 μm i den första millimeter och sträcker sig till en lång, parallell 10 μm diameter röret i den sista millimeter.
- Ladda drog Pipettera till en microforge. Forma Pipettera att ha en 15 μm trummade spets som är innesluten i slutet av en 250 μm sektion böjd vid en ~ 35 ° vinkel från resten av Pipettera. Den ungefärliga diametern vid kröken bör vara runt 30 μm för att ge styrka till spetsen.
Obs: taper-och spets dimensionerna kan justeras för att korrekt Applicera önskad kraft (se steg 5). Att dra Mikropipetter vid 65 ° c för det första steget i 3 mm och 60 ° c för det andra steget ger de dimensioner som beskrivs i steg 3,1. Resultat med olika Pipettera-avdragare kan variera. - Sterilisera mikropipetten i 70% etanol före användning.
4. positionering av mikromanipulatorn och mikropipetten
- Ta bort skålen locket och ladda skålen på mikroskopet scenen och centrum. Använd ett 10X eller liknande låg förstoringsgrad mål. Täck media med mineralolja för att förhindra avdunstning av media.
-
Sätta in drog Pipettera
- Sätt i den dragna Pipettera i micropipett slida, pekar kroken ner mot skålen. Spetsen på kroken kommer att vara den lägsta punkten när den sänks till gelen.
- Sätt in skidan i mikromanipulator och justera tills spetsen på Pipettera är centrerad över objektivlinsen i både X-och Y-riktningar.
- Sänk Pipettera med grov manipulator tills det bara vidrör ytan av vätskan.
- Med hjälp av faskontrast eller brightfield, fokusera mikroskopet på pärlskiktet på toppen av gelen. Detta kommer att vara referensplanet.
- Att se till att målet är inte riskerar att träffa provet eller scenen, sätta fokus ovanför gelen för att hitta spetsen på mikropipett, med små justeringar av grov manipulator i X och Y riktningar för att kasta skuggor på fokalplanet. Sänk endast mikropipetten när det är säkert att spetsen på Pipettera är i synfältet.
- Se till att den avtrummade spetsen på micropipett pekar nedåt genom att vrida Pipettera i slidan eller rotera slidan i micromanipulatorn tills spetsen är vinkelrät mot fokalplanet. Upprepa steg 4,4 och 4,5 efter behov. Fokusera på spetsen av pipet.
- Fokusera tillbaka till det översta pärlskiktet av gelen för att mäta hur långt Pipettera är från gelytan. Fokusera tillbaka upp till ett plan som är en del väg mellan gelen och spetsen på pipet. Sänk långsamt Pipettera för att nå det mellanliggande fokalplanet.
- Upprepa steg 4,6 tills mycket svaga skuggor från spetsen av mikropipett kan uppskattas när du fokuserar på hydrogel. Öka till den näst högsta förstoringen.
- Sänk mikromanipulatorn tills skuggor och refraktioner av själva spetsen av mikropipett kan uppskattas inom pärlskiktet fokalplan.
- Öka förstoringen till det som kommer att användas i experimentet. Sänk Pipettera tills det svävar precis ovanför ytan av hydrogel.
5. kalibrering av micromanipulator och kraftproduktion
- I fas eller brightfield, Sänk den svävande mikropipetten för att vidröra ytan på Hydrogelen. Se hur Pipettera ser ut vid kontakt med Hydrogelen. Fortsätt att sänka mikropipetten i Z tills justeringar i X och Y orsakar drag och böjning av Hydrogelen i dessa riktningar. Använd mikrosfärer eller närliggande celler som förvaltnings Marks.
Anmärkning: om mikromanipulatorn är kopplad till fas kondensor armen eller bänken och inte själva prov stadiet, ska du alltid frigöra gelen innan du flyttar scenen för att undvika att Pipettera eller störande celler bryts. Om Pipettera bryter, gå tillbaka till steg 3 och steg 4. - Hitta ett område som saknar celler att engagera gelen. Dra den i alla riktningar och få bekväm med hur mikromanipulation översätter till deformation av gelen.
- Ta fluorescerande bilder av pärla fältet utan manipulation, med Pipettera engagera gelen, och med engagerade Pipettera dra gelen. Upprepa detta flera gånger med bra noter om skalstrecken på micromanipulator, hur Pipettera spetsen ser i fas eller brightfield vid varje steg av att dra, och avståndet spetsen rör sig med hjälp av att manipulation.
- Använd imagej som tidigare beskrivits16,17 för att beräkna relativ pärla förskjutningar och kraft appliceras på pärlorna genom att jämföra null pärla fältet till pärla fältet utan Pipettera engagemang, pärla fältet med gelen engagerad, och Pulled gel.
- För att finjustera spännan stimulans, jämföra kraft ansökan med olika mikropipett spets dimensioner, avstånd från cellen, eller avstånd som dras av micromanipulator från första punkten av touchdown. Effekten av den mikropipett spets dimension på kraft applicering gir stor böjligheten till förbrukaren utom också bevisar nöden till generera styrka karta för ny micropipettes, afton när dimensionen och forma nära likna förut kalibrerat spets.
6. genomföra durotaxis-analysen
- Innan du utför experimentet, öva att engagera gelen nära en cell och observera deformationen av cellen när mikromanipulatorn flyttas.
- Övervaka en grupp celler som har tydlig polaritet och verkar röra sig i 30 minuter för att identifiera celler som rör sig på ett riktat sätt.
- Välj en cell som rör sig i en enda, tydlig riktning och övervaka den med önskad bildrutehastighet i ytterligare 30 min.
- Om bestämning av krafter som utövas på cellen eller spänningen utövas av cellen önskas, fånga pärla fält bilder vid varje förvärv. Om cellen ändrar sin riktning under övervakning, Välj en annan cell för att övervaka eftersom detta kommer att göra det svårt att avgöra effekten av stimulering.
- Engagera Hydrogelen cirka 50 μm från cellen. Placera Pipettera framför den nära sidan av framkant och flytta micromanipulator så att gelen deformeras ortogonalt till cellens färdriktning. Observera cellen över tiden som den reagerar på den akuta, lokala gradienten av stelhet.
Obs: tidpunkten som anges här är effektiv när övervakning SKOV3 eller Ref52 fibroblaster, dock intervallet och övergripande tid kursen bör justeras för att passa den celltyp och biologisk händelse observeras. Om ihopparning med fluorescens-mikroskopi, pausa fluorescerande förvärv omedelbart före steg 6,5., Använd faskontrast eller brightfield för att placera mikropipett och dra, och starta om fluorescerande förvärv omedelbart efter. - Om Pipettera glider eller om lutningen annars är avslappnad eller släppt, hitta en ny cell genom att upprepa steg 6,2 och 6,3.
7. bestämning av det durotaktiska migrations svaret
- Använda ImageJ19 eller en annan bildanalysprogram, beräkna sväng vinkeln genom att dra en linje mellan mitten av den ledande kanten av cellen vid 0 min och 30 min post Monitor (återspeglar cellens ursprungliga bana) och en annan linje mellan mitten av framkant strax före och 80 min efter stimulering och mäta vinkeln mellan dessa två linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att förbereda Mikropipetter (figur 1) och normalisera kraft genereringen av handtagen (figur 2 och figur 3) som beskrivits ovan, har optimala durotaktiska förhållanden identifierats för flera cellinjer. Med hjälp av denna teknik, som beskrivs i figur 4, både SKOV-3 äggstockscancer celler17 och Ref52 råtta embryonala fibroblaster (figur 5) gå mot ökad stelhet i lutningar tillämpas av en glasmikropipett. Förutom durotaxis kan denna metod användas för att studera dynamiska signal händelser med hjälp av fluorescerande biosensorer och markörer. Till exempel, struktur och signalering inom Focal vidhäftnings strukturer kan observeras vid durotaktisk stimulering. Vinculin Tension sensor (VinTS) är en FRET-baserad biosensor som lokaliserar till Focal sammanväxningar, möjliggör fluorescerande observation av Focal vidhäftning dynamik och mätning av förändringar i spänningar inom dessa strukturer19. Ref52 celler som övergående uttrycker Vints på 125 kPa polyakrylamidgeler visar bildandet av fokala adhesioner i riktning mot stretch över tidsperioden 40 min (figur 6a). FRET analys20 avslöjar att vinculin lokaliserad till Focal sammanväxningar erfarenheter en omedelbar förändring i spänningar när de presenteras med akut durotaktisk stimulering (figur 6b) utvidga nyttan av denna analys till observation av subcellulära signalering händelser som svar på durotaktisk stimulering.
Figur 1. Diagram över typiska dragna (A) och smidda (B) Mikropipetter. A)Mikropipetter dras med hjälp av ett två stegs protokoll för att uppnå en Kona från 1 mm till 10 μm över 2 mm. (B) Mikropipetter lastas sedan in i microforge och deras spetsar är böjda, inneslutna och förkortade så att de sista 250 μm av micropipett är böjd på en ~ 35 ° vinkel och avsmalnar från ~ 30 μm till en rundad spets som mäter ~ 15 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Förbättrat pärlfält efter etanol beläggning jämfört med traditionell metod med poly-L-lysin. Representativa hydrogel pärla fält från Poly-L-lysin och etanol (EtOH) avdunstning täckglas beläggning metoder med hjälp av gul-grön, röd, och mörkt röda fluorescerande pärlor. Skalbar: 25 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Generering av Force Map för ett exempel durotaktisk stretch. (A) fluorescerande mikrosfärer före och efter (pseudo-färgade gröna respektive röda) deformeras Hydrogelen med en mikropipett (placerad bortom panelens högra kant). Skalbar: 25 μm. Förskjutnings vektorer (B) och förskjutnings värmekarta (C) mellan null och dragna pärla fält som genereras av dragkraft Microscopy plugins i imagej Markera lutningen på pärla avböjning och hydrogel stam. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Schematiska av durotaxis analys och bestämning av avböjning vinkel. (A) en cell observeras i minst 30 minuter för att bestämma dess ursprungliga bana. B) mikropipetten är placerad ortogonalt till cellens bana, 50 μm från cellkanten. Hydrogelen är förlagd av mikropipetten så att förflyttning av mikropipetten kommer att utöva kraft på hydrogelens yta. (C) mikropipetten dras ytterligare 20 μm bort från cellen, ortogonalt till cellens bana vilket skapar en akut, lokal gradient av spänningar (betecknas i blått) som ökar mot mikropipett. (D) cellen observeras med tiden när den navigerar den tillämpade gradienten. (E) i imagej eller ett bildanalysprogram är den ursprungliga banan (streckad linje) markerad med en linje dragen från mitten av cellen genom mitten av framkant i den första bildrutan. Den slutliga banan (heldragen linje) markeras med en linje dragen efter att cellen har tillåtits att navigera i den applicerade spänningsgradienten. Vinkeln mellan dessa två linjer mot stimulans kallas "svängvinkel," markerade här med θ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Råtta embryonala fibroblaster flytta mot regioner av ökad substrat stelhet i durotaxis. Tidsförlopp visar durotaktisk förflyttning av en Ref52 cell 10 min före pull (panel 1), 1 min före pull (panel 2), vid tidpunkten för pull (panel 3), och 1 h efter pull (panel 4). Pil indikerar sträck riktning. Skalbar: 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Protein lokalisering och-aktivitet under durotaktisk stimulering med hjälp av fluorescerande markörer eller biosensorer. Ref52 celler som övergående uttrycker vinculin Tension sensor (Vints)19 migrera på 125 kPa polyakrylamidgeler presenteras med akut durotaktisk stimulering. (A) efter stimulering bildas nya fokala adhesioner i riktning mot stretch när cellerna omorienterar sig längs styvhets lutningen. För 2 10 min perioder, med början 20 min före mekanisk stimulering och 21 min efter stimulering, cellmorfologi (topp) och fokal vidhäftnings bildning (botten) övervakades. Röd färg anger den första tidspunkten inom tidsperioden och grön färg anger tidspunkten 10 min senare. Nya fokala sammanväxningar som bildas inom 10 min perioden visas i grönt. Innan stimulering, nya fokala sammanväxningar form i färdriktningen. Efter stimulering bildas nya fokala adhesioner i riktning mot stretch. Pilen anger riktningen för stretch. Pilspetsar indikerar områden med fokala sammanväxningar bildade över det 10 min period. Skalbar: 25 μm. (B) FRET analys av Vints fluorescens indikerar en förändring i spänningar inom fokala adhesioner proximalt att durotaktisk stretch. Kontur av cellmembran före och efter stretch Markera deformation av cell vid stimulering. Pilspetsar indikerar exempel på Focal sammanväxningar upplever förändringar i FRET förhållandet på stretch. Skalbar: 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Önskad hydro gel stelhet | 3 kPa | 25 kPa | 125 kPa |
| 7,5% akrylamid | 100 μL | 100 μL | 160 μL |
| 0,5% bis-akrylamid | 10 μL | 100 μL | 100 μL |
| ddH2O | 287 μL | 197 μL | 137 μL |
Tabell 1. Akrylamidgel lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Demonstreras här är en repeterbar, encelliga durotaxis test som möjliggör bedömning av en cells förmåga att förändra sin migration beteende som svar på akuta mekaniska signaler. Denna teknik kan också användas i kombination med fluorescensmikroskopi och lämpliga fusions proteiner eller biosensorer för att undersöka subcellulär signalering och cytoskeletala händelser inom några sekunder efter mekanisk stimulering eller över en längre tidsskala under durotaktisk rörelse. Förstå en cells relation till sin omgivning innebär studiet av effekterna av både kemiska och mekaniska aspekter av denna miljö. Även potentiellt svårt att behärska, detta durotaxis analysen kan allmänt användas för att förstå cellulära svar på förändringar i dess mekaniska mikromiljö.
Betydelse med avseende på befintliga metoder
Som tidigare nämnts, denna mikropipett-baserad metod för durotaktisk stimulering är mycket manipulerbar, vilket möjliggör en hög grad av spatiotemporal kontroll över mekaniska stimuli, en stor fördel jämfört med andra tekniker, såsom pre-bildade linjär eller steg-gradienter av styvhet. Omfattningen och riktningen av de förmedlade stammen gradienter kan visualiseras genom att spåra förskjutning av fluorescerande pärlor inbäddade i hydrogel, nära cellkulturen ytan.
Begränsa dessa relaterat markörer till ett enda lager strax under kulturen ytan ökar noggrannheten i denna spårning. Mikrosfärer som ligger under planet av deformationen (förmedlas antingen av mikropipett eller, för dragning kraft mikroskopi, genom cellulära kontraktilitet), som skulle inträffa med att blanda mikrosfärer jämnt i hela hydrogel, kommer att röra sig mindre än i-Plane mikrosfärer, vilket kan leda till underskattning av tillämpade krafter. Också, denna modifiering är lättare att utföra och mer tillförlitlig än metoder där pärlor är överlagras i ett extremt tunt skikt av polyakrylamid gjutna ovanpå en förformad gel21 eller föras till hydrogel ytan genom gravitations-Assisted sedimentering22 och ger en jämnare spridning av pärlor över hydrogel än tidigare beskrivna metoder17,23.
Modifiering och framtida tillämpningar
Detaljerna i denna analys kan ändras för att bäst passa cell linjen av intresse. Till exempel kan en mängd olika extracellulära matrix molekyler (t. ex. kollagen i, kollagen IV, laminin) eller andra adhesiva ligander användas för att funktionalisera hydrogel. Även hydrogelens start styvhet kan lätt höjas eller sänkas genom att justera förhållandet mellan akrylamid och BIS-akrylamid (se tabell 1). Genom att ändra dimensionerna på mikropipettspetsen och omfattningen av drag, kan denna analys optimeras för att ge en repeterbar och effektiv durotaktisk stimulans för den aktuella celltypen.
Kritiska steg och felsökning
Endast celler som följer en stadig, linjär bana av migration före hydrogel manipulation bör stimuleras för att säkerställa att förändringar i banan beror på den mekaniska stimulans och inte slumpmässiga fluktuation. Försiktighet måste iakttas för att tillverka en glasmikropipett som engagerar hydrogel ytan utan att halka men inte riva gelen när den dras. Det är viktigt att tillämpa en stadig, konstant sträcka till hydrogel under experimentet för att få rena resultat vilket innebär att användaren bör praktiseras på att placera och flytta mikropipett innan du stöter på en cell. Varje oavsiktlig förflyttning av mikropipett som leder till förändringar i spänningsgradienten kan påverka cellens förmåga att durotax. Likaså bör manipulation av gelen praktiseras med varje ny micropipett som är förfalskat som små förändringar i Pipettera form kan orsaka Pipettera/gel interaktion att variera.
Underlåtenhet att placera mikropipett inom mikroskopiskt synfält innan öka förstoringen kan leda till oavsiktlig brott på ömtåligt glas spets. Se till att spetsen är känd innan du sänker mikropipetten med mikromanipulatorn och höjden och X-Y-positionen. Övervaka alltid mikropipettens position för att minska risken för brott. Det rekommenderas att förstoringen minskas tillbaka ner till 10X för varje ny micropipett lastas in i micromanipulator som små rörelser av micromanipulator och Pipettera slida kan leda till stora uppenbara förändringar i positionen för den nyligen laddade mikropipett.
Innan du hittar celler att iaktta, är det viktigt att först testa micropipett för att bekräfta att det kommer att engagera hydrogel som förväntat och att den är lämplig för att tillämpa önskad sträcka. Att hitta tips dimensioner som passar experimentet och celltypen är avgörande för framgång vid applicering av durotaktisk stimulering. Änden på mikropipetten bör avrundas tillräckligt så att den inte bryts genom gelen, men inte så rundade att den inte grepp. Om Pipettera inte dra gel effektivt, det kan glida längs ytan. Formen på mikropipett spetsen kan vara alltför rundade för att korrekt engagera med gelytan. Dimensionerna i själva spetsen på mikropipetten bör justeras tills fast, stadig kontakt kan uppnås konsekvent. I vissa fall där mikropipetten glider över gelytan kan det vara nödvändigt att sänka mikropipetten ytterligare i Hydrogelen för att få mer dragkraft. Om micropipett tårar genom gel, spetsen kan vara för fin eller för skarp. Gel Riva kan också indikera för mycket kraft appliceras medan du drar. Mikropipetten bör höjas något för att minska gelen deformation och dra kortare sträckor.
Ofta, om cellen eller kanten av cellen dras ur fokus av micropipett, spetsen på mikropipett är engagerad för nära cellen eller sträckan är för kraftfull. Flytta mikropipetten vidare från cellen, bara något deformeras cellen i X-Y-plan. Flytta cellen ur fokus kommer inte bara göra cellulära händelser omöjliga att övervaka och orsaka optiska avvikelser, men det kommer att orsaka cellen att uppleva mer stimulering än 2-dimensionell spänning lutning avsedd.
Viktigast är att det är viktigt att registrera och analysera endast svar som har konsekvent durotaktisk manipulation med minimal mänskliga fel. Om sänkningen av spetsen är oprecisa eller om mikropipetten flyttas, kommer resultaten av experimentet att grumlad. Eftersom denna analys är komplex och många steg är benägna att fel, måste försiktighet iakttas vid varje steg för att undvika oavsiktliga förändringar i stimulering av celler. Fel vid varje steg kan leda till inkonsekvent stretch ansökan och opålitliga resultat.
Begränsningar
Det finns begränsningar för denna teknik som bör övervägas. Mest framträdande, noggrann smide och manipulation av glasmikropipetter kan presentera en brant inlärningskurva för nya användare. Dessutom måste hydrogeldragens position och storlek optimeras för olika cellinjer. Undersöka fluorescerande pärla förskjutningar före och efter hydrogel manipulation kan hjälpa till med denna aspekt av tekniken. Också, medan tekniken tillåter hög spatiotemporal observation av durotaktiska beteende i enskilda celler, detta gör det en låg-genomflöde analys. Det är därför viktigt att påpeka att denna analys också kan kompletteras med andra tekniker med lägre manipulabilitet men högre genomströmning, såsom att använda hydrogeler med förformade gradienter av styvhet, för att analysera det durotaktiska beteendet hos större populationer av celler på en gång. Sammanfattnings, den höga graden av spatiotemporal kontroll av mekaniska signaler som ges av encelliga durotaktiska analysen gör det mycket användbart för att analysera de molekylära mekanismer som bidrar till det durotaktiska beteendet hos många olika celltyper under många Villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
