Summary
कक्ष प्रवास को नियंत्रित करने के लिए यांत्रिक बल महत्वपूर्ण होते हैं। इस प्रोटोकॉल लोचदार hydrogels कि एक गिलास micropipette और एक micromanipulator का उपयोग कर विकृत किया जा सकता है के उपयोग को दर्शाता है एक स्थानीय कठोरता ढाल के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए सेल संरचना और प्रवास में परिवर्तन प्रकाश में लाना.
Abstract
ड्यूरोक्सिस वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिकाएं तनाव की प्रवणता को समझती हैं और प्रतिक्रिया देती हैं। इन विट्रो में इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, एक सेल के अंतर्निहित सब्सट्रेट की कठोरता में हेरफेर किया जाना चाहिए। जबकि वर्गीकृत कठोरता और लंबी अवधि के प्रवास परख के साथ hydrogels durotaxis अध्ययन में उपयोगी साबित कर दिया है, तत्काल, सब्सट्रेट तनाव में स्थानीय परिवर्तन के लिए तीव्र प्रतिक्रियाओं व्यक्तिगत सेल आंदोलनों और subcellular संकेतन घटनाओं के ध्यान केंद्रित अध्ययन की अनुमति. अंतर्निहित सब्सट्रेट कठोरता को व्यक्त करने और प्रतिक्रिया करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का बार-बार परीक्षण करने के लिए, विकृत hydrogels पर सुसंस्कृत अलग-अलग कोशिकाओं के लिए बढ़ी हुई तनाव के तीव्र ग्रेडिएंट के आवेदन के लिए एक संशोधित विधि का उपयोग किया जाता है जो वास्तविक समय के लिए अनुमति देता है प्रश्न में कोशिकाओं पर प्रदान की गई कठोरता ढाल की शक्ति और दिशा का हेरफेर। इसके अतिरिक्त, ठीक ट्यूनिंग विवरण और परख के मापदंडों, जैसे आकार और micropipette या रिश्तेदार स्थिति, स्थान, और लागू ढाल की दिशा के आयाम के रूप में, परख किसी भी यंत्रवत् के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता संवेदनशील सेल प्रकार और प्रणाली. इन मापदंडों मज़बूती से लागू उत्तेजना बदलने के लिए और परख की कार्यक्षमता और बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए बदला जा सकता है. इस विधि दोनों दीर्घकालिक durotactic आंदोलन की परीक्षा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर संकेतन और कठोरता बदलने के जवाब में रूपात्मक गतिशीलता में और अधिक तत्काल परिवर्तन की अनुमति देता है.
Introduction
पिछले कुछ दशकों में, एक सेल के पर्यावरण के यांत्रिक गुणों के महत्व सेल जीव विज्ञान में बढ़ती मान्यता बढ़ गई है. विभिन्न ऊतकों और extracellular matrices अलग रिश्तेदार कठोरता है और, के रूप में कोशिकाओं को पूरे शरीर में स्थानांतरित, वे इन परिवर्तनों नेविगेट, इन यांत्रिक गुणों का उपयोग करने के लिए उन्हें मार्गदर्शन1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7.कोशिकाओं को किसी दिए गए ऊतक की कठोरता का उपयोग करने के लिए इस तरह के विकास के रूप में प्रक्रियाओं के दौरान उनके गतिशील व्यवहार को सूचित, घाव भरने, और कैंसर मेटास्टेसिस. तथापि, आण्विक तंत्र जो इन यांत्रिक आगतों की अनुभूति और अनुक्रिया की अनुमति देते हैं, काफी हद तकअज्ञात1,2,3,4,5, 6 , 7.
तंत्र है जिसके माध्यम से कोशिकाओं शारीरिक पर्यावरण संकेतों का जवाब का अध्ययन करने के लिए, कठोरता या उपस्तर अंतर्निहित अनुयायी कोशिकाओं की कठोरता हेरफेर किया जाना चाहिए. 2000 में, चुन-मिन लो, यू-ली वांग और उनके सहयोगियों ने एक परख8 विकसित की जिससे यांत्रिक संकेतों को बदलने के लिए एक व्यक्तिगत सेल की गतिशील प्रतिक्रिया को सीधे विकृत extracellular मैट्रिक्स (ECM) लेपित polyacrylamide खींच कर परीक्षण किया जा सकता है हाइड्रोजेल्स जिस पर कोशिकाओं को चढ़ाया गया था। कोशिकाओं कठोर substrates की ओर पलायन के लिए एक महत्वपूर्ण प्राथमिकता दर्शाती है, एक घटना वे "durotaxis" करार दिया.
2000 में मूल रिपोर्ट के बाद से, कई अन्य तकनीकों durotaxis के अध्ययन के लिए नियोजित किया गया है. खड़ी कठोरता ढाल ऐसे polystyrene मोती9 या कड़ी बहुलक पदों10 के रूप में कठोर सुविधाओं पर जैल कास्टिंग द्वारा गढ़ा गया है या एक गिलास coversps11 के किनारों के आसपास substrate polymerizing द्वारा यांत्रिक बनाने के लिए ' कदम सीमा'. वैकल्पिक रूप से, उथले लेकिन निश्चित कठोरता ढाल के साथ hydrogels ऐसे microfluidic उपकरणों द्वारा बनाई गई crosslinker के gradients के रूप में तरीकों की एक किस्म के द्वारा निर्मित किया गया है12,13 या पक्ष द्वारा साइड hydrogel समाधान बूंदों भिन्न कठोरता8, या प्रकाश-सक्रिय क्रॉसलिंकर के साथ हाइड्रोजेल्स का एक रेखीय कठोरता ढाल14,15बनाने के लिए वर्गीकृत यूवी प्रकाश जोखिम के साथ इलाज किया जाता है . इन तकनीकों के महान प्रभाव के लिए समय के साथ सामूहिक रूप से durotactic सेलुलर आंदोलन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, आम तौर पर इन सुविधाओं सेल चढ़ाना के अग्रिम में निर्मित कर रहे हैं और उनके गुण प्रयोग के पाठ्यक्रम पर लगातार रहते हैं, यांत्रिक gradients के नमूने के लिए यादृच्छिक सेल आंदोलन पर निर्भर. इन तकनीकों में से कोई भी तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में सेलुलर व्यवहार में तेजी से परिवर्तन के अवलोकन के लिए सक्षम हैं.
यांत्रिक वातावरण में तीव्र परिवर्तन के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए, एकल सेल durotaxis assays कई फायदे प्रदान करते हैं. इन परखों में, व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक कांच माइक्रोपिपेट के साथ सेल से दूर अंतर्निहित सब्सट्रेट खींच कर एक तीव्र, यांत्रिक उत्तेजना दी जाती है, जिससे सेल-मैट्रिक्स तनाव की दिशात्मक ढाल शुरू होती है। गतिशील व्यवहार में परिवर्तन, जैसे गति या प्रवास की दिशा, तो लाइव सेल चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है. यह दृष्टिकोण यांत्रिक उत्तेजनाओं और सेल प्रवास के बीच कारण और प्रभाव संबंधों के प्रत्यक्ष अवलोकन की सुविधा प्रदान करता है, क्योंकि यह तीव्र गति की अनुमति देता है, तनाव प्रवणता और परिणामी के मूल्यांकन की दिशा और परिमाण के पुनरावर्ती हेरफेर वास्तविक समय में सेलुलर प्रतिक्रियाओं. इसके अलावा, इस विधि भी यंत्रहीन संलयन प्रोटीन या biosensors व्यक्त करने के लिए मशीनों में शामिल होने के लिए संदिग्ध प्रोटीन की मात्रा, गतिविधि, या subcellular स्थानीयकरण में परिवर्तन कल्पना करने के लिए यांत्रिक रूप से कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ड्यूरोक्सिस।
इस तकनीक के समूहों द्वारा नियोजित किया गया है जो durotaxis8,16 का अध्ययन और यहाँ वर्णित है के रूप में यह Howe प्रयोगशाला द्वारा अनुकूलित किया गया है SKOV-3 डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं और आणविक तंत्र के durotactic व्यवहार का अध्ययन है कि अल्पद्युत द्वन्द्व17| इसके अतिरिक्त, एक संशोधित विधि सेल संस्कृति की सतह के पास एक एकल, फ्लोरोसेंट microspheres की भी परत के साथ hydrogels के निर्माण के लिए वर्णित है; यह माइक्रोपिपेट जनित तनाव ग्रेडिएंट के दृश्य और अनुकूलन की सुविधा प्रदान करता है और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल अनुबंधता के मूल्यांकन की अनुमति दे सकता है।
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Protocol
1. एम्बेडेड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर के साथ विरूप्य पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स का निर्माण
नोट: दिशाओं में 25 केपीए हाइड्रोजेल के बहुलकन का वर्णन किया गया है जो व्यास में 22 डिग्री उ और लगभग 66 डिग्री मीटर गाढ़ा है। इनमें से प्रत्येक या सभी पैरामीटरों को संशोधित किया जा सकता है और ऐसा करने के लिए निर्देश तालिका 1 और नोट्स17में पाए जा सकते हैं।
- कांच के नीचे व्यंजन या कवरलिप्स का सक्रियण
- एक ग्लास-नीचे इमेजिंग डिश या एक कवरस्लिप के सक्रियण के लिए बाइंड सिलेन कार्य समाधान तैयार करें जो लाइव-सेल इमेजिंग चैम्बर में फिट बैठता है। 95% इथेनॉल का 950 डिग्री सेल्सियस, हिमनदीय एसिटिक एसिड का 50 डिग्री सेल्सियस, और 5 $L बाइंड सिलेन (y-methacryloxypropymethoxysilane) मिलाएं।
नोट: शीर्ष coverslip की तुलना में एक बड़ा नीचे कवरस्लिप का उपयोग जेल की तैयारी करते समय काम करने के लिए अतिरिक्त कमरे दे देंगे और बाद के चरणों में कांच micropipette स्थिति की सुविधा होगी। इसके अलावा, यदि कांच-नीचे इमेजिंग डिश के बजाय कवरस्लिप का उपयोग किया जाए, तो निम्न अनुभाग में वर्णित कवरस्लिप को साफ करें। - एक कोरोना छड़ी के साथ 20 s के लिए कांच की सतह को सक्रिय करें और तुरंत बाइंड silane काम कर समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस ओवरले. 10 मिनट के लिए सूखी समाधान की अनुमति दें.
- 95% इथेनॉल के साथ दो बार कुल्ला, तो isopropanol के साथ दो बार और फिर लगभग 20 मिनट के लिए airdry करने के लिए coverslips अनुमति देते हैं.
नोट:सक्रिय कांच एक desiccator में एक सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.
- एक ग्लास-नीचे इमेजिंग डिश या एक कवरस्लिप के सक्रियण के लिए बाइंड सिलेन कार्य समाधान तैयार करें जो लाइव-सेल इमेजिंग चैम्बर में फिट बैठता है। 95% इथेनॉल का 950 डिग्री सेल्सियस, हिमनदीय एसिटिक एसिड का 50 डिग्री सेल्सियस, और 5 $L बाइंड सिलेन (y-methacryloxypropymethoxysilane) मिलाएं।
- शीर्ष कवरलिप्स की सफाई
- साफ 22 मिमी शीर्ष coverslips में 2% एचसीएल में 70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए incubating द्वारा, तो ddH2O में धोने के लिए 10 मिनट दो बार.
- 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर डीएच2ओ में 2% cuvette सफाई ध्यान केंद्रित के समाधान में कवरलिप्स इनक्यूबेट करें, फिर 10 मिनट दो बार के लिए डीएच2ओ में धोएं।
- 30 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर डीएच2ओ में कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें, फिर 70 डिग्री एथेनॉल में 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर, और फिर कम से कम 2 डिग्री सेल्सियस के लिए हवा सूखी।
नोट: साफ coverss अनिश्चित काल के लिए एक साफ desiccator में संग्रहीत किया जा सकता है.
- शीर्ष कवरलिप्स पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर/बीड निक्षेपण
- एक अल्ट्रासोनिक पानी स्नान में 1 एच के लिए फ्लोरोसेंट microspheres के शेयर समाधान Sonicate। 100% इथेनॉल में मनका शेयर 1:200 को कम करके एक काम मनका समाधान करें और 1 एच के लिए फिर से sonicate करें।
- 15 मिनट पहले मनका समाधान sonicating समाप्त हो गया है, अच्छी तरह से उन्हें एक सिरेमिक कवरस्लिप धारक में खड़ी रखकर और एक tabletop प्लाज्मा क्लीनर में 3 मिनट के लिए कमरे हवा प्लाज्मा के साथ इलाज द्वारा coverslips साफ.
- हैंडलिंग की सुविधा और बाद के चरणों के दौरान कवरस्लिप के फिसलने को रोकने के लिए, एक 60 मिमी पेट्री डिश ढक्कन या इसी तरह के कंटेनर में पैराफिल्म का एक टुकड़ा रखें। स्टेबलाइजर में कवरस्लिप रखें और हल्के से नीचे नल, पैराफिल्म और कवरस्लिप के बीच अच्छा संपर्क सुनिश्चित करने।
- एक 22 मिमी कवरस्लिप के लिए, कवरस्लिप के शीर्ष पर काम कर रहे मनका समाधान के 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। तुरंत कवरस्लिप के किनारे से इथेनॉल समाधान को बंद कर दें, जिससे कवरस्लिप पर मोती छोड़ दें। कवरस्लिप को एयरड्राय की अनुमति दें।
नोट:काम मनका समाधान जोड़ा की मात्रा होना चाहिए $4 $L/cm2 और किसी भी आकार कवरपर्ची को समायोजित करने के लिए स्केल किया जा सकता है।
- एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोती के साथ हाइड्रोजेल्स कास्टिंग
- ऐक्रिलमाइड और बिस्-ऐक्रिलमाइड का हाइड्रोजेल विलयन तैयार की। सारणी 1के अनुसार विलयन को मिलाएं, फिर 10% एपीएस का 2.5 डिग्री सेल्सियस और 0.5 डिग्री सेल्सियस का मिलाएं। अच्छी तरह मिला लें। तुरंत अगले कदम के लिए कदम.
नोट:हाइड्रोजेल विलयन मिश्रण को यंग के मापांक या कठोरता को बदलने के लिए बदला जा सकता है, जो एक्रिलमाइड के अनुपात को तालिका 1में दर्शाए अनुसार परिवर्तित करके हाइड्रोजेल के अनुपात को बदलकर परिवर्तित किया जा सकता है। इन मूल्यों को परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करHow प्रयोगशाला में उपयोग के लिए सत्यापित किया गया है, लेकिन एक संस्था के भीतर की पुष्टि की जानी चाहिए. - hydrogel समाधान बनाने के तुरंत बाद, कांच के नीचे पकवान या नीचे कवरस्लिप के सक्रिय पक्ष में एक 25 डिग्री सेल्सियस ड्रॉप जोड़ें, फिर तुरंत मनका लेपित कवरस्लिप को समाधान पर रखें, मनका साइड नीचे। धीमी गति से कम करने के बाद कवरस्लिप के दूर की ओर के साथ ड्रॉप से संपर्क करने से हाइड्रोजेल के भीतर हवा के बुलबुले को फँसाने से बचने में मदद मिलती है।
नोट:hydrogel की ऊंचाई अच्छी तरह से उद्देश्य लेंस के काम की दूरी के भीतर होना चाहिए बाद में प्रयोग में इस्तेमाल किया. 66 डिग्री मीटर की एक hydrogel ऊंचाई सबसे प्रणालियों के लिए अच्छी तरह से काम करता है. hydrogel के आकार coverslip के आकार के आधार पर अधिक या कम hydrogel समाधान जोड़कर बढ़ाया जा सकता है. hydrogel समाधान की उपयुक्त मात्रा की गणना करने के लिए, एक सिलेंडर की मात्रा के लिए समीकरण का उपयोग करें, V $ r2ज जहां ज कवरस्लिप त्रिज्या है और ज वांछित hydrogel ऊंचाई है. आमतौर पर, इस गणना उचित सटीकता hydrogel की वास्तविक ऊंचाई के साथ भविष्यवाणी, के रूप में दोनों शीर्ष और नीचे पर मनका लेपित coverslips के साथ एक जेल की तैयारी और दो मनका विमानों के बीच की दूरी को मापने के लिए एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मापा. तथापि, यह देखा गया है कि हाइड्रोजेल की वास्तविक ऊँचाई इस गणना से 20 डिग्री मी(उदा., शीर्ष कांच की आवरण रेखा की मोटाई और निर्माता के आधार पर) से भटक सकती है। ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर जेल ऊंचाई के प्रत्यक्ष माप की सिफारिश की है. - जेल को 30 मिनट के लिए बहुलक बनाने की अनुमति दें, फिर संदंश के साथ शीर्ष कवरस्लिप को धीरे से हटा दें। डिश में 50 m HEPES pH 8.5 जोड़ना हटाने की सुविधा कर सकते हैं. 50 m HEPES पीएच 8.5 तीन बार में 5 मिनट के लिए धो लें।
- ऐक्रिलमाइड और बिस्-ऐक्रिलमाइड का हाइड्रोजेल विलयन तैयार की। सारणी 1के अनुसार विलयन को मिलाएं, फिर 10% एपीएस का 2.5 डिग्री सेल्सियस और 0.5 डिग्री सेल्सियस का मिलाएं। अच्छी तरह मिला लें। तुरंत अगले कदम के लिए कदम.
- हाइड्रोजेल सक्रियण और extracellular मैट्रिक्स कोटिंग
- 50 m M Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) हेक्सानोएट में 50 m HEPES pH 8.5 में incubating द्वारा hydrogel सतह को सक्रिय करें। तुरंत एक संलग्न क्षेत्र में एक यूवी चाप दीपक को बेनकाब.
नोट:सक्रियण से पहले प्रकाश से Sulfo-SANPAH की रक्षा करें। एक 400 डब्ल्यू दीपक के लिए, जेल की स्थिति 10 सेमी प्रकाश बॉक्स के भीतर बल्ब से दूर और 100 s के लिए रोशन. Sulfo-SANPAH समाधान उज्ज्वल नारंगी से गहरे भूरे रंग के लिए बदल जाएगा। - 50 m HEPES पीएच 8.5 तीन बार में 5 मिनट के लिए धो लें।
नोट:हाइड्रेटेड जैल एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - 50 मीटर HEPES pH 8.5 में 20 डिग्री/एमएल फाइब्रोनेक्टिन में सक्रिय हाइड्रोजेल को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
- फाइब्रोनेक्टिन घोल को सहयोजने के साथ-साथ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में तीन बार 5 मिनट तक धोएं। PBS की एक कम मात्रा के साथ एक ऊतक संस्कृति हुड में यूवी प्रकाश के तहत 15 मिनट के लिए hydrogel और पकवान के ढक्कन स्टरलाइज़ करें। बाँझ पीबीएस में एक बार धो लें।
नोट:ईसीएम प्रोटीन के अन्य प्रकार कोलेजन और लेमिन सहित hydrogel कोट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 50 m M Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) हेक्सानोएट में 50 m HEPES pH 8.5 में incubating द्वारा hydrogel सतह को सक्रिय करें। तुरंत एक संलग्न क्षेत्र में एक यूवी चाप दीपक को बेनकाब.
2. चढ़ाना कोशिकाओं
- 1000 कोशिकाओं/सेमी 2 के अंतिम सेल घनत्व के लिए 60 मिमी डिश भरने केलिए 21,000 कोशिकाओं वाले मीडिया के 3 एमएल जोड़ें। भीड़ को रोकने और व्यक्तिगत कोशिकाओं के मुक्त आंदोलन की अनुमति देने के लिए आवश्यक के रूप में बोने घनत्व समायोजित करें।
- कोशिकाओं को कम से कम 4 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर और इमेजिंग से पहले 18 एच तक ठीक होने दें। इमेजिंग मीडिया जोड़ने से पहले दो बार इमेजिंग मीडिया के साथ rinsing द्वारा इमेजिंग के लिए तैयार करें। इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को बराबर करने की अनुमति दें।
नोट:स्क्रीन मीडिया शर्तों अग्रिम में उपयोग किया जा रहा सेल लाइन में माइग्रेशन ऑप्टिमाइज़ करेगा जो शर्तों का निर्धारण करने के लिए। SKOV-3 कोशिकाओं के लिए, phenol लाल बिना DMEM, 20 mM HEPES और 12.5 एनजी / Ref52 कोशिकाओं के लिए इष्टतम शर्तों 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 25 ng/mL प्लेटलेट व्युत्पन्न विकास कारक के साथ रिंगर बफर हैं.
3. ग्लास माइक्रोपिपेट की तैयारी: पिपेट खींच और फोर्जिंग
- एक 1.0 मिमी बाहरी और 0.58 मिमी आंतरिक व्यास के साथ 100 मिमी लंबे बोरोसिलिकेट ग्लास micropipettes खींचो एक दो कदम प्रक्रिया में एक टेपर प्राप्त करने के लिए 2 मिमी है कि पहले मिलीमीटर में $50 डिग्री मीटर को कम कर देता है और एक लंबे, समानांतर 10 डिग्री व्यास ट्यूब पिछले मिलीमीटर में तक फैली हुई है.
- लोड एक microforge में पाइप खींच लिया. पाइपेट को 15 डिग्री मीटर कुंद टिप के लिए आकार दें जो पाइपके के बाकी हिस्सों से $35 डिग्री कोण पर 250 डिग्री मीटर खंड के बहुत अंत में संलग्न है। मोड़ पर अनुमानित व्यास टिप को ताकत देने के लिए लगभग 30 डिग्री मीटर होना चाहिए।
नोट:टेपर और टिप आयाम ठीक से वांछित बल लागू करने के लिए समायोजित किया जा सकता है (चरण 5 देखें). 3 मिमी के लिए पहले चरण के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोपिपेट ्स खींचना, और दूसरे चरण के लिए 60 डिग्री सेल्सियस चरण 3.1 में वर्णित आयामों का उत्पादन करता है। विभिन्न पाइपपुलर्स का उपयोग करने वाले परिणाम भिन्न हो सकते हैं. - उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल में माइक्रोपिपेट को स्टरलाइज़ करें।
4. माइक्रोमैनिपेटर और माइक्रोपिपेट को पोजिशनिंग
- पकवान ढक्कन निकालें और माइक्रोस्कोप मंच और केंद्र पर पकवान लोड. 10X या इसी तरह कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करें. मीडिया के वाष्पीकरण को रोकने के लिए खनिज तेल के साथ मीडिया को कवर.
-
सम्मिलित करने से खींचा गया पाइप्ट
- खींच पाइप को माइक्रोपिपेट म्यान में डालें, हुक को डिश की ओर इशारा करते हुए। हुक की नोक सबसे कम बिंदु होगा जब जेल को कम.
- माइक्रोमैनिप्युलेटर में म्यान डालें और पाइप्ट की नोक दोनों एक्स और वाई दिशाओं में उद्देश्य लेंस पर केंद्रित है जब तक समायोजित करें।
- यह सिर्फ तरल की सतह को छू लेती है जब तक मोटे manipulator का उपयोग कर pipet कम.
- चरण विपरीत या ब्राइटफील्ड का उपयोग करना, जेल के शीर्ष पर मनका परत पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित. यह संदर्भ विमान होगा.
- यह सुनिश्चित करना कि उद्देश्य नमूना या चरण से टकराने का कोई खतरा नहीं है, माइक्रोपिपेट की नोक खोजने के लिए जेल के ऊपर ध्यान केंद्रित करें, एक्स और वाई दिशाओं में मोटे मैनिप्युलेटर के छोटे समायोजन का उपयोग करके फोकल प्लेन पर छाया डाली जाए। केवल micropipette कम जब कुछ है कि पाइप्ट के बहुत टिप देखने के क्षेत्र में है.
- सुनिश्चित करें कि माइक्रोपिपेट की कुंद टिप म्यान में पाइप को घुमाकर या माइक्रोमैनेटर में म्यान को घुमाकर तब तक इशारा कर रही है जब तक कि टिप फोकल तल के लंबवत न हो जाए। आवश्यकतानुसार चरण 4.4 और 4.5 दोहराएँ. पाइप्ट की नोक पर ध्यान दें।
- जेल के शीर्ष मनका परत के लिए वापस नीचे ध्यान केंद्रित करने के लिए गेज कितनी दूर pipet जेल सतह से है. एक विमान है कि जेल और पाइप्ट की नोक के बीच हिस्सा रास्ता है करने के लिए वापस फोकस. धीरे-धीरे पाइप को कम करने के लिए मध्यवर्ती फोकल विमान तक पहुँचने के लिए.
- दोहराएँ कदम 4.6 जब तक micropipette की नोक से बहुत बेहोश छाया की सराहना की जा सकती है जब hydrogel पर ध्यान केंद्रित. अगले उच्चतम आवर्धन करने के लिए बढ़ाएँ.
- माइक्रोपाइपेटर को तब तक कम करें जब तक कि माइक्रोपिपेट के बहुत सिरे की छाया और अपवर्तन को मनका परत फोकल तल के भीतर सराहा जा सकता है।
- उस के लिए आवर्धन बढ़ाएँ जो प्रयोग में इस्तेमाल किया जाएगा. पाइप्ट को तब तक कम करें जब तक कि यह हाइड्रोजेल की सतह के ठीक ऊपर न हो।
5. micromanipulator और बल पीढ़ी कैलिब्रेट करना
- चरण या ब्राइटफील्ड में, हाइड्रोजेल की सतह को छूने के लिए होवरिंग माइक्रोपिपेट को कम करें। निरीक्षण करें कि पाइप्ट हाइड्रोजेल के साथ संपर्क पर कैसे दिखता है। एक्स और वाई में समायोजन तक माइक्रोपिपेट को कम करना जारी रखें, उन दिशाओं में हाइड्रोजेल को खींचने और विक्षेप का कारण बनता है। विश् वास्यता के निशान के रूप में सूक्ष्म मंडलों या आस-पास की कोशिकाओं का उपयोग करें।
नोट:यदि micromanipulator चरण कंडेनसर हाथ या बेंच और नहीं नमूना चरण ही करने के लिए संलग्न है, हमेशा मंच जाने से पहले जेल को अलग करने के लिए पाइप या परेशान कोशिकाओं को तोड़ने से बचने के. यदि पाइप टूट जाता है, तो चरण 3 और चरण 4पर वापस जाएं. - जेल संलग्न करने के लिए कोशिकाओं से रहित एक क्षेत्र का पता लगाएं। यह सभी दिशाओं में खींचो और जिस तरह से micromanipulation जेल के विरूपण के लिए अनुवाद के साथ सहज हो.
- कोई हेरफेर के साथ मनका क्षेत्र के फ्लोरोसेंट छवियों ले लो, pipet जेल उलझाने के साथ, और लगे हुए pipet जेल खींच के साथ. यह कई बार दोहराएँ micromanipulator पर टिक के निशान के बारे में अच्छा नोट ले रही है, जिस तरह से पाइप टिप खींच के प्रत्येक चरण में चरण या brightfield में लग रहा है, और दूरी टिप कि हेरफेर का उपयोग कर चाल.
- ImageJ का प्रयोग करें के रूप में पहले वर्णित16,17 रिश्तेदार मनका विस्थापन और पाइपेट सगाई के बिना मनका क्षेत्र के लिए नल मनका क्षेत्र की तुलना द्वारा मोती के लिए लागू बल की गणना करने के लिए, जेल लगे हुए के साथ मनका क्षेत्र, और जेल खींच लिया.
- टेंशनल उत्तेजना को ठीक करने के लिए, भिन्न माइक्रोपिपेट टिप आयामों, सेल से दूरी, या टचडाउन के प्रारंभिक बिंदु से माइक्रोमैनिप्युलेटर द्वारा खींची गई दूरी का उपयोग करके बल अनुप्रयोग की तुलना करें। बल आवेदन पर micropipette टिप आयाम का प्रभाव उपयोगकर्ता के लिए महान लचीलापन देता है, लेकिन यह भी नए micropipettes के लिए बल नक्शे उत्पन्न करने की आवश्यकता को दर्शाता है, यहां तक कि जब आयाम और आकार बारीकी से पहले calibrated सुझावों के समान.
6. durotaxis परख का आयोजन
- प्रयोग करने से पहले, एक सेल के पास जेल आकर्षक अभ्यास और micromanipulator repositioned है जब सेल के विरूपण का निरीक्षण.
- उन कोशिकाओं के समूह की निगरानी करें जिनमें स्पष्ट ध्रुवता होती है और उन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए 30 मिनट तक चलती प्रतीत होती हैं जो निर्देशित तरीके से आगे बढ़ रही हैं.
- एक सेल है कि एक एकल, स्पष्ट दिशा में बढ़ रहा है चुनें और एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए वांछित फ्रेम दर पर यह निगरानी.
- यदि कोशिका द्वारा लगाए गए कक्ष या तनाव पर लगाए गए बलों का निर्धारण वांछित है, तो प्रत्येक अर्जन पर मनका क्षेत्र छवियों को कैप्चर करें। यदि कोशिका निगरानी के दौरान दिशा के अपने पाठ्यक्रम में परिवर्तन, एक अलग सेल का चयन करने की निगरानी के रूप में यह मुश्किल उत्तेजना के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए कर देगा.
- कोशिका से लगभग 50 डिग्री मीटर दूर हाइड्रोजेल को व्यस्त करें। अग्रणी किनारे के निकट की ओर के सामने पाइप्ट स्थिति और micromanipulator इस तरह है कि जेल यात्रा के सेल की दिशा के लिए orthogonally विकृत है कदम. समय के साथ कोशिका का निरीक्षण करें क्योंकि यह कठोरता के तीव्र, स्थानीय प्रवणता का जवाब देता है।
नोट:यहाँ प्रदान की समय प्रभावी है जब SKOV3 या Ref52 फाइब्रोब्लास्ट की निगरानी, तथापि, अंतराल और समग्र समय पाठ्यक्रम सेल प्रकार और जैविक घटना मनाया जा रहा है के अनुरूप समायोजित किया जाना चाहिए. यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मन, कदम 6.5. से तुरंत पहले फ्लोरोसेंट अधिग्रहण को थामने, micropipette और पुल की स्थिति के लिए चरण विपरीत या ब्राइटफील्ड का उपयोग करें, और तुरंत बाद फ्लोरोसेंट अधिग्रहण पुनः आरंभ। - यदि पाइप फिसल जाता है या यदि ग्रेडिएंट अन्यथा शिथिल या छोड़ा जाता है, तो चरण 6.2 और 6.3 दोहराकर एक नया कक्ष ढूँढें।
7. durotactic प्रवास प्रतिक्रिया का निर्धारण
- ImageJ19 या किसी अन्य छवि विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करना, 0 मिनट और 30 मिनट पोस्ट मॉनिटर पर सेल के अग्रणी किनारे के बीच के बीच एक लाइन ड्राइंग द्वारा बारी कोण की गणना (सेल के मूल प्रक्षेप पथ को दर्शाता है) और के बीच एक और लाइन बस से पहले अग्रणी बढ़त और उत्तेजना के बाद 80 मिनट और इन दो लाइनों के बीच कोण को मापने.
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Representative Results
माइक्रोपाइपेट तैयार करके (चित्र 1)और पुल ों की बल पीढ़ी को सामान्य करके (चित्र 2 और चित्र 3) जैसा कि ऊपर वर्णित है, एकाधिक कोशिका रेखाओं के लिए इष्टतम दुरात्मक स्थितियों की पहचान की गई है। इस तकनीक का उपयोग, जैसा कि चित्र ामाल करकेचित्र ामाल करके एसको-९ ओवेरियन कैंसर कोशिकाओंमें १९ तथा रेफ52 चूहा भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट्स (चित्र 5) कांच माइक्रोपाइपेट द्वारा अनुप्रयुक्त प्रवणता में वृद्धि की ओर ले जाते हैं. Durotaxis के अलावा, इस विधि फ्लोरोसेंट biosensors और मार्करों का उपयोग गतिशील संकेतन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, फोकल आसंजन संरचनाओं के भीतर और संकेत की संरचना durotactic उत्तेजना पर देखा जा सकता है. Vinculin तनाव सेंसर (VinTS) एक FRET आधारित biosensor जो फोकल आसंजन के लिए स्थानीयकृत है, फोकल आसंजन गतिशीलता के फ्लोरोसेंट अवलोकन और उन संरचनाओं के भीतर तनाव में परिवर्तन की माप के लिए अनुमति देता है19. Ref52 कोशिकाओं क्षणिक 125 kPa polyacrylamide जैल पर VinTS व्यक्त 40 मिनट की समय अवधि के दौरान खिंचाव की दिशा में फोकल आसंजन के गठन को दिखाने के (चित्र 6A) . FRET विश्लेषण20 से पता चलता है कि vinculin फोकल आसंजन के लिए स्थानीयकृत तनाव में एक तत्काल परिवर्तन का अनुभव जब तीव्र durotactic उत्तेजना के साथ प्रस्तुत किया (चित्र 6ख) subcellular के अवलोकन के लिए इस परख की उपयोगिता का विस्तार durotactic उत्तेजना के जवाब में संकेत घटनाओं.
चित्र 1. ठेठ खींचा (ए) और जाली (बी) micropipettes के आरेख. (क) माइक्रोपिपेट्स को दो-चरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके खींचा जाता है ताकि 2 मिमी से 10 डिग्री मी से 2 मिमी से 1 0 डिग्री तक की एक टेपर प्राप्त की जा सके (बी) माइक्रोपेपेट्स को माइक्रोफोर्ज में लोड किया जाता है और उनके सुझावों को मोड़ा जाता है, संलग्न किया जाता है, और छोटा किया जाता है ताकि अंतिम 250 $m माइक्रोपिपेट को $35 डिग्री कोण पर मोड़ा जाता है और टेपर $30 $m से एक गोल सिरे तक झुके होते हैं जो $15 $m को मापता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. पॉली-एल-लाइसिन का उपयोग कर पारंपरिक विधि की तुलना में इथेनॉल कोटिंग के बाद बेहतर मनका क्षेत्र। प्रतिनिधि हाइड्रोजेल मनका क्षेत्रों से पाली-एल-lysine और इथेनॉल (EtOH) वाष्पीकरण coverlip कोटिंग तरीकों पीले हरे, लाल, और गहरे लाल फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग कर। स्केल बार: 25 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. एक उदाहरण durotactic खिंचाव के लिए बल मानचित्र का उत्पादन. (ए) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर की स्थिति से पहले और बाद में (क्रमशः छद्म रंग का हरा और लाल) एक माइक्रोपिपेट (पैनल के दाहिने किनारे से परे स्थित) के साथ हाइड्रोजेल को विकृत करना। स्केल बार: 25 डिग्री मी. विस्थापन सदिश (बी) और विस्थापन ऊष्मा मानचित्र (ब्) नल और खींचे हुए मनका क्षेत्रों के बीच, छविजे में ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी प्लगिन द्वारा उत्पन्न मनका विक्षेप णता और हाइड्रोजेल विकृति की प्रवणता को उजागर करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4. ड्यूरोक्सिस परख और विक्षेप कोण के निर्धारण का योजनाबद्ध। (ए) एक सेल अपने मूल प्रक्षेप पथ का निर्धारण करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए मनाया जाता है। (बी) माइक्रोपिपेट कोशिका के प्रक्षेप पथ पर ऑर्थोगोनली स्थित है, जो कोशिका किनारे से 50 उ उ है। हाइड्रोजेल माइक्रोपिपेट द्वारा इस प्रकार लगाया जाता है कि माइक्रोपिपेट को स्थानांतरित करने से हाइड्रोजेल की सतह पर बल लागू होता है। (ग) माइक्रोपिपेट को कोशिका से 20 डिग्री की दूरी पर एक अतिरिक्त 20 डिग्री खींचा जाता है, जो कोशिका के प्रक्षेप पथ पर लंबकोणीय होता है जो तनाव की तीव्र, स्थानीय प्रवणता (नीले रंग में दर्शाया गया है) जो माइक्रोपाइपेट की ओर बढ़ता है। (घ) कक्ष को समय के साथ देखा जाता है क्योंकि यह अनुप्रयुक्त प्रवणता को नेविगेट करता है। (ई) ImageJ या एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम में, मूल प्रक्षेप पथ (डैश्ड रेखा) पहली फ्रेम में अग्रणी बढ़त के केंद्र के माध्यम से सेल के बीच से तैयार की एक रेखा द्वारा चिह्नित है. अंतिम प्रक्षेप पथ (ठोस रेखा) सेल लागू तनाव ढाल नेविगेट करने की अनुमति दी है के बाद तैयार की एक रेखा द्वारा चिह्नित है. उद्दीपक की ओर इन दो रेखाओं के बीच के कोण को "टर्न कोण" कहा जाता है, जिसे यहाँ चिह्नित किया गया है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5. चूहा भ्रूण Fibroblasts durotaxis में वृद्धि हुई सब्सट्रेट कठोरता के क्षेत्रों की ओर ले जाते हैं. समय पाठ्यक्रम पुल से पहले एक ref52 सेल 10 मिनट के durotactic आंदोलन दिखा (पैनल 1), पुल से पहले 1 मिनट (पैनल 2), पुल के समय में (पैनल 3), और 1 एच पुल के बाद (पैनल 4). तीर खिंचाव की दिशा को इंगित करता है। स्केल बार: 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6. फ्लोरोसेंट मार्कर या biosensors का उपयोग durotactic उत्तेजना के दौरान प्रोटीन स्थानीयकरण और गतिविधि. Ref52 कोशिकाओं क्षणिक Vinculin तनाव सेंसर व्यक्त (VinTS)19 पर पलायन 125 kPa polyacrylamide जैल तीव्र durotactic उत्तेजना के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं. (ए) उत्तेजना के बाद, नई फोकल आसंजन खिंचाव की दिशा में बनते हैं क्योंकि कोशिकाएं कठोरता प्रवणता के साथ पुन: उन्मुख होती हैं। दो 10 मिनट की अवधि के लिए, यांत्रिक उत्तेजना से पहले 20 मिनट और उत्तेजना के बाद 21 मिनट शुरू, सेल आकृति विज्ञान (ऊपर) और फोकल आसंजन गठन (नीचे) की निगरानी की गई. लाल रंग समय अवधि के भीतर पहली बार बिंदु इंगित करता है और हरे रंग timepoint 10 मिनट बाद में इंगित करता है। 10 मिनट की अवधि के भीतर गठित नए फोकल आसंजन हरे रंग में दिखाए जाते हैं। उत्तेजना से पहले, यात्रा की दिशा में नए फोकल आसंजन फार्म. उत्तेजना के बाद, खिंचाव की दिशा में नए फोकल आसंजन फार्म. तीर खिंचाव की दिशा को इंगित करता है। एरोहेड्स उस 10 मिनट की अवधि में बने फोकल आसंजन वाले क्षेत्रों को इंगित करते हैं। स्केल बार: 25 डिग्री मी. (बी) विनटीएस फ्लोरोसेंट का फ्राफ्ट विश्लेषण, द्रुतगतिखंड के निकट फोकस आसंजनों के भीतर तनाव में परिवर्तन को इंगित करता है। उत्तेजना पर कोशिका के विरूपण को हाइलाइट करने से पहले और बाद में कोशिका झिल्ली की रूपरेखा. एरोहेड्स फोकस आसंजनों के उदाहरणों को इंगित करते हैं जो स्ट्रेच पर FRET अनुपात में परिवर्तन का अनुभव करते हैं। स्केल बार: 10 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| वांछित हाइड्रोजेल कठोरता | 3 के.पीए | 25 के.पीए | 125 केपीए |
| 7.5% ऐक्रिलमाइड | 100 $L | 100 $L | 160 जेडएल |
| 0.5% बिस्-एक्रीलमाइड | 10 जेडएल | 100 $L | 100 $L |
| डीडीएच2हे | 287 जेडएल | 197 जेडएल | 137 जेडएल |
तालिका 1. Acrylamide जेल समाधान.
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Discussion
यहाँ प्रदर्शित एक repeatable, एकल सेल durotaxis परख है कि एक सेल के लिए तीव्र यांत्रिक संकेतों के जवाब में अपने प्रवास व्यवहार को बदलने की क्षमता के आकलन की अनुमति देता है. इस तकनीक को भी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और उचित संलयन प्रोटीन या biosensors के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है यांत्रिक उत्तेजना के सेकंड के भीतर या एक लंबे समय तक समय के दौरान subcellular संकेतन और cytoskeletal घटनाओं की जांच करने के लिए दुर्गतित्मक आंदोलन। अपने पर्यावरण के लिए एक सेल के रिश्ते को समझना है कि पर्यावरण के दोनों रासायनिक और यांत्रिक पहलुओं के प्रभाव का अध्ययन शामिल है. हालांकि मास्टर करने के लिए संभावित मुश्किल, इस durotaxis परख व्यापक रूप से अपने यांत्रिक microenvironment में परिवर्तन करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, durotactic उत्तेजना के इस micropipette आधारित विधि अत्यधिक manipulable है, यांत्रिक उत्तेजनाओं पर spatiotemporal नियंत्रण के एक उच्च डिग्री की अनुमति, अन्य तकनीकों पर एक प्रमुख लाभ, इस तरह के पूर्व गठन रैखिक या के रूप में कठोरता के चरण-ग्रेड। प्रदान की गई तनाव प्रवणता की परिमाण और दिशा को कोशिका संस्कृति की सतह के निकट हाइड्रोजेल में एम्बेडकिए फ्लोरोसेंट मोतियों के विस्थापन को ट्रैक करके विरूपित किया जा सकता है।
संस्कृति की सतह के ठीक नीचे एक परत के लिए इन fiducial मार्करों सीमित इस ट्रैकिंग की सटीकता बढ़ जाती है. विक्षेप के विमान के नीचे स्थित Microspheres (या तो micropipette द्वारा या, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के लिए, सेलुलर contractility द्वारा), के रूप में hydrogel भर में समान रूप से microspheres मिश्रण के साथ हो जाएगा, में से कम कदम होगा विमान सूक्ष्म मंडल, जो अनुप्रयुक्त बलों के कम आकलन का कारण बन सकता है. इसके अलावा, इस संशोधन के लिए प्रदर्शन करने के लिए आसान है और तरीकों की तुलना में अधिक विश्वसनीय है जिसमें मोती एक पूर्व गठित जेल21 के शीर्ष पर polyacrylamide की एक अत्यंत पतली परत में मढ़ा रहे हैं या गुरुत्वाकर्षण की मदद से hydrogel सतह के लिए लाया22 और पहले बताए गए विधियों की तुलना में हाइड्रोजेल में मोतियों का अधिक फैलावउत्पन्नकरता है 17,23.
संशोधन और भविष्य के अनुप्रयोगों
इस परख की बारीकियों को सबसे अच्छा ब्याज की सेल लाइन के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, extracellular मैट्रिक्स अणुओं की एक किस्म (उदाहरण केलिए, कोलेजन मैं, कोलेजन चतुर्थ, laminin) या अन्य चिपकने वाला ligands hydrogel functionalize करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, हाइड्रोजेल की प्रारंभिक कठोरता को आसानी से एक्रिलमाइड के अनुपात को बिस-ऐक्रिलमाइड में ट्यूनिंग द्वारा उठाया या कम किया जा सकता है (तालिका 1देखें)। micropipette टिप के आयामों और पुल के परिमाण को बदलने से, इस परख प्रश्न में सेल प्रकार के लिए एक repeatable और प्रभावी durotactic उत्तेजना प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
महत्वपूर्ण कदम और समस्या निवारण
केवल hydrogel हेरफेर से पहले प्रवास के एक स्थिर, रैखिक प्रक्षेप पथ के बाद कोशिकाओं को यह सुनिश्चित करने के लिए प्रेरित किया जाना चाहिए कि प्रक्षेप पथ में परिवर्तन यांत्रिक उत्तेजना और यादृच्छिक उतार-चढ़ाव के कारण नहीं कर रहे हैं. देखभाल के लिए एक गिलास micropipette कि फिसल के बिना hydrogel सतह संलग्न है, लेकिन जेल आंसू नहीं जब खींच लिया जाना चाहिए. यह प्रयोग के दौरान hydrogel के लिए एक स्थिर, निरंतर खिंचाव लागू करने के लिए स्वच्छ परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है जिसका अर्थ है कि उपयोगकर्ता रखने और एक सेल का सामना करने से पहले micropipette ले जाने पर अभ्यास किया जाना चाहिए. माइक्रोपिपेट का कोई अनजाने आंदोलन जो तनाव ढाल में परिवर्तन की ओर जाता है, सेल की ड्यूरोटैक्स की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। इसी तरह, जेल के हेरफेर प्रत्येक नए micropipette कि पाइप आकार में मामूली परिवर्तन के रूप में जाली है के साथ अभ्यास किया जाना चाहिए पाइप /
आवर्धन बढ़ाने से पहले देखने के सूक्ष्म क्षेत्र के भीतर micropipette स्थिति में विफलता नाजुक कांच टिप के आकस्मिक टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. सुनिश्चित करें कि ऊंचाई और टिप के एक्स-वाई स्थिति micromanipulator के साथ micropipette कम करने से पहले जाना जाता है. टूटना के जोखिम को कम करने के लिए हमेशा माइक्रोपिपेट की स्थिति की निगरानी करें। यह अनुशंसा की जाती है कि आवर्धन माइक्रोमैनिपरेटर में लोड प्रत्येक नए माइक्रोपिपपेटेटर के लिए 10X तक कम हो जाता है क्योंकि माइक्रोमैनिटेटर और पाइप म्यान की मामूली गतियां नई लोड की स्थिति में बड़े स्पष्ट परिवर्तन का कारण बन सकती हैं माइक्रोपिपेट।
कोशिकाओं को देखने से पहले, यह पुष्टि करने के लिए कि यह उम्मीद के रूप में hydrogel संलग्न होगा micropipette परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह वांछित खिंचाव लागू करने के लिए उपयुक्त है. टिप आयाम है कि प्रयोग और सेल प्रकार सूट ढूँढना durotactic उत्तेजना लागू करने में सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. micropipette के अंत पर्याप्त गोल किया जाना चाहिए ताकि यह जेल के माध्यम से तोड़ नहीं है, लेकिन इतना गोल नहीं है कि यह पकड़ करने में विफल रहता है. यदि पाइप प्रभावी ढंग से जेल खींच नहीं करता है, यह सतह के साथ फिसलने हो सकता है. micropipette टिप के आकार भी ठीक से जेल की सतह के साथ संलग्न करने के लिए गोल किया जा सकता है. micropipette के बहुत टिप पर आयाम फर्म, स्थिर संपर्क लगातार प्राप्त किया जा सकता है जब तक समायोजित किया जाना चाहिए. कुछ मामलों में जहां micropipette जेल की सतह भर में फिसल रहा है, यह अधिक कर्षण हासिल करने के लिए hydrogel में आगे micropipette कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यदि जेल के माध्यम से micropipette आँसू, टिप भी ठीक है या बहुत तेज हो सकता है. जेल फाड़ भी बहुत अधिक बल खींच जबकि लागू किया जा रहा है संकेत हो सकता है. माइक्रोपिपेट जेल विरूपण को कम करने और कम दूरी खींच करने के लिए थोड़ा उठाया जाना चाहिए।
अक्सर, यदि सेल या सेल के किनारे micropipette द्वारा ध्यान से बाहर खींच लिया है, micropipette की नोक भी सेल के करीब लगे हुए है या खिंचाव भी मजबूर है. माइक्रोपाइप को कोशिका से आगे ले जाएँ, केवल एक्स-वाई विमानों में कोशिका को थोड़ा विकृत करना। सेल को ध्यान से बाहर ले जाने से न केवल सेलुलर घटनाओं की निगरानी करना और ऑप्टिकल विपथन करना असंभव हो जाएगा, बल्कि यह सेल को 2-आयामी तनाव प्रवणता से अधिक उत्तेजना का अनुभव करेगा।
सबसे महत्वपूर्ण बात, यह रिकॉर्ड और केवल प्रतिक्रियाओं है कि कम से कम मानव त्रुटि के साथ लगातार durotactic हेरफेर है विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि टिप को कम करने imprecise है या micropipette repositioned है, प्रयोग के परिणाम बादल हो जाएगा. चूंकि यह परख जटिल है और कई कदम त्रुटि से ग्रस्त हैं, कोशिकाओं की उत्तेजना में अनजाने परिवर्तन से बचने के लिए हर कदम पर ध्यान दिया जाना चाहिए। किसी भी कदम पर विफलता असंगत खिंचाव आवेदन और अविश्वसनीय परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
सीमाओं
इस तकनीक है कि विचार किया जाना चाहिए करने के लिए सीमाएं हैं. सबसे प्रमुखता से, सटीक फोर्जिंग और ग्लास micropipettes के हेरफेर नए उपयोगकर्ताओं के लिए एक खड़ी सीखने की अवस्था पेश कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, स्थिति और hydrogel पुल के परिमाण विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. hydrogel हेरफेर से पहले और बाद फ्लोरोसेंट मनका विस्थापन की जांच तकनीक के इस पहलू के साथ मदद कर सकते हैं. इसके अलावा, जबकि तकनीक व्यक्तिगत कोशिकाओं में durotactic व्यवहार के उच्च spatiotemporal अवलोकन की अनुमति देता है, यह यह एक कम throughput परख बनाता है. इसलिए यह कहना महत्वपूर्ण है कि इस परख भी कम manipulability लेकिन उच्च throughput के साथ अन्य तकनीकों द्वारा पूरित किया जा सकता है, इस तरह कठोरता के पूर्व गठन ढाल के साथ hydrogels का उपयोग कर के रूप में, बड़ा के durotactic व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक बार में कोशिकाओं की आबादी. संक्षेप में, एकल-सेल ड्यूरोटेक्टिक परख द्वारा afforded यांत्रिक संकेतों के spatiotemporal नियंत्रण के उच्च डिग्री यह कई के तहत कई अलग अलग सेल के durotactic व्यवहार करने के लिए योगदान आणविक तंत्र पार्स करने के लिए बहुत उपयोगी बनाते हैं शर्तों.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
कोई नहीं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
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