Summary
Mekaniske krefter er viktig for å kontrollere celle migrering. Denne protokollen demonstrerer bruken av elastiske hydrogeler som kan deformeres ved hjelp av et glass micropipette og en micromanipulator for å stimulere celler med en lokal stivhet gradient å lokke fram endringer i cellestruktur og migrasjon.
Abstract
Durotaxis er prosessen der cellene forstand og reagere på graderinger av spenning. For å studere denne prosessen in vitro, stivhet av underlaget underliggende en celle må manipuleres. Mens hydrogeler med gradert stivhet og langsiktige migrasjon analyser har vist seg nyttig i durotaxis studier, umiddelbare, akutte reaksjoner på lokale endringer i underlaget spenning tillate fokusert studie av individuelle celle bevegelser og subcellulære signalering hendelser. For å repeatably teste evnen til cellene til å oppfatte og reagere på den underliggende underlaget stivhet, en modifisert metode for anvendelse av akutte graderinger av økt spenning til individuelle celler kultivert på deformerbare hydrogeler brukes som tillater for sanntids manipulering av styrke og retning av stivhet gradienter formidles på celler i spørsmålet. I tillegg, ved å finjustere detaljene og parametrene av analysen, slik som form og dimensjoner av micropipette eller den relative posisjon, plassering, og retning av anvendt gradient, kan analysen optimaliseres for studiet av mekanisk sensitiv celle type og system. Disse parametrene kan endres for å pålitelig endre anvendt stimulans og utvide funksjonaliteten og allsidigheten til analysen. Denne metoden tillater undersøkelse av både langsiktig durotactic bevegelse samt mer umiddelbare endringer i mobilnettet signalering og morfologiske dynamikk som svar på skiftende stivhet.
Introduction
I løpet av de siste ti årene har betydningen av de mekaniske egenskapene til en celle miljø fått økende anerkjennelse i cellebiologi. Ulike vev og ekstracellulære matriser har ulike relative stiffnesses og, som cellene migrere i hele kroppen, navigerer de disse endringene, ved hjelp av disse mekaniske egenskaper for å veilede dem1,2,3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. Cells bruke stivhet av en gitt vev for å informere sine aktive atferd under prosesser som utvikling, sår healing, og kreft metastasering. Men den molekylære mekanismer som tillater følelse av og respons på disse mekaniske innganger fortsatt i stor grad ukjent1,2,3,4,5, 6 andre priser , 7i.
For å studere mekanismene gjennom hvilke celler reagerer på fysiske miljømessige signaler, må stivhet eller stivhet av underlaget underliggende tilhenger celler manipuleres. I 2000, Chun-min lo, Yu-Li Wang og kolleger utviklet en analyse8 der en individuell celle aktive respons på skiftende mekaniske signaler kan være direkte testet ved å strekke deformerbare ekstracellulære MATRISE (ECM)-belagt polyakrylamid hydrogeler som cellene var belagt. Celler viser en betydelig preferanse for å migrere mot stivere underlag, et fenomen de kalte "durotaxis."
Siden den opprinnelige rapporten i 2000, har mange andre teknikker vært ansatt for studiet av durotaxis. Bratt stivhet graderinger har vært fabrikkert ved støping gels over stive funksjoner som polystyren perler9 eller stiv polymer innlegg10 eller ved lysherde underlaget rundt kantene av et glass coverslips11 for å lage mekaniske ' trinn-grenser '. Alternativt, hydrogeler med grunnere men fast stivhet graderinger har vært fabrikkert ved en rekke metoder som graderinger av tverrbinder opprettet av mikrovæskebasert enheter12,13 eller side-ved-side hydrogel løsning dråper av ulik stivhet8, eller hydrogeler med photoreactive tverrbinder behandlet med gradert UV-lys eksponering for å skape en lineær stivhet gradient14,15. Disse teknikkene har blitt brukt til stor effekt for å undersøke durotactic Cellular bevegelse en masse over tid. Men vanligvis disse funksjonene er fabrikkert i forkant av celle plating og deres egenskaper forblir konsistent i løpet av eksperimentet, avhengig av tilfeldig celle bevegelse for prøvetaking av mekaniske graderinger. Ingen av disse teknikkene er mottagelig for observasjon av raske endringer i cellulære atferd som svar på akutt mekanisk stimulans.
For å observere cellulære svar på akutte endringer i mekanisk miljø, én celle durotaxis analyser tilbyr flere fordeler. I disse analysene, er individuelle celler gitt en akutt, mekanisk stimulans ved å trekke den underliggende underlaget bort fra cellen med et glass micropipette, og dermed innføre en retningsbestemt gradient av celle-matrise spenning. Endringer i aktive atferd, for eksempel hastighet eller retning av migrasjon, blir deretter observert av Live-celle fase kontrast mikroskopi. Denne tilnærmingen forenkler direkte observasjon av årsak og virkning relasjoner mellom mekaniske stimuli og celle migrasjon, som det gir rask, repeterende manipulasjon av retningen og omfanget av spenningen gradient og vurdering av påfølgende cellulære responser i sanntid. Videre kan denne metoden også brukes til å mekanisk stimulere celler uttrykker fluorescerende Fusion proteiner eller biosensors å visualisere endringer i mengden, aktivitet, eller subcellulære lokalisering av proteiner mistenkt for å være involvert i mechanosensing og durotaxis.
Denne teknikken har vært ansatt av grupper somstuderer durotaxis og er beskrevet her som det har blitt tilpasset av den Howe laboratoriet for å studere durotactic Behavior of SKOV-3 eggstokkene kreftceller og den molekylære mekanismer som underliggende durotaxis17. I tillegg er en modifisert metode beskrevet for fabrikasjon av hydrogeler med en enkelt, selv lag av fluorescerende mikrosfærer nær cellen kulturen overflaten; Dette forenkler visualisering og optimalisering av micropipette-genererte strekk graderinger og kan tillate vurdering av celle contractility av traction Force mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av deformerbare polyakrylamid Hydrogeler med embedded fluorescerende mikrosfærer
Merk: Veibeskrivelse beskriver polymerisering av en 25 kPa-hydrogel som er 22 μm i diameter og omtrent 66 μm tykk. Hver eller alle disse parametrene kan endres og veibeskrivelse til å gjøre det kan finnes i tabell 1 og i notene17.
- Aktivering av glass-bunn retter eller coverslips
- Forbered bind silan arbeids løsning for aktivering av et glass-Bottom Imaging parabol eller en dekkglass som passer inn i en live-celle Imaging kammer. Bland 950 μL av 95% etanol, 50 μL av isbre eddiksyre og 5 μL bind silan (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
Merk: Ved hjelp av en større bunn dekkglass i forhold til toppen dekkglass vil gi ekstra plass til å arbeide når du forbereder gel og vil lette posisjonering glasset micropipette i senere trinn. Også, hvis du bruker en dekkglass i stedet for en glass-Bottom Imaging parabol, rengjør dekkglass som beskrevet i følgende avsnitt. - Aktiver overflaten av glasset for 20 s med en Korona wand og umiddelbart overlay 50 μL av bind silan arbeids løsning. La løsningen tørke i 10 min.
- Skyll to ganger med 95% etanol, deretter to ganger med isopropanol og deretter la coverslips til airdry i ca 20 min.
Merk: aktivert glass kan lagres i opptil en uke i en desikator.
- Forbered bind silan arbeids løsning for aktivering av et glass-Bottom Imaging parabol eller en dekkglass som passer inn i en live-celle Imaging kammer. Bland 950 μL av 95% etanol, 50 μL av isbre eddiksyre og 5 μL bind silan (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
- Rengjøring av topp coverslips
- Rengjør 22 mm topp coverslips ved incubating i 2% HCl ved 70 ° c i 30 min, vask deretter i ddH2O i 10 min to ganger.
- Ruge coverslips i en løsning på 2% Cuvette rengjøring konsentrat i ddH2O ved 50 ° c i 30 min, vask deretter i ddH2O i 10 min to ganger.
- Ruge coverslips i ddH2O ved 90 ° c i 30 min, deretter i 70% etanol ved 70 ° c i 10 min, og deretter lufttørke ved 60 ° c i minst 2 timer.
Merk: Renset coverslips kan lagres på ubestemt tid i en ren desikator.
- Fluorescerende mikrosfære/perle deponering på toppen coverslips
- Sonikere den lagerløsning av fluorescerende mikrosfærer for 1 t i et ultralyd vannbad. Lag en fungerende perle løsning ved å fortynne perle lager 1:200 i 100% etanol og sonikere igjen for 1 t.
- 15 min før perle løsningen er ferdig sonikere, rengjør coverslips grundig ved å plassere dem vertikalt i en keramisk dekkglass holder og behandle med rom-luft plasma i 3 minutter i en tabletop plasma renere.
- For å lette håndteringen og hindre glidning av dekkglass under påfølgende trinn, Legg et stykke parafilm i en 60 mm Petri parabol lokk eller en lignende container. Plasser dekkglass i stabilisator og tapp lett ned, noe som sikrer god kontakt mellom parafilm og dekkglass.
- For en 22 mm dekkglass, tilsett 150 μL av arbeids perle løsningen til toppen av dekkglass. Umiddelbart aspirer etanol løsningen av fra siden av dekkglass, forlater perlene på dekkglass. La dekkglass airdry.
Merk: mengden arbeid bead løsning lagt bør være ~ 4 μL/cm2 og kan skaleres til å imøtekomme alle størrelser dekkglass.
- Casting hydrogeler med innebygde fluorescerende perler
- Klargjør hydrogel løsning av akrylamid og BIS-akrylamid. Bland løsningen i henhold til tabell 1, legg deretter til 2,5 μL av 10% APS og 0,5 ΜL av TEMED. Bland godt. Gå umiddelbart til neste trinn.
Merk: den hydrogel løsnings blandingen kan endres for å variere Youngs modul, eller stivhet, av hydrogel ved å endre forholdet mellom akrylamid og BIS akrylamid som vist i tabell 1. Disse verdiene er verifisert for bruk i Howe laboratoriet ved hjelp av Atomic Force mikroskopi men bør bekreftes innenfor en institusjon. - Umiddelbart etter at hydrogel løsning, tilsett en 25 μL dråpe til den aktiverte siden av glass-bunn parabol eller bunn dekkglass, deretter umiddelbart plassere perle-belagt dekkglass på løsningen, perle side ned. Ved å kontakte dråpe enden med den andre siden av dekkglass, etterfulgt av langsom senking, unngår du å fange luftbobler i hydrogel.
Merk: høyden på hydrogel skal være godt innenfor arbeidsavstand til objektiv objektivet som skal brukes i det senere eksperimentet. En hydrogel høyde på 66 μm fungerer bra for de fleste systemer. Størrelsen på hydrogel kan skaleres ved å legge til mer eller mindre hydrogel oppløsning, avhengig av størrelsen på dekkglass. For å beregne riktig volum av hydrogel løsning, bruk ligningen for volumet av en sylinder, V = πr2h der r er dekkglass radius og h er ønsket hydrogel høyde. Vanligvis forutsier denne beregningen med rettferdig nøyaktighet den faktiske høyden på hydrogel, målt ved å utarbeide en gel med perle belagt coverslips på både toppen og bunnen og ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop for å måle avstanden mellom de to perle flyene. Det er imidlertid observert at den faktiske høyden på hydrogel kan avvike fra denne beregningen ved ± 20 μm (f. eks, avhengig av tykkelsen og produsenten av de øverste glass dekkglass). Direkte måling av gel høyde ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor anbefales. - La gelen å polymeres i 30 min, og deretter fjerne den øverste dekkglass forsiktig med tang. Legge til 50 mM HEPES pH 8,5 til parabolen kan lette fjerning. Vask i 5 minutter i 50 mM HEPES pH 8,5 tre ganger.
- Klargjør hydrogel løsning av akrylamid og BIS-akrylamid. Bland løsningen i henhold til tabell 1, legg deretter til 2,5 μL av 10% APS og 0,5 ΜL av TEMED. Bland godt. Gå umiddelbart til neste trinn.
- Hydrogel aktivisering og ekstracellulære matrise belegg
- Aktiver hydrogel overflate ved incubating i 0,4 mM Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate) i 50 mM HEPES pH 8,5. Utsettes umiddelbart for en UV-bue lampe i et lukket område.
Merk: Beskytt SULFO-SANPAH fra lys før aktivering. For en 400 W-lampe plasserer du gelen 10 cm fra pæren i lys boksen og lyser for 100 s. Sulfo-SANPAH-løsningen vil skifte fra lys oransje til mørk brun. - Vask i 5 minutter i 50 mM HEPES pH 8,5 tre ganger.
Merk: hydrert gels kan oppbevares ved 4 ° c i opptil en uke. - Ruge den aktiverte hydrogel i 20 μg/mL fibronektin i 50 mM HEPES pH 8,5 for 1 t ved 37 ° c.
- Aspirer den fibronektin løsningen og vask i 5 min i fosfat-bufret saltvann (PBS) tre ganger. Sterilisere hydrogel og lokket på parabolen i 15 min under UV-lys i en vev kultur hette med et lavt volum av PBS. Vask en gang i steril PBS.
Merk: andre typer ECM-protein kan brukes til å belegge hydrogel, inkludert kollagen og laminin.
- Aktiver hydrogel overflate ved incubating i 0,4 mM Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate) i 50 mM HEPES pH 8,5. Utsettes umiddelbart for en UV-bue lampe i et lukket område.
2. plating celler
- Tilsett 3 mL medium som inneholder 21 000 celler for å fylle en 60 mm rett for en endelig celle tetthet på ~ 1000 celler/cm2. Juster seeding tettheten etter behov for å hindre trengsel og tillate fri bevegelse av individuelle celler.
- La cellene gjenopprette ved 37 ° c i minst 4 timer og i opptil 18 timer før bildebehandling. Forbered bildebehandling ved å skylle med bilde medier to ganger før du legger til bilde medier. La cellene likevekt i minst 30 minutter før bildebehandling.
Merk: skjerm medier betingelser på forhånd for å bestemme forhold som vil optimalisere migrering i cellelinjen som brukes. For SKOV-3 celler, DMEM uten fenol rød, inneholdende 20 mM HEPES og 12,5 ng/mL epidermal vekstfaktor stimulerer mest migrasjon. Optimale forhold for Ref52 celler er ringer buffer med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 25 ng/mL blodplate-avledet vekstfaktor.
3. utarbeidelse av glass micropipette: pipette trekke og smi
- Pull 100 mm lange Borosilikatglass glass Mikropipetter med en 1,0 mm utvendig og 0,58 mm innvendig diameter i en to-trinns prosess for å oppnå en taper over 2 mm som reduserer til ~ 50 μm i den første millimeter og strekker seg til en lang, parallell 10 μm diameter rør i den siste millimeter.
- Load trakk Pipet inn i en microforge. Forme Pipet å ha en 15 μm avstumpet spissen som er omsluttet helt på slutten av en 250 μm delen bøyd i en ~ 35 ° vinkel fra resten av Pipet. Den omtrentlige diameter på svingen bør være rundt 30 μm å låne styrke til spissen.
Merk: konisk-og tip-dimensjoner kan justeres til å bruke ønsket kraft riktig (se trinn 5). Trekke Mikropipetter ved 65 ° c for første trinn for 3 mm, og 60 ° c for det andre trinnet produserer dimensjonene beskrevet i trinn 3,1. Resultater som bruker forskjellige Pipet pullers kan variere. - Sterilisere micropipette i 70% etanol før bruk.
4. posisjonering av micromanipulator og micropipette
- Fjern parabolen lokket og laste parabolen på mikroskopet scenen og sentrum. Bruk en 10X eller tilsvarende lav forstørrelse mål. Dekk mediene med mineralolje for å hindre fordampning av Media.
-
Innsetting dratt Pipet
- Sett den trakk Pipet inn i micropipette skjede, peker kroken ned mot parabolen. Tuppen av kroken vil være det laveste punktet når senket til gel.
- Sett inn skjede i micromanipulator og Juster til spissen av Pipet er sentrert over objektivlinsen i både X og Y retninger.
- Senk Pipet med grov manipulator til den bare berører overflaten av væsken.
- Bruk fase kontrast eller brightfield til å fokusere mikroskopet på perle laget på toppen av gelen. Dette vil være referanseplanet.
- Å sikre at målet er ikke i fare for å treffe prøven eller scenen, bringe fokus over gel for å finne spissen av micropipette, ved hjelp av små justeringer av grov manipulator i X og Y retninger å kaste skygger på fokalplanet. Bare Senk micropipette når sikker på at selve spissen av Pipet er i synsfeltet.
- Sørg for at den avstumpet tuppen av micropipette peker ned ved å dreie Pipet i skjede eller rotere skjede i micromanipulator inntil spissen er vinkelrett på fokalplanet. Gjenta trinn 4,4 og 4,5 etter behov. Fokuser på tuppen av Pipet.
- Focus tilbake ned til toppen perle laget av gel å måle hvor langt Pipet er fra gel overflaten. Focus tilbake opp til et fly som er en del måte mellom gel og spissen av Pipet. Senk Pipet sakte for å nå det mellomliggende fokalplanet.
- Gjenta trinn 4,6 til svært svake skygger fra tuppen av micropipette kan bli verdsatt når du fokuserer på hydrogel. Øk til neste høyeste forstørrelse.
- Senk micromanipulator til skygger og refraksjoner av selve spissen av micropipette kan bli verdsatt innenfor perle laget fokalplanet.
- Øk forstørrelsen til det som vil bli brukt i eksperimentet. Senk Pipet til den svever rett over overflaten på hydrogel.
5. kalibrering av micromanipulator og styrkegenerering
- I fase eller brightfield, Senk svever micropipette å berøre overflaten av hydrogel. Observer hvordan Pipet ser ut ved kontakt med hydrogel. Fortsett å senke micropipette i Z til justeringer i X og Y forårsaker trekk og utslag av hydrogel i disse retningene. Bruk mikrosfærer eller nærliggende celler som tillits tegn.
Merk: Hvis micromanipulator er festet til fase kondensator armen eller benken og ikke prøve scenen selv, må du alltid løsne gelen før du flytter scenen for å unngå å bryte Pipet eller forstyrrende celler. Hvis Pipet brytes, går du tilbake til trinn 3 og trinn 4. - Finn et område blottet for celler for å engasjere gel. Trekk den i alle retninger og bli komfortabel med måten mikromanipulering oversettes til deformasjon av gel.
- Ta fluorescerende bilder av perle feltet uten manipulasjon, med Pipet engasjerende gelen, og med den engasjerte Pipet trekke gel. Gjentagelse denne adskillige timene tar fint notater angående det sjekke av merkene på micromanipulator, måten det Pipet tips ser ut inne Phase eller brightfield for hver scene av rykk, og avstanden tipset beveger benytter det manipulasjon.
- Bruk ImageJ som tidligere beskrevet16,17 for å beregne relative bead forskyvninger og kraft brukt på perlene ved å sammenligne null perle feltet til perle feltet uten Pipet engasjement, perle feltet med gel engasjert, og trukket gel.
- Å finjustere strek stimulans, sammenligne tvinge programmet ved hjelp av ulike micropipette spissen dimensjoner, avstander fra cellen, eller avstand trukket av micromanipulator fra første punkt på touchdown. Effekten av den micropipette spiss dimensjonen på kraft applikasjonen gir stor fleksibilitet for brukeren, men demonstrerer også behovet for å generere kraft kart for nye Mikropipetter, selv når dimensjonene og formen ligner tidligere kalibrert tips.
6. gjennomføre durotaxis analysen
- Før du utfører eksperimentet, øve engasjere gelen nær en celle og observere deformasjon av cellen når micromanipulator er flyttet.
- Overvåk en gruppe celler som har klar polaritet, og som ser ut til å bevege seg i 30 minutter for å identifisere celler som beveger seg på en rettet måte.
- Velg en celle som beveger seg i en enkel, klar retning, og Overvåk den med ønsket bildefrekvens i ytterligere 30 minutter.
- Hvis fastsettelse av krefter som utøves på cellen eller spenningen som utøves av cellen er ønskelig, ta perle feltet bilder ved hvert oppkjøp. Hvis cellen endrer retning under overvåking, velger du en annen celle for å overvåke da dette vil gjøre det vanskelig å fastslå effekten av stimulering.
- Engasjer hydrogel ca. 50 μm unna cellen. Plasser Pipet foran den nær siden av forkanten og Flytt micromanipulator slik at gelen blir deformert ortogonalt til cellens kjøreretning på. Observer cellen over tid som den reagerer på den akutte, lokale gradient av stivhet.
Merk: timingen gitt her er effektiv når du overvåker SKOV3 eller Ref52 fibroblaster, men intervallet og total tid kurs bør justeres for å passe til celle type og biologisk hendelse blir observert. Hvis sammenkoblingen med fluorescens mikroskopi, pause fluorescerende oppkjøpet umiddelbart før trinn 6,5., bruk fase kontrast eller brightfield til posisjon micropipette og trekk, og start fluorescerende oppkjøp umiddelbart etter. - Hvis Pipet slips eller hvis gradient er ellers avslappet eller løslatt, finne en ny celle ved å gjenta trinn 6,2 og 6,3.
7. fastsettelse av durotactic overførings respons
- Bruke ImageJ19 eller et annet bildeanalyse program, beregne svingvinkelen ved å tegne en linje mellom midten av forkanten av cellen ved 0 min og 30 min innlegg Monitor (som reflekterer cellens opprinnelige banen) og en annen linje mellom midten av forkanten like før og 80 min etter stimulering og måling av vinkelen mellom disse to linjene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å forberede Mikropipetter (figur 1) og normalisere kraft generering av trekker (figur 2 og Figur 3) som beskrevet ovenfor, har optimale durotactic forhold blitt identifisert for flere cellelinjer. Ved hjelp av denne teknikken, som beskrevet i Figur 4, både SKOV-3 eggstokkene kreftceller17 og Ref52 rotte embryonale fibroblaster (figur 5) bevege seg mot økt stivhet i graderinger påføres av et glass micropipette. I tillegg til durotaxis kan denne metoden brukes til å studere dynamiske signal hendelser ved hjelp av fluorescerende biosensors og markører. For eksempel kan strukturen og signalering innenfor fokal vedheft strukturer observeres ved durotactic stimulering. Vinculin spenning sensor (VinTS) er et bånd-basert Biosensor som lokaliseres å fokal adhesjon, slik at for fluorescerende observasjon av fokal vedheft dynamikk og måling av endringer i spenning innenfor disse strukturene19. Ref52 celler midlertidig uttrykker VinTS på 125 kPa polyakrylamid gels viser dannelsen av fokal adhesjon i retning av strekningen overtids perioden på 40 min (figur 6a). BÅND analyse20 avslører at vinculin lokalisert til fokal adhesjon opplever en umiddelbar endring i spenning når det presenteres med akutt durotactic stimulering (figur 6b) utvide nytten av denne analysen til observasjon av subcellulære hendelser som reaksjon på durotactic stimulering.
Figur 1. Diagrammer av typisk trukket (A) og smidd (B) Mikropipetter. (A) Mikropipetter trekkes ved hjelp av en to-trinns protokoll for å oppnå en taper fra 1 mm til 10 μm over 2 mm. (B) Mikropipetter blir deretter lastet inn i microforge og deres tips er bøyd, omsluttet, og forkortet slik at de siste 250 μm av micropipette er bøyd på en ~ 35 ° vinkel og tapers fra ~ 30 μm til en avrundet tupp som måler ~ 15 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Forbedret perle feltet etter etanol belegg i forhold til tradisjonelle metoden ved hjelp av Poly-L-lysin. Representative hydrogel bead felt fra Poly-L-lysin og etanol (EtOH) fordampning dekkglass belegg metoder ved hjelp av gul-grønn, rød, og mørk-rød fluorescerende perler. Skala bar: 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Generering av makt kart for et eksempel durotactic strekk. (A) plassering av fluorescerende mikrosfærer før og etter (pseudo-farget grønn og rød, henholdsvis) deformeres hydrogel med en micropipette (plassert utenfor høyre kant av panelet). Skala bar: 25 μm. Forskyvning vektorer (B) og forskyvning varmekartet (C) mellom null og trakk perle felt generert av traction Force mikroskopi plugins i ImageJ markere gradient av perle forskyvning og hydrogel belastning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Skjematisk av durotaxis analysen og bestemmelse av utslag vinkel. (A) en celle er observert i minst 30 min for å bestemme sin opprinnelige banen. (B) micropipette er posisjonert ortogonalt til cellens bane, 50 μm fra cellekanten. Hydrogel er engasjert av micropipette slik at å flytte micropipette vil utøve makt på overflaten av hydrogel. (C) micropipette trekkes ytterligere 20 μm bort fra cellen, ortogonale til cellens bane som skaper en akutt, lokal gradient av spenning (betegnet i blått) som øker mot micropipette. (D) cellen er observert over tid som den navigerer anvendt gradient. (E) i ImageJ eller et bildeanalyse program, er den opprinnelige banen (stiplet linje) markert med en linje som trekkes fra midten av cellen gjennom midten av forkanten i det første bildet. Den endelige banen (heltrukket linje) er markert med en linje som tegnes etter at cellen har tillatelse til å navigere i den brukte spennings graderingen. Vinkelen mellom disse to linjene mot stimulans kalles "sving vinkel," merket her ved θ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Rat embryonale fibroblaster bevege seg mot områder med økt substrat stivhet i durotaxis. Tid kurs viser durotactic bevegelse av en Ref52 celle 10 min før pull (panel 1), 1 min før pull (panel 2), på tidspunktet for pull (panel 3), og 1 h etter pull (panel 4). Pil angir retningen på strekningen. Scale bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Protein lokalisering og aktivitet under durotactic stimulering ved hjelp av fluorescerende markører eller biosensors. Ref52 celler midlertidig uttrykker Vinculin spennings sensor (VinTS)19 migrering på 125 kPa polyakrylamid gels presenteres med akutt durotactic stimulering. (A) etter stimulering, nye fokal adhesjon form i retning av strekk som celler re-orientere langs stivhet gradient. For 2 10 min perioder, starter 20 min før mekanisk stimulering og 21 min etter stimulering, ble celle morfologi (øverst) og fokal vedheft formasjon (nederst) overvåket. Rød farge indikerer den første timepoint innenfor tidsperioden og grønn farge indikerer timepoint 10 min senere. Nye fokal adhesjon som dannes innen 10 min perioden vises i grønt. Før stimulering, nye fokal adhesjon form i retning av reiser. Etter stimulering, nye fokal adhesjon form i retning av strekningen. Pil angir retningen på strekningen. Pilspisser indikerer områder med fokal adhesjon dannet over at 10 min periode. Skala bar: 25 μm. (B) bånd analyse av VinTS fluorescens indikerer en endring i spenning i fokal adhesjon proksimale å durotactic strekk. Omriss av cellemembranen før og etter strekk markere deformasjon av celle ved stimulering. Pilspisser viser eksempler på fokal adhesjon som opplever endringer i bånd forholdet ved strekk. Scale bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ønsket hydrogel stivhet | 3 kPa | 25 kPa | 125 kPa |
| 7,5% akrylamid | 100 μL | 100 μL | 160 μL |
| 0,5% BIS-akrylamid | 10 μL | 100 μL | 100 μL |
| ddH2O | 287 μL | 197 μL | 137 μL |
Tabell 1. Akrylamid gel løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Demonstrert her er en repeterbar, Single-Cell durotaxis analysen som tillater vurdering av en celle evne til å endre sin migrasjon atferd som svar på akutte mekaniske signaler. Denne teknikken kan også brukes i kombinasjon med fluorescens mikroskopi og passende Fusion proteiner eller biosensors for å undersøke subcellulære signalering og cytoskjelettkomponenter hendelser i løpet av sekunder av mekanisk stimulering eller over en lengre tidsskala under durotactic bevegelse. Forstå en celle forhold til sine omgivelser innebærer studiet av virkningen av både kjemiske og mekaniske aspekter av dette miljøet. Selv om potensielt vanskelig å mestre, kan dette durotaxis analysen bli mye brukt til å forstå den cellulære responsen på endringer i sin mekaniske mikromiljøet.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Som nevnt tidligere, er denne micropipette metoden for durotactic stimulering svært manipulable, slik at en høy grad av spatiotemporal kontroll over mekaniske stimuli, en stor fordel i forhold til andre teknikker, slik som pre-formet lineær eller trinn-graderinger av stivhet. Størrelsesorden og retning av formidlet belastningen gradienter kan bli visualisere ved å spore forskyvning av fluorescerende perler innebygd i hydrogel, nær cellen kulturen overflaten.
Begrense disse fiducial markører til et enkelt lag rett under kulturen overflaten øker nøyaktigheten av denne sporingen. Mikrosfærer ligger nedenfor flyet av utslag (formidles enten av micropipette eller, for trekkraft kraft mikroskopi, av mobilnettet contractility), som ville skje med å blande mikrosfærer jevnt gjennom hydrogel, vil flytte mindre enn in-plane mikrosfærer, som kan føre til undervurdering av anvendte krefter. Dessuten er denne endringen lettere å utføre og mer pålitelig enn metoder som perler er kledde i et ekstremt tynt lag av polyakrylamid støpt på toppen av en pre-formet gel21 eller brakt til hydrogel overflaten av tyngdekraften-assistert bosetting22 og gir en jevnere spredning av perler over hydrogel enn tidligere beskrevet metoder17,23.
Modifisering og fremtidige bruksområder
Detaljene i denne analysen kan endres til best passer til cellen linje av interesse. For eksempel kan en rekke ekstracellulære matrise molekyler (f. eks kollagen I, kollagen IV, laminin) eller andre selvklebende ligander brukes til å funksjonalisere hydrogel. Hydrogel Start stivhet kan også enkelt heves eller senkes ved å justere forholdet mellom akrylamid og BIS-akrylamid (se tabell 1). Ved å endre dimensjonene på micropipette spissen og omfanget av pull, denne analysen kan optimaliseres for å formidle en repeterbar og effektiv durotactic stimulans for celletypen i spørsmålet.
Kritiske trinn og feilsøking
Bare celler etter en jevn, lineær bane av migrasjon før hydrogel manipulasjon bør stimuleres for å sikre at endringer i banen er på grunn av den mekaniske stimulans og ikke tilfeldige svingninger. Det må utvises forsiktighet for å dikte opp et glass micropipette som engasjerer hydrogel overflate uten å skli, men ikke rive gelen når den trekkes. Det er viktig å bruke en jevn, konstant strekk til hydrogel i løpet av eksperimentet for å få rene resultater som betyr at brukeren skal praktiseres på å plassere og flytte micropipette før møte en celle. Enhver utilsiktet bevegelse av micropipette som fører til endringer i spenning gradient kan påvirke cellens evne til å durotax. Tilsvarende bør manipulering av gelen praktiseres med hver nye micropipette som er smidd som små endringer i Pipet form kan føre til at Pipet/gel interaksjon varierer.
Unnlatelse av å posisjonere micropipette innenfor mikroskopisk synsfelt før økende forstørrelse kan føre til utilsiktet brudd på den skjøre glass spissen. Sørg for at høyden og X-Y-posisjonen til spissen er kjent før du senker micropipette med micromanipulator. Overvåk alltid posisjonen til micropipette for å redusere risikoen for brudd. Det anbefales at forstørrelsen senkes ned igjen til 10X for hver nye micropipette lastet inn i micromanipulator som små bevegelser av micromanipulator og Pipet skjede kan føre til store åpenbare endringer i plasseringen av nylig lastet micropipette.
Før du finner celler å observere, er det viktig å først teste micropipette å bekrefte at det vil engasjere hydrogel som forventet, og at det er egnet for å bruke den ønskede strekningen. Finne tips dimensjoner som passer til eksperimentet og celle type er avgjørende for å lykkes i å bruke durotactic stimulering. Slutten av micropipette skal avrundes nok slik at den ikke bryte gjennom gel, men ikke så avrundet at den ikke klarer å gripe den. Hvis Pipet ikke trekker gel effektivt, kan det være glir langs overflaten. Formen på micropipette spissen kan være for avrundet til riktig engasjere seg med gel overflaten. Dimensjonene på selve spissen av micropipette bør justeres til firmaet, jevn kontakt kan oppnås konsekvent. I noen tilfeller der micropipette glir over gel overflaten, kan det være nødvendig å senke micropipette lenger inn i hydrogel for å få mer trekkraft. Hvis micropipette tårer gjennom gel, kan spissen være for fin eller for skarp. Gel rive kan også indikere for mye kraft blir brukt mens du trekker. Micropipette bør heves litt for å redusere gel deformasjon og trekke kortere avstander.
Ofte, hvis cellen eller kanten av cellen er trukket ut av fokus ved micropipette, spissen av micropipette er engasjert for nær cellen eller strekningen er for kraftig. Flytte micropipette lenger fra cellen, bare litt deformeres cellen i X-Y-flyene. Flytte cellen ut av fokus vil ikke bare gjøre cellulære hendelser umulig å overvåke og forårsake optiske avvik, men det vil føre til at cellen til å oppleve mer stimulering enn 2-dimensjonal spenning gradient ment.
Viktigst er det viktig å ta opp og analysere bare svar som har konsistent durotactic manipulasjon med minimal menneskelig feil. Hvis senking av spissen er unøyaktig, eller hvis micropipette flyttes, vil resultatene av eksperimentet bli formørket. Siden denne analysen er kompleks og mange trinn er utsatt for feil, må forsiktighet tas på hvert trinn for å unngå utilsiktede endringer i stimulering av celler. Svikt på noe trinn kan føre til inkonsekvent strekke programmet og upålitelige resultater.
Begrensninger
Det er begrensninger på denne teknikken som bør vurderes. Mest fremtredende, nøyaktig smi og manipulering av glass Mikropipetter kan presentere en bratt læringskurve for nye brukere. I tillegg må posisjonen og omfanget av hydrogel pull optimaliseres for ulike cellelinjer. Undersøke fluorescerende perle forskyvninger før og etter hydrogel manipulasjon kan hjelpe med dette aspektet av teknikken. Likeledes, stund teknikken innrømmer høy spatiotemporal observasjon av durotactic opptreden inne individ celler, denne lager den en lav-produksjon analysen. Det er derfor viktig å påpeke at denne analysen kan også suppleres med andre teknikker med lavere manipulability, men høyere gjennomstrømning, for eksempel ved hjelp av hydrogeler med pre-formet graderinger av stivhet, å analysere durotactic atferden til større populasjoner av celler samtidig. Oppsummert den høye graden av spatiotemporal kontroll av mekaniske signaler by av single-Cell durotactic analysen gjør det svært nyttig for analysering av molekylære mekanismer som bidrar til durotactic atferden til mange forskjellige celletyper under mange Forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
