Summary
As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.
Abstract
Durotaxis é o processo pelo qual as células sentem e respondem a gradientes de tensão. A fim de estudar este processo in vitro, a rigidez do substrato subjacente a uma célula deve ser manipulada. Quando os hidrogéis com rigidez graduada e os ensaios a longo prazo da migração provaram útil em estudos do durotaxis, as respostas imediatas, agudas às mudanças locais na tensão da carcaça permitem o estudo focalizado de movimentos individuais da pilha e de eventos de sinalização subcellular. Para testar repetivelmente a capacidade das células de sentir e responder à rigidez subjacente do substrato, um método modificado para aplicação de gradientes agudos de tensão aumentada para células individuais cultivadas em hidrogéis deformáveis é usado, o que permite o tempo real manipulação da força e direção dos gradientes de rigidez transmitidos sobre as células em questão. Adicionalmente, ajustando os detalhes e os parâmetros do ensaio, tais como a forma e as dimensões da micropipeta ou a posição relativa, a colocação, e a direção do gradiente aplicado, o ensaio pode ser otimizado para o estudo de qualquer tipo e sistema de células sensíveis. Esses parâmetros podem ser alterados para alterar de forma confiável o estímulo aplicado e ampliar a funcionalidade e a versatilidade do ensaio. Este método permite a examinação do movimento durotactic a longo prazo assim como umas mudanças mais imediatas na sinalização celular e na dinâmica morfológica em resposta à rigidez de mudança.
Introduction
Ao longo das últimas décadas, a importância das propriedades mecânicas do ambiente de uma célula tem aumentado o reconhecimento na biologia celular. Diferentes tecidos e matrizes extracelulares têm diferentes rigidez relativa e, à medida que as células migram por todo o corpo, elas navegam nessas mudanças, utilizando essas propriedades mecânicas para orientá-las1,2,3 , 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. Cells use a rigidez de um determinado tecido para informar seu comportamento motile durante processos tais como o desenvolvimento, a cura da ferida, e a metástase do cancro. No entanto, os mecanismos moleculares que permitem a sensação e a resposta a essas entradas mecânicas permanecem em grande parte desconhecidos1,2,3,4,5, 6 anos de , o 7.
A fim de estudar os mecanismos através dos quais as células respondem às pistas ambientais físicas, a rigidez ou rigidez do substrato subjacente às células aderentes deve ser manipulada. Em 2000, Chun-min lo, Yu-li Wang e os colegas desenvolveram um ensaio8 pelo qual a resposta motile de uma célula individual à mudança de pistas mecânicas poderia ser testada diretamente pelo alongamento da matriz extracelular deformável (ECM)-revestido de poliacrilamida hidrogéis em que as células foram chapeadas. As células exibem uma preferência significativa pela migração para substratos mais rígidos, um fenômeno que eles apelidaram de "durotaxis".
Desde o relatório original em 2000, muitas outras técnicas foram empregadas para o estudo do durotaxis. Gradientes de rigidez íngreme foram fabricados por géis de fundição sobre características rígidas, tais como grânulos de poliestireno9 ou postes de polímero rígido10 ou por polimerizar o substrato em torno das bordas de uma lamínulas de vidro11 para criar mecânica ' limites dos passos». Alternativamente, os hidrogéis com gradientes de rigidez mais rasos, mas fixos, foram fabricados por uma variedade de métodos, como gradientes de chapéu cabeado criados por dispositivos microfluílicos12,13 ou gotas de solução hidrogel lado a lado de diferentes rigidez8, ou hidrogéis com chapéu cabeado fotorativo tratados com exposição à luz UV graduada para criar um gradiente de rigidez linear14,15. Estas técnicas têm sido usadas com grande efeito para investigar o movimento celular durotactic en masse ao longo do tempo. Entretanto, tipicamente estas características são fabricadas adiantado do chapeamento de pilha e suas propriedades permanecem consistentes sobre o curso da experimentação, confiando no movimento aleatório da pilha para a amostragem de Gradients mecânicos. Nenhuma dessas técnicas é capaz de observar mudanças rápidas no comportamento celular em resposta ao estímulo mecânico agudo.
A fim observar respostas celulares às mudanças agudas no ambiente mecânico, os ensaios da única pilha durotaxis oferecem diversas vantagens. Nestes ensaios, as células individuais recebem um estímulo agudo e mecânico, puxando o substrato subjacente para longe da célula com uma micropipeta de vidro, introduzindo assim um gradiente direcional da tensão da célula-matriz. As mudanças no comportamento do motile, tais como a velocidade ou a direção da migração, são observadas então pela microscopia de contraste da fase da vivo-pilha. Essa abordagem facilita a observação direta das relações de causa e efeito entre estímulos mecânicos e migração celular, pois permite a manipulação rápida e iterativa da direção e magnitude do gradiente de tensão e da avaliação da conseqüente respostas celulares em tempo real. Além disso, este método também pode ser usado para estimular mecanicamente as células que expressam proteínas de fusão fluorescente ou biossensores para visualizar alterações na quantidade, atividade ou localização subcelular de proteínas suspeitas de estarem envolvidas em mecanosensoriamento e durotaxis.
Esta técnica tem sido empregada por grupos que estudam durotaxis8,16 e é descrito aqui como foi adaptado pelo laboratório de Howe para estudar o comportamento durotáctico de SKOV-3 células cancerosas ovarianas e os mecanismos moleculares que Underly durotaxis17. Adicionalmente, um método modificado é descrito para a fabricação de hidrogéis com uma única, mesmo camada de microesferas fluorescentes perto da superfície da cultura da pilha; Isso facilita a visualização e otimização de gradientes de deformação gerados por micropipeta e pode permitir a avaliação da contratilidade celular por microscopia de força de tração.
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Protocol
1. fabricação de hidrogéis deformable de polyacrylamide com as microesferas fluorescentes encaixadas
Nota: As direções descrevem a polimerização de um hidrogel de 25 kPa com 22 μm de diâmetro e aproximadamente 66 μm de espessura. Cada um ou todos estes parâmetros podem ser modificados e direções para fazê-lo podem ser encontrados na tabela 1 e nas notas17.
- Ativação de pratos de fundo de vidro ou coberturas
- Prepare a solução de trabalho do silano do ligamento para a ativação de um prato do vidro-fundo da imagem latente ou de um lamela que caiba em uma câmara da imagem latente da viver-pilha. Misturar 950 μL de 95% de etanol, 50 μL de ácido acético glacial e 5 μL de silano de ligamento (y-metacriloxipropiltrimetoxisilano).
Nota: Usar um lamela inferior maior comparado ao lamela superior dará o quarto adicional trabalhar ao preparar o gel e facilitará posicionar a micropipeta de vidro em umas etapas mais atrasadas. Além disso, se utilizar uma lamínula em vez de um prato de imagem de fundo de vidro, limpe a lamínula conforme descrito na secção seguinte. - Ative a superfície do vidro para 20 s com uma varinha de Corona e imediatamente sobrepor 50 μL da solução de trabalho do silano de ligação. Deixe a solução secar por 10 min.
- Enxague duas vezes com 95% de etanol, depois duas vezes com isopropanol e, em seguida, permitir que as coberturas para airdry por aproximadamente 20 min.
Nota: o vidro ativado pode ser armazenado por até uma semana em um desiccator.
- Prepare a solução de trabalho do silano do ligamento para a ativação de um prato do vidro-fundo da imagem latente ou de um lamela que caiba em uma câmara da imagem latente da viver-pilha. Misturar 950 μL de 95% de etanol, 50 μL de ácido acético glacial e 5 μL de silano de ligamento (y-metacriloxipropiltrimetoxisilano).
- Limpeza Top COVERSLIP
- Limpe os COVERSLIP superiores de 22 milímetros incubando no HCl de 2% em 70 ° c por 30 minutos, a seguir lave em ddH2O por 10 minutos duas vezes.
- Incubar as coberturas em uma solução de 2% de limpeza de cubeta concentrado em ddH2o a 50 ° c por 30 min, em seguida, lave em DDH2o por 10 min duas vezes.
- Incubar as coberturas em ddH2o a 90 ° c por 30 min, em seguida, em 70% etanol a 70 ° c por 10 min, e depois secar ao ar a 60 ° c por um mínimo de 2 h.
Nota: Os COVERSLIP limpos podem ser armazenados indefinidamente em um dessecador limpo.
- Microesfera fluorescente/deposição de talão sobre coberturas superiores
- SONICATE a solução de estoque de microesferas fluorescentes para 1 h em um banho de água ultra-sônica. Faça uma solução do grânulo de trabalho diluindo o estoque 1:200 do grânulo em 100% etanol e proceda outra vez para 1 h.
- 15 min antes de a solução de cordão terminar de sonicar, limpe cuidadosamente as coberturas colocando-as verticalmente em um suporte de cobertura de cerâmica e tratando com plasma de ar ambiente por 3 min em um limpador de plasma de mesa.
- Para facilitar a manipulação e impedir deslizar da lamínula durante etapas subseqüentes, coloc uma parte de parafilm em uma tampa do prato de Petri de 60 milímetros ou em um recipiente similar. Coloque o lamínula no estabilizador e bata levemente para baixo, assegurando o bom contato entre o parafilm e o lamela.
- Para uma lamínula de 22 mm, adicione 150 μL da solução de cordão de trabalho à parte superior da lamínula. Aspirar imediatamente a solução de etanol fora do lado da lamínula, deixando as contas na lamínula. Deixe a lamínula secar.
Nota: a quantidade de trabalho de talão de solução adicionada deve ser ~ 4 μl/cm2 e pode ser dimensionado para acomodar qualquer tamanho COVERSLIP.
- Fundição de hidrogéis com grânulos fluorescentes incorporados
- Prepare a solução de hidrogel de acrilamida e bis-acrilamida. Misture a solução de acordo com a tabela 1, em seguida, adicione 2,5 μL de 10% APS e 0,5 ΜL de TEMED. Misture bem. Mova-se imediatamente para a próxima etapa.
Nota: a mistura da solução do hidrogel pode ser alterada para variar o módulo de Young, ou a rigidez, do hidrogel mudando a relação do acrilamida ao bis-acrilamida como mostrado na tabela 1. Estes valores foram verificados para uso no laboratório de Howe usando microscopia de força atômica, mas devem ser confirmados dentro de uma instituição. - Imediatamente após fazer a solução do hidrogel, adicione uma gota de 25 μL ao lado ativado do prato do vidro-fundo ou do lamela inferior, a seguir coloc imediatamente o lamela grânulo-revestido na solução, lado do grânulo para baixo. Entrar em contato com a gota com o lado mais distante da lamínula seguida de redução lenta ajuda a evitar armadilhas de bolhas de ar dentro do Hydrogel.
Nota: a altura do hidrogel deve estar bem dentro da distância de trabalho da lente objetiva a ser usada no experimento posterior. Uma altura de hidrogel de 66 μm funciona bem para a maioria dos sistemas. O tamanho do hidrogel pode ser escalado adicionando mais ou menos solução do hidrogel dependendo do tamanho do COVERSLIP. Para calcular o volume adequado de solução de hidrogel, use a equação para o volume de um cilindro, V = πr2h onde r é o raio de lamínula e h é a altura de hidrogel desejada. Tipicamente, este cálculo prevê com exatidão justa a altura real do Hydrogel, como medido preparando um gel com os COVERSLIP grânulo-revestidos na parte superior e na parte inferior e usando um microscópio confocal para medir a distância entre os dois planos do grânulo. No entanto, observou-se que a altura real do hidrogel pode desviar-se deste cálculo por ± 20 μm (por exemplo, dependendo da espessura e do fabricante da lamínula de vidro superior). A medida direta da altura do gel usando o método descrito acima é recomendada. - Permita que o gel polimerize por 30 minutos, a seguir remova o lamela superior delicadamente com fórceps. Adicionando 50 mM HEPES pH 8,5 para o prato pode facilitar a remoção. Lave por 5 min em 50 mM HEPES pH 8,5 três vezes.
- Prepare a solução de hidrogel de acrilamida e bis-acrilamida. Misture a solução de acordo com a tabela 1, em seguida, adicione 2,5 μL de 10% APS e 0,5 ΜL de TEMED. Misture bem. Mova-se imediatamente para a próxima etapa.
- Ativação de hidrogel e revestimento de matrizes extracelulares
- Ative a superfície do hidrogel incubando em 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoato) em 50 mM HEPES pH 8,5. Expor imediatamente a uma lâmpada de arco UV em uma área fechada.
Nota: Proteja sulfo-sanpah da luz antes da ativação. Para uma lâmpada 400 W, posicione o gel a 10 cm de distância do bulbo dentro da caixa de luz e ilumine por 100 s. A solução de sulfo-SANPAH mudará da laranja brilhante ao marrom escuro. - Lave por 5 min em 50 mM HEPES pH 8,5 três vezes.
Nota: os géis hidratados podem ser armazenados a 4 ° c durante uma semana. - Incubar o hidrogel ativado em 20 μg/mL de fibronectina em 50 mM HEPES pH 8,5 por 1 h a 37 ° c.
- Aspire a solução de fibronectina e lave por 5 min em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) três vezes. Esterilize o hidrogel e a tampa do prato por 15 minutos a luz UV em uma capa da cultura do tecido com um baixo volume de PBS. Lave uma vez em PBS estéril.
Nota: outros tipos de proteína do ECM podem ser usados para revestir o hidrogel que inclui o colagénio e o laminin.
- Ative a superfície do hidrogel incubando em 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoato) em 50 mM HEPES pH 8,5. Expor imediatamente a uma lâmpada de arco UV em uma área fechada.
2. células de chapeamento
- Adicionar 3 mL de mídia contendo 21.000 células para encher um prato de 60 mm para uma densidade celular final de ~ 1000 células/cm2. Ajustar a densidade de semeadura conforme necessário para evitar a aglomeração e permitir a livre circulação de células individuais.
- Permita que as pilhas recuperem em 37 ° c por pelo menos 4 h e para até 18 h antes da imagem latente. Prepare-se para a criação de imagens enxaguando com mídia de imagem duas vezes antes de adicionar mídia de imagem. Permita que as pilhas equilibrem pelo menos 30 minutos antes da imagem latente.
Nota: as condições de mídia de tela com antecedência para determinar as condições que otimizarão a migração na linha de célula que está sendo usada. Para as células de SKOV-3, DMEM sem fenol vermelho, contendo 20 mM de HEPES e 12,5 ng/mL fator de crescimento epidérmico estimula a maior migração. As condições ideais para células Ref52 são tampão de Ringer com soro bovino fetal a 10% (FBS) e fator de crescimento derivado de plaquetas de 25 ng/mL.
3. preparação da micropipeta de vidro: pipeta puxando e forjando
- Puxe 100 mm de Micropipetas de vidro de borosilicato de comprimento com um exterior de 1,0 mm e diâmetro interior de 0,58 mm num processo de duas etapas para obter uma conicidade com mais de 2 mm que se reduz a ~ 50 μm no primeiro milímetro e estende-se a um tubo de diâmetro de 10 μm longo e paralelo no último milímetro.
- A carga puxou o Pipet em um microforge. Dê forma ao Pipet para ter uma ponta Blunted de 15 μm que seja fechado na extremidade muito de uma seção do μm 250 dobrada em um ângulo de ~ 35 ° do descanso do Pipet. O diâmetro aproximado na curvatura deve ser em torno de 30 μm para emprestar força à ponta.
Nota: as dimensões do atarraxamento e da ponta podem ser ajustadas para aplicar corretamente a força desejada (veja etapa 5). Puxando micropipetas a 65 ° c para o primeiro passo para 3 mm, e 60 ° c para a segunda etapa produz as dimensões descritas na etapa 3,1. Os resultados que utilizam diferentes extratores de Pipet podem variar. - Esterilizar a micropipeta em 70% de etanol antes de usar.
4. posicionar o micromanipulador e a micropipeta
- Retire a tampa do prato e coloque o prato na fase do microscópio e no centro. Use um objetivo de ampliação 10X ou similarmente baixo. Cubra a mídia com óleo mineral para evitar a evaporação dos meios de comunicação.
-
Inserção de Pipet puxado
- Insira o Pipet puxado na bainha da micropipeta, apontando o gancho para baixo em direção ao prato. A ponta do gancho será o ponto mais baixo quando abaixado ao gel.
- Inserir a bainha no micromanipulador e ajustar até que a ponta do Pipet é centrada sobre a lente objetiva em ambas as direções X e Y.
- Abaixe o Pipet usando o manipulador grosseiro até que apenas toque a superfície do líquido.
- Usando o contraste da fase ou o brightfield, focalize o microscópio na camada do grânulo na parte superior do gel. Este será o plano de referência.
- Garantindo que o objetivo não está em perigo de bater a amostra ou estágio, trazer o foco acima do gel para encontrar a ponta da micropipeta, usando pequenos ajustes do manipulador grosseiro nas direções X e Y para lançar sombras no plano focal. Apenas abaixe a micropipeta quando a certeza de que a ponta do Pipet está no campo de visão.
- Assegure-se de que a ponta Blunted da micropipeta esteja apontando para baixo girando o Pipet na bainha ou girando a bainha no micromanipulador até que a ponta seja perpendicular ao plano focal. Repita as etapas 4,4 e 4,5 conforme necessário. Concentre-se na ponta do Pipet.
- Concentre-se de volta para a camada de talão superior do gel para medir o quão longe o Pipet é a partir da superfície do gel. Concentre-se de volta para um plano que é parte do caminho entre o gel ea ponta do Pipet. Abaixe lentamente o Pipet para alcançar o plano focal intermediário.
- Repita a etapa 4,6 até que as sombras muito fracas da ponta da micropipeta possam ser apreciadas ao focalizar no Hydrogel. Aumente para a próxima ampliação mais alta.
- Abaixe o micromanipulador até que as sombras e as refrações da ponta muito da micropipeta possam ser apreciadas dentro do plano focal da camada do grânulo.
- Aumente a ampliação para o que será usado no experimento. Abaixe o Pipet até que paira apenas acima da superfície do Hydrogel.
5. calibrando o micromanipulador e a geração da força
- Na fase ou no brightfield, abaixe a micropipeta pairando para tocar na superfície do Hydrogel. Observe como o Pipet olha em cima do contato com o Hydrogel. Continue a abaixar a micropipeta em Z até que os ajustes em X e em Y causem o puxar e a deflexão do hidrogel naquelas direções. Use as microesferas ou células próximas como marcas fiduciárias.
Nota: se o micromanipulador é anexado ao braço do condensador da fase ou ao banco e não à fase da amostra própria, desengate sempre o gel antes de mover o estágio para evitar quebrar o Pipet ou as pilhas de perturbação. Se o Pipet quebrar, volte para a etapa 3 e a etapa 4. - Encontre uma área desprovido de células para envolver o gel. Puxe-o em todas as direções e se confortável com a forma como a micromanipulação traduz a deformação do gel.
- Tome imagens fluorescentes do campo do grânulo sem a manipulação, com o Pipet que envolve o gel, e com o Pipet acoplado que puxa o gel. Repita isso várias vezes tomando boas notas sobre as marcas de escala no micromanipulador, a forma como a ponta Pipet olha em fase ou brightfield em cada fase de puxar, ea distância da ponta se move usando essa manipulação.
- Use ImageJ como descrito anteriormente16,17 para calcular deslocamentos relativos do grânulo e força aplicada aos grânulos comparando o campo nulo do grânulo ao campo do grânulo sem acoplamento do Pipet, o campo do grânulo com o gel acoplado, e o gel puxado.
- Para afinar o estímulo tensional, compare a aplicação da força usando dimensões diferentes da ponta da micropipeta, as distâncias da pilha, ou a distância puxada pelo micromanipulador do ponto inicial do touchdown. O efeito da dimensão da ponta da micropipeta na aplicação da força dá a grande flexibilidade ao usuário mas igualmente demonstra a necessidade de gerar mapas da força para micropipettes novas, mesmo quando as dimensões e a forma assemelham-se pròxima a pontas previamente calibradas.
6. conduzindo o ensaio de durotaxis
- Antes de realizar o experimento, pratique envolver o gel perto de uma célula e observar a deformação da célula quando o micromanipulador é reposicionado.
- Monitore um grupo de células que têm polaridade clara e parecem estar se movendo por 30 min para identificar as células que estão se movendo de forma direcionada.
- Escolha uma célula que está se movendo em uma única direção clara e monitorá-lo na taxa de quadros desejada para um adicional de 30 min.
- Se a determinação das forças exercidas na pilha ou na tensão exercida pela pilha é desejada, Capture imagens do campo do grânulo em cada aquisição. Se a célula mudar seu curso de direção durante o monitoramento, escolha uma célula diferente para monitorar, pois isso tornará difícil determinar o efeito da estimulação.
- Envolva o hidrogel aproximadamente 50 μm longe da pilha. Posicione o Pipet na frente do lado próximo da borda principal e mova o micromanipulador de tal forma que o gel é deformado ortogonalmente para a direção da célula de viagem. Observe a célula ao longo do tempo, uma vez que responde ao gradiente agudo local de rigidez.
Nota: o sincronismo fornecido aqui é eficaz ao monitorar fibroblastos SKOV3 ou Ref52, entretanto, o intervalo e o curso de tempo total devem ser ajustados para serir o tipo da pilha e o evento biológico que estão sendo observados. Se emparelhar com microscopia de fluorescência, pausar a aquisição fluorescente imediatamente antes do passo 6,5., use o contraste de fase ou o brightfield para posicionar a micropipeta e puxe, e reinicie a aquisição fluorescente imediatamente depois. - Se o Pipet desliza ou se o gradiente é de outra forma relaxado ou liberado, encontrar uma nova célula, repetindo as etapas 6,2 e 6,3.
7. determinação da resposta da migração durotáctica
- Usando ImageJ19 ou outro programa de análise de imagem, calcule o ângulo de volta desenhando uma linha entre o meio da borda principal da célula em 0 min e 30 min post monitor (refletindo a trajetória original da célula) e outra linha entre o meio do a borda de liderança pouco antes e 80 min após a estimulação e medindo o ângulo entre estas duas linhas.
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Representative Results
Ao preparar micropipetas (Figura 1) e normalizando a geração de força das trações (Figura 2 e Figura 3), conforme descrito acima, foram identificadas condições durotáticas ideais para múltiplas linhagens celulares. Usando essa técnica, conforme descrito na Figura 4, ambas as células de câncer de ovário de SKOV-317 e Ref52 de ratos embrionários (Figura 5) se movem em direção ao aumento da rigidez em gradientes aplicados por uma micropipeta de vidro. Além de durotaxis, este método pode ser usado para estudar eventos de sinalização dinâmica usando biosensores fluorescentes e marcadores. Por exemplo, a estrutura e a sinalização dentro das estruturas de adesão focal podem ser observadas na estimulação durotáctica. O sensor de tensão do vinculin (vints) é um biosensor fret-baseado que localiza às adesões focais, permitindo a observação fluorescente da dinâmica focal da adesão e a medida das mudanças na tensão dentro daquelas estruturas19. Ref52 células que expressam transientemente VinTS em 125 géis de poliacrilamida kPa mostram a formação de aderências focais na direção do estiramento ao longo do período de tempo de 40 min (Figura 6a). A análise do FRET20 revela que a vinculação localizada a aderências focais experimenta uma mudança imediata na tensão quando apresentada com estimulação durotáctica aguda (Figura 6B), expandindo a utilidade deste ensaio para a observação de eventos de sinalização em resposta à estimulação durotáctica.
Figura 1. Diagramas de micropipetas puxadas (A) e forjadas (B) típicas. (A) as micropipetas são puxadas utilizando um protocolo de duas etapas para atingir uma conicidade de 1 mm a 10 μm acima de 2 mm. (B) as micropipetas são então carregadas na microforja e suas pontas são dobradas, fechadas e encurtadas para que o último 250 μm do a micropipeta é dobrada a um ângulo de ~ 35 ° e atarraxamentos de ~ 30 μm a uma ponta arredondada que mede ~ 15 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Campo de talão melhorado após o revestimento de etanol em comparação com o método tradicional usando poli-L-lisina. Campos representativos do grânulo do hidrogel dos métodos do revestimento do lamela da evaporação da poli-L-lisina e do etanol (EtOH) usando grânulos fluorescentes amarelo-verdes, vermelhos, e Dark-Red. Barra de escala: 25 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Geração de mapa de força para um exemplo de estiramento durotáctico. (A) posição de microesferas fluorescentes antes e depois (pseudo-colorido verde e vermelho, respectivamente) deformando o hidrogel com uma micropipeta (localizada além da borda direita do painel). Barra de escala: 25 μm. Vetores de deslocamento (B) e mapa de calor de deslocamento (C) entre campos de talão nulos e puxados gerados por plugins de microscopia de força de tração no ImageJ destacam o gradiente de deformação do cordão e de hidrogel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Esquema do ensaio de durotaxis e determinação do ângulo de deflexão. (A) uma célula é observada por pelo menos 30 min para determinar sua trajetória original. (B) a micropipeta é posicionada ortogonalmente para a trajetória da célula, 50 μm a partir da borda da célula. O hidrogel é acoplado pela micropipeta tal que mover a micropipeta exercerá a força na superfície do hidrogel. (C) a micropipeta é puxada um adicional de 20 μm de distância da célula, ortogonal à trajetória da célula que cria um gradiente agudo, local de tensão (denotado em azul), que aumenta em direção a micropipeta. (D) a célula é observada ao longo do tempo, uma vez que navega o gradiente aplicado. (E) no ImageJ ou um programa de análise de imagem, a trajetória original (linha tracejada) é marcada por uma linha desenhada a partir do meio da célula através do centro da aresta de liderança no primeiro quadro. A trajetória final (linha sólida) é marcada por uma linha desenhada após a célula ter permissão para navegar pelo gradiente de tensão aplicado. O ângulo entre estas duas linhas em direção ao estímulo é denominado "ângulo de volta", marcado aqui por θ. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Os fibroblastos embrionários do rato movem-se para regiões da rigidez aumentada do substrato em durotaxis. Curso do tempo que mostra o movimento durotactic de uma pilha Ref52 10 minutos antes da tração (painel 1), 1 minuto antes da tração (painel 2), na altura da tração (painel 3), e 1 h após a tração (painel 4). A seta indica a direção do estiramento. Barra de escala: 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Localização e atividade proteica durante a estimulação durotáctica usando marcadores fluorescentes ou biossensores. Células Ref52 que expressam transientemente o sensor de tensão de vinculação (VinTS)19 a migração em géis de poliacrilamida 125 kPa é apresentada com estimulação durotáctica aguda. (A) após a estimulação, novas adesões focais formam-se na direção do estiramento à medida que as células se reorientam ao longo do gradiente de rigidez. Para 2 10 períodos de min, iniciando-se 20 min antes da estimulação mecânica e 21 min após estimulação, morfologia celular (Top) e formação de adesão focal (fundo) foram monitorados. A cor vermelha indica o primeiro ponto temporal dentro do período de tempo e a cor verde indica o ponto temporal 10 minutos mais tarde. As aderências focais novas formadas dentro do período de 10 minutos são mostradas no verde. Antes da estimulação, novas adesões focais formam-se na direção da viagem. Após a estimulação, novas adesões focais formam-se na direção do estiramento. Seta indica a direção do estiramento. As pontas de seta indicam áreas com aderências focais formadas durante esse período de 10 min. Barra de escala: 25 μm. (B) a análise do traste da fluorescência de vints indica uma mudança na tensão dentro das aderências focais proximal ao estiramento durotactic. Esboço da membrana de pilha antes e depois da deformação do realce do estiramento da pilha em cima da estimulação. As pontas de seta indicam exemplos de aderências focais que experimentam mudanças na relação do FRET em cima do estiramento. Barra de escala: 10 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Rigidez hidrogel desejada | 3 kPa | 25 kPa | 125 kPa |
| 7,5% acrilamida | 100 μL | 100 μL | 160 μL |
| 0,5% bis-acrilamida | 10 μL de | 100 μL | 100 μL |
| ddH2O | 287 μL | 197 μL | 137 μL |
Tabela 1. Soluções de gel de acrilamida.
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Discussion
Demonstrado aqui é um ensaio de durotaxis repetível, de célula única que permite a avaliação da capacidade de uma célula de alterar seu comportamento de migração em resposta a pistas mecânicas agudas. Esta técnica pode igualmente ser usada em combinação com a microscopia de fluorescência e as proteínas ou os biossensors apropriados da fusão para examinar a sinalização subcellular e os eventos cytoesqueléticos dentro dos segundos da estimulação mecânica ou sobre um temporal mais longo durante movimento durotáctico. Compreender a relação de uma célula com o seu ambiente envolve o estudo do impacto dos aspectos químicos e mecânicos desse ambiente. Embora potencialmente difícil de dominar, este ensaio durotaxis pode ser amplamente utilizado para compreender a resposta celular a mudanças em seu microambiente mecânico.
Significância em relação aos métodos existentes
Como mencionado anteriormente, este método de estimulação durotáctica com base em micropipeta é altamente manipulável, permitindo um alto grau de controle espaciotemporal sobre estímulos mecânicos, uma grande vantagem sobre outras técnicas, como a pré-formada linear ou passo-gradientes de rigidez. A magnitude e o sentido dos gradientes de deformação transmitidos podem ser visualizados acompanhando o deslocamento de grânulos fluorescentes incorporados no hidrogel, perto da superfície da cultura celular.
Restringir esses marcadores de uma única camada logo abaixo da superfície da cultura aumenta a precisão desse rastreamento. Microesferas localizadas abaixo do plano de deflexão (transmitida pela micropipeta ou, para microscopia de força de tração, por contratilidade celular), como ocorreria com a mistura das microesferas uniformemente ao longo do hidrogel, se moverá menos do que no plano microesferas, o que pode levar à subestimação das forças aplicadas. Além disso, esta modificação é mais fácil de executar e mais confiável do que os métodos em que os grânulos são sobrepostas em uma camada extremamente fina de poliacrilamida elenco em cima de um gel pré-formado21 ou trazido para a superfície hidrogel por gravidade-assistida assentamento22 e produz uma dispersão mais mesmo de grânulos através do hidrogel do que métodos previamente descritos17,18.
Modificação e aplicações futuras
As especificidades deste ensaio pode ser modificada para melhor atender a linha celular de interesse. Por exemplo, uma variedade de moléculas de matriz extracelular (por exemplo, colágeno I, colágeno IV, laminina) ou outros ligantes adesivos pode ser usada para funcionalizar o hidrogel. Também, a rigidez inicial do hidrogel pode facilmente ser levantada ou abaixada ajustando a relação do acrilamida ao bis-acrilamida (veja tabela 1). Alterando as dimensões da ponta da micropipeta e a magnitude da tração, este ensaio pode ser otimizado para transmitir um estímulo durotáctico eficaz e repetível para o tipo de célula em questão.
Etapas críticas e solução de problemas
Somente as células que seguem uma trajetória constante e linear da migração antes da manipulação do hidrogel devem ser estimuladas para garantir que as mudanças na trajetória sejam devidas ao estímulo mecânico e não à flutuação aleatória. Deve-se ter cuidado para fabricar uma micropipeta de vidro que engaja a superfície do hidrogel sem escorregar, mas não rasgar o gel quando puxado. É importante aplicar um estiramento constante, constantes ao hidrogel durante o curso da experimentação para obter os resultados limpos que significa que o usuário deve ser praticado em coloc e em mover a micropipeta antes de encontrar uma pilha. Qualquer movimento não intencional da micropipeta que leva a mudanças no gradiente de tensão pode afetar a capacidade da célula de durotax. Similarmente, a manipulação do gel deve ser praticada com cada micropipeta nova que é forjada como mudanças ligeiras na forma do Pipet pode fazer com que a interação do Pipet/gel varie.
A falha em posicionar a micropipeta dentro do campo de visão microscópico antes de aumentar a ampliação pode levar à ruptura acidental da ponta de vidro frágil. Assegure-se de que a altura e a posição X-Y da ponta sejam conhecidas antes de abaixar a micropipeta com o micromanipulador. Monitore sempre a posição da micropipeta para reduzir o risco de ruptura. Recomenda-se que a ampliação é diminuída para trás para baixo a 10X para cada micropipeta nova carregada no micromanipulador enquanto os movimentos ligeiros do micromanipulador e da bainha do Pipet podem conduzir às grandes mudanças aparentes na posição do recém-carregado micropipeta.
Antes de encontrar as células para observar, é importante para primeiro testar a micropipeta para confirmar que ele vai envolver o hidrogel como esperado e que é adequado para a aplicação do trecho desejado. Encontrar as dimensões da ponta que se adequam ao experimento e ao tipo de célula é fundamental para o sucesso na aplicação da estimulação durotáctica. O fim da micropipeta deve ser arredondado o suficiente para que ele não quebre através do gel, mas não tão arredondado que não consegue segurá-lo. Se o Pipet não puxar o gel eficazmente, pode deslizar ao longo da superfície. A forma da ponta da micropipeta pode ser demasiado arredondada para se envolver adequadamente com a superfície do gel. As dimensões na ponta muito da micropipeta devem ser ajustadas até que firme, o contato constante possa ser conseguido consistentemente. Em alguns casos onde a micropipeta está deslizando através da superfície do gel, pode ser necessário abaixar a micropipeta mais mais no hidrogel para ganhar mais tração. Se a micropipeta rasga através do gel, a ponta pode ser demasiado fina ou demasiado afiada. O rasgo do gel pode igualmente indicar demasiada força está sendo aplicada ao puxar. A micropipeta deve ser levantada ligeiramente para reduzir a deformação do gel e puxar distâncias mais curtas.
Muitas vezes, se a célula ou a borda da célula é puxado para fora do foco pela micropipeta, a ponta da micropipeta é acoplada muito perto da célula ou o estiramento é muito vigoroso. Mova a micropipeta mais longe da célula, apenas ligeiramente deformando a célula nos planos X-Y. Mover a célula fora de foco não só tornará os eventos celulares impossíveis de monitorar e causar aberrações ópticas, mas fará com que a célula Experimente mais estimulação do que o gradiente de tensão 2-dimensional pretendido.
O mais importante, é crítico gravar e analisar somente as respostas que têm a manipulação durotactic consistente com erro humano mínimo. Se a redução da ponta for imprecisa ou se a micropipeta for reposicionada, os resultados do experimento serão obscutados. Uma vez que este ensaio é complexo e muitas etapas são propensas a erro, o cuidado deve ser tomado a cada passo para evitar alterações não intencionais na estimulação das células. Falha em qualquer etapa pode levar a aplicação de estiramento inconsistentes e resultados não confiáveis.
Limitações
Há limitações a esta técnica que deve ser considerada. A mais proeminente, o forjamento exato e a manipulação das Micropipetas de vidro podem apresentar uma curva de aprendizagem íngreme para usuários novos. Adicionalmente, a posição e a magnitude da tração do hidrogel devem ser aperfeiçoadas para linhas de pilha diferentes. Examinar deslocamentos fluorescentes do grânulo antes e depois que a manipulação do hidrogel pode ajudar com este aspecto da técnica. Também, quando a técnica permitir a observação armazenamento elevada do comportamento durotactic em pilhas individuais, esta faz-lhe um ensaio da baixo-taxa de transferência. Portanto, é importante salientar que este ensaio também pode ser complementado por outras técnicas com menor manipulabilidade, mas maior produtividade, como o uso de hidrogéis com gradientes pré-formados de rigidez, para analisar o comportamento durotático de maior populações de células de uma só vez. Em resumo, o alto grau de controle espaciotemporal de pistas mecânicas oferecidas pelo ensaio durotáctico de uma única célula torna muito útil para analisar os mecanismos moleculares que contribuem para o comportamento durotático de muitos tipos de células diferentes muitos Condições.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
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