Denne protokol beskriver opførelsen af en hybrid Micro drive array, der tillader implantation af ni uafhængigt justerbare tetrodes og en justerbar opto-silicium sonde i to hjerneområder i frit bevægende mus. Også påvist er en metode til sikkert at inddrive og genbruge opto-silicium sonde til flere formål.
Multi regionale neurale optagelser kan give vigtige oplysninger for at forstå samspillet mellem flere hjerneområder. Konventionelle mikrodrev design tillader dog ofte kun brug af én type elektrode til at optage fra enkelte eller flere regioner, hvilket begrænser udbyttet af optagelser af enkelt enhed eller dybde profil. Det begrænser også ofte evnen til at kombinere elektrode optagelser med optogenetiske værktøjer til at målrette pathway og/eller celletype specifik aktivitet. Præsenteret her er en hybrid Micro drive array for frit bevægende mus til at optimere udbyttet og en beskrivelse af dens fabrikation og genbrug af Micro drive array. Det nuværende design beskæftiger ni tetrodes og en opto-silicium sonde implanteret i to forskellige hjerneområder samtidigt i frit bevægende mus. Den tetrodes og opto-silicium sonde er uafhængigt justerbar langs dorsoventral akse i hjernen for at maksimere udbyttet af enheden og oscillatoriske aktiviteter. Denne Micro drive array indeholder også en opsætning for lys, medierende optogenetisk manipulation til at undersøge de regionale-eller celletype-specifikke svar og funktioner af langtrækkende neurale kredsløb. Desuden kan opto-silicium-sonden sikkert genvindes og genbruges efter hvert eksperiment. Da Micro drive-matrixen består af 3D-udskrevne dele, kan designet af mikrodrev nemt ændres, så de passer til forskellige indstillinger. Først beskrevet er designet af Micro drive array og hvordan man Fastgør den optiske fiber til en silicium sonde til optogenetik eksperimenter, efterfulgt af fabrikation af tetrode bundt og implantation af array i en mus hjerne. Optagelsen af lokale felt potentialer og Enhed spiking kombineret med optogenetisk stimulation også demonstrere gennemførlighed af Micro drive array system i frit bevægelige mus.
Det er afgørende at forstå, hvordan neuronal aktivitet understøtter kognitiv proces, såsom læring og hukommelse, ved at undersøge, hvordan forskellige hjerneregioner dynamisk interagerer med hinanden. At belyse dynamikken i neurale aktivitet underliggende kognitive opgaver, storstilet ekstracellulær Elektrofysiologi er blevet gennemført i frit bevægende dyr ved hjælp af Micro drive arrays1,2,3, 4. I de sidste to årtier, flere typer af Micro drive array er blevet udviklet til at implantat elektroderne i flere hjerneregioner for rotter5,6,7,8 og mus9, 10 , 11 , 12. ikke desto mindre tillader nuværende mikrodrev design generelt ikke brug af flere sonde typer, hvilket tvinger forskerne til at vælge en enkelt elektrodetype med specifikke fordele og begrænsninger. For eksempel, tetrode arrays fungerer godt for tætbefolkede hjerneområder såsom dorsale hippocampus1,13, mens silicium sonder giver en bedre geometrisk profil til at studere anatomiske forbindelser14 , 15.
Tetrodes og silicium sonder bruges ofte til in vivo kronisk optagelse, og hver har sine egne fordele og ulemper. Tetrodes har vist sig at have betydelige fordele i en bedre enkelt enhed isolation end enkelt elektroder16,17, foruden omkostningseffektivitet og mekanisk stivhed. De giver også højere udbytter af enkelt enhed aktiviteter, når de kombineres med Micro drives8,18,19,20. Det er vigtigt at øge antallet af samtidigt indspillede neuroner for at forstå funktionen af neurale kredsløb21. For eksempel er der behov for et stort antal celler for at undersøge små populationer af funktionelt heterogene celletyper såsom tidsrelaterede22 eller belønning, der koder23 celler. Meget højere cellenumre er nødvendige for at forbedre afkodnings kvaliteten af Spike sekvenser13,24,25.
Tetrodes har imidlertid en ulempe i at registrere rumligt fordelte celler, såsom i cortex eller thalamus. I modsætning til tetrodes kan silicium sonder give rumlig fordeling og interaktion af lokale felt potentialer (lfps) og spiking aktiviteter i en lokal struktur14,26. Multi-Shank silicium sonder yderligere øge antallet af optagelsessteder og tillade optagelse på tværs af enkelt eller tilstødende strukturer27. Men sådanne arrays er mindre fleksible i placeringen af elektrode steder i forhold til tetrodes. Desuden er komplekse Spike sortering algoritmer kræves i high-density sonder at udtrække oplysninger om handlings potentialer af tilstødende kanaler til at spejle de data, der er erhvervet af tetrodes28,29,30. Derfor er det samlede udbytte af enkelt enheder ofte mindre end tetrodes. Desuden er silicium sonder ufordelagtige på grund af deres skrøbelighed og høje omkostninger. Valget af tetrodes vs. Silicon sonder afhænger således af formålet med optagelsen, hvilket er et spørgsmål om, hvorvidt det er prioriteret at opnå et højt udbytte af enkelt enheder eller rumprofilering på optagelses stederne.
Ud over at optage neurale aktivitet, optogenetisk manipulation er blevet en af de mere kraftfulde værktøjer i neurovidenskab til at undersøge, hvordan specifikke celletyper og/eller veje bidrager til neurale kredsløb funktioner13,31, 32af33. Optogenetiske eksperimenter kræver dog yderligere overvejelse i Micro drive array design for at fastgøre fiber stikket til stimulerings lyskilder34,35,36. Ofte kræver tilslutning af fiberoptik en relativ stor kraft, hvilket kan føre til en mekanisk forskydning af sonden i hjernen. Derfor er det ikke en triviel opgave at kombinere en implantabelt udstyr optisk fiber til konventionelle Micro drive arrays.
Af ovennævnte grunde, forskere er forpligtet til at optimere udvælgelsen af typen af elektrode eller at implantatet en optisk fiber afhængigt af formålet med optagelsen. For eksempel anvendes tetrodes til at opnå højere enheds udbytte i hippocampus1,13, mens silicium sonder anvendes til at undersøge laminar dybde profilen af kortikale områder, såsom mediale entorhinal cortex (MEC)37. I øjeblikket er der indberettet mikrodrev til samtidig implantation af Tetroder og silicium sonder for rotter5,11. Det er dog yderst udfordrende at implantere flere Tetroder og silicium sonder i mus på grund af vægten af mikrodrev, begrænset plads på muse hovedet, og rumlige krav til at designe mikrodrevet til at ansætte forskellige sonder. Selv om det er muligt at implantatet silicium sonder uden et mikrodrev, denne procedure tillader ikke justering af sonden og sænker succesraten for silicium-Probe Recovery12,38. Desuden, optogenetiske eksperimenter kræver yderligere overvejelser i Micro drive array design. Denne protokol demonstrerer, hvordan man konstruerer og implantat et Micro drive array til kronisk optagelse i frit bevægende mus, som tillader implantation af ni selvstændigt justerbare tetrodes og en justerbar opto-silicium sonde. Denne Micro drive array letter også optogenetiske eksperimenter og nyttiggørelse af silicium sonde.
Protokollen demonstrerer, hvordan man konstruerer og implanterer et hybrid Micro drive-array, der tillader optagelse af neurale aktiviteter fra to hjerneområder ved hjælp af uafhængige justerbare Tetroder og en silicium-sonde i frit at opføre mus. Det viser også optogenetiske eksperimenter og genopretning af silicium sonde efter eksperimenter. Mens justerbar silikone sonde33 eller opto-silicon Probe36 implantation tidligere er påvist i mus, har denne protokol klare fo…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af Japan Society for fremme af videnskab oversøiske forskningsstipendier (HO), begavet forsker program (TK), Human Frontier Science program (TK), Brain Research Foundation (TK), Fakultets videnskab og teknologi erhvervelse og Retention program (TK), hjernen & Behavior Research Foundation (TK), og af Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Investigator Research Grant (JY). Vi takker W. Marks for værdifulde kommentarer og forslag under forberedelsen af manuskriptet.
#00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
#0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
#0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
3D printer | FormLab | Form2 | |
5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
tetrode wires | Sandvik | PX000004 |