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Biochemistry

使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029

Summary

定量多路复用免疫沉淀 (QMI) 使用流式细胞测定技术,灵敏地检测两个样本之间靶向蛋白-蛋白质相互作用的丰度差异。QMI可以使用少量的生物材料进行,不需要基因工程标签,并可以适应任何先前定义的蛋白质相互作用网络。

Abstract

动态蛋白-蛋白质相互作用控制细胞行为,从运动到DNA复制到信号转导。然而,监测蛋白质相互作用网络中多种蛋白质之间的动态相互作用在技术上是困难的。在这里,我们提出了定量多路复用免疫沉淀 (QMI) 的协议,它允许根据暴露检测到的共享复合物中蛋白质的相对荧光测量,定量评估蛋白质相互作用的褶皱变化表面表位(PiSCES)。在QMI中,来自细胞解物的蛋白质复合物被免疫沉淀到微球上,然后用标记的抗体探测不同的蛋白质,以量化PiSCES的丰度。免疫沉淀抗体与不同的 MagBead 光谱区域结合,使流式细胞仪能够区分多个平行免疫沉淀,同时量化与每个光谱抗体相关的量。与其他免疫沉淀方法相比,QMI不需要遗传标记,可以使用最少的生物材料进行。QMI可以适应任何定义的相互作用蛋白组,到目前为止已经用于描述T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。研究结果产生了新的假说,具有潜在的诊断和治疗应用。该协议包括执行 QMI 的指令,从初始抗体面板选择到运行检测和分析数据。QMI测定的初始组装涉及筛选抗体以生成面板,并实证确定适当的莱沙缓冲液。随后的试剂制备包括共价耦合免疫沉淀抗体与MagBeads,以及生物仿菌探针抗体,以便它们可以被链球菌-结合荧光剂标记。为了运行测定,裂解物与MagBeads在一夜之间混合,然后用不同的探针抗体分珠和孵育,然后贴上荧光度标签,然后通过流式细胞仪读取。执行两个统计测试,以识别在实验条件之间差异很大的 PiSCES,并使用热图或节点边缘图对结果进行可视化。

Introduction

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动态蛋白质-蛋白质相互作用构成分子信号级联和移动结构,是大多数细胞生理学的功能基础。这些过程通常被描述为线性信号通路,在基于单个输入的稳定状态之间切换,但实验和建模数据清楚地显示它们作为集成网络2、3 4.就G蛋白而言,不同的受体通常具有激活同一G蛋白的能力,而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5,6。为了使相对较少的G蛋白类专门调节大量的细胞功能,如突触传输,激素调节和细胞迁移,细胞必须集成和区分这些信号4,5.有证据表明,对于G蛋白和其他蛋白质来说,这种信号特异性主要是基于精细调整的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动力学1,3。4,5,6,7.由于信令网络由具有多个输入、输出和反馈回路的动态蛋白质复合物组成,因此单个扰动有机会改变细胞生理的整体静时平衡4 7.现在人们普遍认为,信号应从网络的角度来研究,以便更好地了解多个输入的集成如何控制健康和疾病7、8、离散细胞功能。 9,10,111213.鉴于此,开发了定量多路免疫沉淀 (QMI), 以收集有关动态蛋白质相互作用网络中折叠变化的中等通量定量数据。

QMI 是一种基于抗体的测定,其中细胞解结物与一组免疫沉淀抗体进行孵育,这些抗体与含有不同比例荧光染料的磁珠共价耦合。将特定的抗体耦合到不同的磁珠类别,可以同时从同一致莱沙中同时对多个靶蛋白进行共免疫沉淀。在免疫沉淀 (IP) 之后,用第二种荧光荧光结合探针抗体(或与荧光磷结合链球菌联合剂联合的亲化抗体)孵育磁珠。每个 IP 抗体-探针抗体对或 PiSCES(暴露表面表位检测到的共享复合物中的蛋白质)之间的共结,然后通过流式细胞测定检测,并可在不同之间定量比较样本条件14.图1中的插图显示了运行QMI测定的步骤,包括由荧光结合探针抗体标记的带有免疫沉淀蛋白复合物的磁珠图(图1C)。

QMI 的灵敏度取决于赖酸与用于免疫沉淀的磁珠数量的蛋白质浓度,与其他基质相比,要检测 10% 折叠变化的分辨率只需要少量的起始材料共同知识产权方法14,15 。例如,QMI 中使用的起始材料量与三明治酶链接免疫吸附测定 (ELISA) 所需的原料量类似,但在单个 QMI 检测中检测到多个相互作用。使用 20 个 IP 和 20 个探针靶点进行的 QMI 测定使用从 4 mm 皮肤活检中分离的 1-5 x 105初级 T 细胞、从小鼠前额皮质的 3 mm 日冕部分或 3 x 106培养小鼠原发性小鼠原发性中分离的 P2 突触体制剂皮质神经元14,16,17。这种敏感性使 QMI 可用于分析可用性有限的细胞或组织,如临床样本。

QMI 可以适用于任何先前定义的蛋白质相互作用网络(前提是有抗体可用),并且到目前为止已经开发用于分析 T 细胞抗原受体 (TCR) 信号体和神经元谷氨酸突触中的蛋白质子集17,18.在T细胞受体信号的研究中,QMI首先用于识别PiSCES中的刺激引起的变化,然后区分自体免疫患者与对照组,检测内源性自身免疫信号,最后产生假说涉及一个不平衡的疾病相关的相互作用的子网络14。最近,同一个QMI面板被用来确定胸腺细胞的选择是由定量而不是质量差异在TCR相关蛋白质信号19。在神经元中,QMI用于描述不同类型的输入信号的蛋白质相互作用网络的输入特定重新排列,以支持新出现的突触可塑性模型17。此外,这个突触QMI面板用于识别七个自闭症小鼠模型的差异,根据PiSCES生物特征将模型聚集到子组中,并准确假设以前未识别的共享分子缺陷在一个模型16。类似的方法可用于筛选可能对不同药物治疗作出反应的其他子组,或将药物分配给特定反应的子组。除了基础科学之外,QMI在诊断、患者分型和药物开发方面也有潜在的应用。

为了组装QMI抗体面板,下面第1节描述了初始抗体筛选和选择方案。一旦确定抗体面板,第 2 节将所选抗体与磁性磁珠的偶联方案与 IP 磁珠结合,以及所选探针抗体的生物仿当。第 3 节描述了在细胞或组织莱沙上运行 QMI 测定的协议。最后,由于单个实验可以生成 +5 x 105个单个数据点,因此第 4 节提供了有助于数据处理、分析和可视化的说明和计算机代码。第 2-4 节中描述的工作流概述如图1所示。

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Protocol

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1. 测试设计

  1. 候选抗体制备
    1. 对于每个感兴趣的蛋白质,选择3到5个抗体进行筛选。如果可能,使用识别不同表位的单克隆抗体。还包括一种非特异性控制抗体。
    2. 要去除Tris,请通过将抗体添加到30 kDa自旋过滤器中,向下旋转至最小体积,加入500μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS),并重复3次,从而进行缓冲液交换。要去除载体蛋白,请根据制造商的协议执行抗体纯化(有关特定纯化建议,请参阅材料表)。
      注:这是因为携带蛋白和带游向胺群的缓冲液(如Tris)会与COOH组发生反应,并淬火随后的珠子耦合和生物异化反应。确保所有抗体均被纯化(无载体蛋白),并在无原胺的缓冲液中(即无Tris)。
    3. 像戴维斯和施鲁姆20所描述的,将每个抗体与Carboxylate改性乳胶(CML)珠子耦合。为了保存抗体,将珠耦合反应缩减至1/5(即3.6 x 106个珠子,10μL为0.2-1 mg/mL抗体)。
    4. 使用流量计(通常为 ±108/mL)估计珠数,并储存在 4°C。珠子已经储存了一年多,并在QMI检测中成功使用,但保质期或保质期尚未正式确定。B/S缓冲液中的NaN3可防止细菌生长。
    5. 对每种抗体的一部分进行生物浸酯(见下文第2.2节)。储存在4°C。
    6. 通过染色 1 x 105珠子,与产生抗体的物种进行 PE 结合抗体反应,并在流动细胞仪上读取,确认有效的 CML 珠耦合和准确计数。
    7. 使用链球菌-HRP通过点印菌确认抗体生物异化。
    8. 一旦实验室生成了已知有效的试剂,在步骤 1.1.5 和 1.1.6 中使用这些试剂作为确认反应的阳性对照。
  2. IP-FCM 抗体筛查(流式细胞测定检测的免疫沉淀)
    1. 决定适当的筛选莱沙。对于此和所有其他 QMI 预筛选步骤(本节 1: 检测设计中包含的任何内容),请勿使用可用性有限的生物样本。相反,选择一种可比的控制材料,如野生型小鼠组织、细胞系或非限制资源的正常人类供体组织。
      注: 为此测定选择一个莱沙缓冲液并非易事,在第 1.5 节:洗涤剂选择以及讨论部分的倒数第二段中进行了讨论。标准莱沙缓冲液具有150 mM NaCl、50 mM Tris(pH 7.4)、10 mM氟化钠、2mM正交酸钠以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。与QMI兼容的洗涤剂包括1%NP-40、1%Digitonin、0.1-1%Triton X-100和0.5-1%脱氧胆碱14,16,17,18,19,21 。
    2. 计算每个 IP 使用的莱沙的总体积,对要筛选的每个 IP-probe 组合使用 10 μL。如果筛选 X 探针抗体并使用一个 IgG 控制,则每个 IP 将使用 (X+1) = (10 μL) = (移液误差为 1.1);X+1 用于考虑所需的 IgG 探头控制。例如,在 3x3 抗体屏幕中,每个 IP 应使用 44 ul。请记住包括 IgG IP 控制(参见图 2中的示例筛选设置 )。
    3. 计算要使用的 CML 珠号。如果要筛选 X 探针抗体,请使用 [(X+1) = 5 x 104个珠子]。理想情况下,每口井 5,000 个珠子将导致流量细胞仪读取每个井的 >2,000 个磁珠。例如,在 3 x 3 抗体屏幕中,每个 IP 应使用 20,000 颗珠子,大约是步骤 1.1.3 中制备的 CML 珠子的 0.66 μL(首先应使用流量计对珠子进行量化以确保准确性)。
    4. 从步骤 1.2.2 孵育出的解结量,从步骤 1.2.3 筛选每个 CML 珠的体积,在 4°C 过夜,旋转以防止珠子沉淀。通常,在 96 孔 PCR 板的第一列和带 PCR 管带盖的盖中执行孵育。
    5. 在 3,200 x g下旋转 CML 珠子 1 分钟,然后通过单次快速轻拂板在水槽上去除解结。在轻拂之前和之后,每口油井的底部都应该可以看到一个微小的白色颗粒。
    6. 将 CML 磁珠重新悬浮在 FlyP 缓冲液的体积中,以等于每个珠探针对的 20 μL;对于 X 探针抗体,使用 (X+1) = (20 μL) = (移液误差为 1.1),类似于步骤 1.2.2。对于 3 x 3 屏幕,在 88 μL 的 FlyP 缓冲器中重新挂起。FlyP 缓冲液是 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    7. 使用 20 μL/孔将每个 IP 分布在 96 孔 PCR 板的 (X+1) 孔中,其中 X 是筛选的探针抗体数。图 2A显示了筛选设置示例。
    8. 使用每口井 200 μL 的 FlyP 缓冲液额外洗涤 2 次。如步骤 1.2.5 中的步骤旋转板,并在每次洗涤后轻拂板以去除洗涤缓冲液。小球会非常小,但每次洗涤后应可见。
    9. 对于要筛选的每个生物异化抗体,计算总体积为 (Y+1) = 1.1 = 50 μL,其中 Y 是被筛查的 IP 抗体的数量。将抗体稀释到此体积的 FlyP 缓冲液中的工作浓度,通常从 0.5 mg/mL 库存的 1:100 稀释开始。
    10. 将每个稀释的抗体向下分配96孔板的每一列,并确保CML磁珠被重新悬浮。
    11. 在 4°C 孵育 1 小时,以 15 分钟为间隔旋转或移液,以确保 CML 磁珠保持悬浮状态。
    12. 在 200 μL 的 FlyP 缓冲液中清洗 3 倍,用于每个清洗离心机,并如步骤 1.2.5 中那样去除莱沙。
    13. 在 FlyP 缓冲液中重新悬浮所有 CML 珠子,在 50 μL 的 1:200 链球菌-PE 中。
    14. 在黑暗中4°C孵育30分钟。
    15. 在 200 μL 的 FlyP 缓冲液中清洗 3 倍,用于每个清洗离心机,并如步骤 1.2.5 中那样去除莱沙。
    16. 在 200 μL 的 FlyP 缓冲液中重新悬浮,然后在流式细胞仪上运行。
  3. 选择要包含在测定中的抗体
    1. 使用 FSC-H vs SSC-H 对 SSC-H 的尺寸门,并使用 FSC-H vs FSC-A 消除双精度值。
    2. 生成 PE 荧光强度的直方图,并将两个 IgG 对照(IgG 珠测试探针、测试珠-IgG 探针)叠加到测试对上(图 2)。
    3. 寻找在噪声上发出清晰信号的珠探对(图2B)。此外,对珠子和探针使用相同的抗体并不理想。差异表位识别可最大化观察相互作用的机会,因为某些表位可能被某些蛋白质复合物遮挡。如果没有可接受的选项,则重复屏幕与额外的抗体。
  4. 抗体特异性确认
    1. 为确保预期目标的抗体特异性,请使用被击出目标的掉酶体样本;例如,挖空鼠标或 RNAi 单元格线。或者,使用目标阴性细胞系的酸联,其中靶蛋白被人工表达。
    2. 执行步骤 1.2 中所述的 IP-FCM,修改以适合实验。
  5. 洗涤剂选择
    1. 由于洗涤剂在共IP实验中至关重要,因此通过实证测试不同变异,以确保检测具有检测变化的最大可能性。首先,选择一个相对较小的交互板(4-8),已知在给定条件下发生变化和/或对您的研究特别感兴趣。
    2. 使用用于初始屏幕的非荧光、抗体结合的CML磁珠,使用各种交流缓冲洗涤剂条件执行IP-FCM,如1.2所述。洗涤剂滤网可以用洗涤剂作为唯一变量进行,或者每种洗涤剂的细胞条件不同。始终对珠子和探头使用 IgG 控制,因为洗涤剂偶尔会在某些 IP-Probe 组合中产生意外的背景。
    3. 根据屏幕上的 MM,选择可优化感兴趣 PiSCES 信号的洗涤剂。可能需要在22日作出一些妥协。

2. 多路复用试剂制备

  1. 磁珠耦合
    1. 使用磁珠区域图,选择要以最小化交叉检测风险的模式使用的珠子区域。磁珠通常涂抹在右侧,因此请避开对角相邻的磁珠区域。建议从 Luminex 网站上显示的珠图的其他每一列的珠子(https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/)。
    2. 在250μL的PBS中以0.1毫克/mL(如1.1.2)制备无载体抗体。保持冰上,供以后使用。
    3. 涡旋磁珠广泛,然后等分250μL到琥珀微离心管(保护珠子不光漂白)。
    4. 磁性分离磁珠60s,并去除上清液。
    5. 加入 250 μL 的 MES 缓冲液(50 mM MES pH 6.0,1 mM EDTA),涡旋,磁分离 60 s,并去除上清液。在 200 μL 的 MES 缓冲液中重复并重新悬浮磁珠。
    6. 将 40 μL 的 MES 添加到 2 mg 的 Sulfo-NHS 一次性管中,以制作 50 mg/mL 的库存。
    7. 在磁珠中加入25μL的新鲜苏福-NHS。涡。
    8. 在MES缓冲液中加入25μL的50mg/mL新溶解的EDAC[1-乙基-3-(-3-二甲基氨基)盐酸甲二酰胺,也称为EDC]。涡。
    9. 在室内温度为 1000 rpm 时,用管固定附件盖住并摇动涡旋器 20 分钟。
    10. 磁性分离60s,并去除上清液。
    11. 在 500 μL 的 PBS 中重新悬浮,涡旋,磁分离 60 s 并去除上清液。重复。
    12. 从步骤2.1.2重新悬浮在250μL抗体溶液中。涡。
    13. 在室温下孵育2小时,在涡旋器上以1000rpm摇动。
    14. 将 500 μL 的 PBS 添加到磁珠、涡流中,以磁性分离 60 s,并去除上清液。
    15. 添加 750 μL 的阻塞/存储 (B/S) 缓冲液 (PBS pH 7.4 中的 1% BSA,0.01% NaN3)。在室内温度下盖盖和孵育 30 分钟,1000 rpm。
    16. 磁性分离60s,并去除上清液。在 100 μL 的 B/S 缓冲液中重新悬浮。
    17. 储存在4°C。珠子已经储存了一年多,并在QMI检测中成功使用,但保质期或保质期尚未正式确定。B/S缓冲液中的NaN3应防止细菌生长。
    18. 通过染色 ±0.25 μL 的耦合磁珠(具有荧光抗宿主物种二次和流量细胞仪上的读数)验证磁珠耦合,步骤 1.1.5 中。
  2. 生物异化
    1. 确保抗体在PBS中没有载体蛋白。
    2. 计算要生物素素的抗体总μg(100-200μg推荐用于多路复用,25-50μg推荐用于筛选)。
    3. 准备新鲜的10 mM磺酸-NHS-生物素(可以通过添加224 μL的ddH2O到1毫克无重量管)。
    4. 每25μg抗体、涡流或移液器上下添加1μL的10 mM磺酸-NHS-生物素以混合。
    5. 在室内温度孵育1小时。
    6. 在4°C孵育1小时。
    7. 使用 30 kDa 旋转过滤器去除未结合的生物锡并停止反应。添加 500 μL 的 PBS 并旋转列,直到达到最小音量。添加 500 μL 的额外 PBS,并重复 3 个总缓冲液交换。
    8. 通过在分光光度计上测量1-2μL的吸收率来估计浓度,然后将抗体浓度达到0.5mg/mL。
    9. 储存在4°C。

3. 定量多路免疫沉淀

  1. 板布局
    注:使用 96 孔板和 2-4 个样品条件进行检测时,此检测效果最佳。
    1. 始终在同一板上运行适当的控制(即刺激 v. 未刺激的细胞),以检测条件之间的变化。将每个样品水平分布到板上,并将每列用于不同的探针抗体。第一组探测后应立即运行每个探测器的一组技术复制。有关示例,请参阅3。
    2. 仔细记录板材布局,以便准确进行板材装载和分析。
  2. 样品制备和免疫沉淀(第1天)
    1. 使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在适当的洗涤剂中进行酶组织或细胞,并在冰上孵育15分钟。时刻注意保持乳沙冷。
      注:说明生物材料和酸化蛋白浓度的确切数量必须经过经验确定,在导言第三段中列出了以前使用的样品的一些示例。一般来说,在200μL范围内,每个样品的2mg/mL蛋白在过去已经成功20个IP和20个探针靶点,但每个抗体面板和细胞或组织类型的理想输入必须根据经验确定。
    2. 在 4°C 下在 16,000 x g下旋转 15 分钟,以去除膜和碎屑;保持上清液作为莱沙。
    3. 执行 BCA 测定或类似方法以确定蛋白质浓度,然后在样品之间使蛋白质浓度正常化。如果使用单元格,则从每个条件以相等数量的单元格开始,规范化是可选的。
    4. 在测定中,准备一个主磁珠混合物,每井每井含有+250个磁珠。在数据分析后调整珠数,以便将来每井平均读取每类 110 个珠子。
      注:示例计算:(新珠卷) = [(运行平均值) / 110] =(上一个珠卷)。珠子体积应按此方式调整每 8 次运行或根据需要调整。通常,每个磁珠的3-4μL(如上所述)用于2板实验。
    5. 用磁分离将 FlyP 缓冲液中的磁珠混合 2 倍洗涤,然后在 FlyP 缓冲液中重新悬浮。对于再悬浮,每个板使用每个样品 10 μL。FlyP 缓冲液是 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    6. 彻底涡涡磁珠混合物后,将 10 μL 等分放入冰冷的微离心管中(每个样品一管)。在每个管中加入相等数量的莱沙(具有标准化浓度),用于免疫沉淀。
    7. 将流盐磁珠混合物附于一管中,用于每个正在运行的板;例如,对于2板实验,裂化液分成两个管。在4°C的旋转器上放置管子过夜进行免疫沉淀,覆盖以挡光。
  3. 运行测定(第 2 天)
    1. 从板#1的乳液磁珠管开始。使用磁珠机架从磁珠中取出掉酶,并保留莱沙,以便将来分析。在 500 μL 的冰冷 FlyP 缓冲液中清洗珠子 2 倍。将管管始终保持在冰上或4°C处。
    2. 计算重新悬浮体积为(探头数) = (2 技术复制) = (每井 25 μL) = (移液误差为 1.1)。在冰冷的 FlyP 缓冲器的计算量中重新挂起 IP。
    3. 通过温和移液彻底重新悬浮磁珠后,在平底的 96 孔板上将每口 25 μL 分在冰上。
    4. 在不同的96孔板中,在FlyP缓冲液中稀释生物素素探针抗体至2倍工作浓度(工作浓度通常为1:100或1:200,经验测定),使其顺序与板布局上的列匹配(见图3).工作浓度下探针抗体的最终体积为每口50μL,因此制备的每2倍抗体的体积应为(25μL)*(生物样本数量)*(2次技术复制)*(移液误差为1.1)。
    5. 使用多通道移液器将每个探针抗体稀释的 25 μL 分配到含磁珠的测定板中。
    6. 在水平板摇杆上摇动以混合并重新悬浮磁珠,然后在 4°C 孵育 1 小时,在黑暗中以 450 rpm 的速度摇动。
    7. 在 4°C 的磁性板清洗器上用 FlyP 缓冲液清洗 3 倍。
    8. 在 50 μL 的 1:200 链球菌-PE 中重新悬浮磁珠。
    9. 摇动以混合并重新悬浮珠子,然后在 4°C 孵育 30 分钟,在黑暗中以 450 rpm 的速度摇动。
    10. 在 4°C 的磁性板清洗器上用 FlyP 缓冲液清洗 3 倍。
    11. 在 FlyP 缓冲液的 125 μL 中重新悬浮。
    12. 在 900 rpm 转速下摇动 1 分钟,彻底重新悬浮珠子。
    13. 运行在冷藏流式仪上(参见图 S1中的图表)。在流量细胞仪软件中使用"高 RP1 目标"设置,每个区域的停止条件为 1,000 个珠子(大大超过任何单个井中应达到的数字,以防止机器过早停止)和 80 μL 的样品体积。
    14. 中途暂停运行,然后重新悬挂珠子以防止沉降。
    15. 以 .xml 格式导出数据文件。
    16. 从步骤 3.3.1 开始,对其余板重复此过程。

4. 数据分析

注: ANC 代码旨在比较 N = 4 实验中的两个条件,每个实验每个条件有 2 个技术复制。例如,细胞被刺激四次独立时间,QMI在四个不同的控制(未刺激)和刺激细胞上运行,技术复制如上所示,数据分析如下所述。

  1. 自适应非参数,可调节 Alpha 截止 (ANC)
    1. 打开 MATLAB 并将活动目录设置为包含 ANC 程序组件和从流细胞仪导出的 .xml 文件的文件夹。
    2. 填写"ANC输入"文件,以反映实验设计的细节。补充文件中包括的示例文件已预先填充以运行示例数据,也提供了。
    3. 运行程序,它将将 .csv 文件写入活动目录。该文件报告在所有 4 个实验复制中,在控制条件和实验条件之间,在误报 (alpha) 级别为 0.05 的 PiSCES,或至少 3/4 次复制。
    4. 注意"ANC 命中",它被定义为 PiSCES,在至少 3 个实验复制中存在显著差异,在文件中表示为 3/4_4⁄4,用于步骤 4.3.1。
  2. 加权关联网络分析23 (CNA)
    1. 由 Matlab 以"_MFI"结尾粘贴数据文件输出的列标题。CSV"进入新 Excel 工作表的第一行。添加实验编号的列"实验"和"治疗",用于实验治疗或任何其他要分析的变量。将此文件另存为"traits.csv"。
    2. 打开 R 工作室,并将工作目录设置为包含"_MFI"的文件夹。CSV"和"TRAITS。CSV"文件。
    3. 运行 R 命令,如注释的命令文件中所示,以及文件附带的说明中的详细信息。WCNA 模块与每个实验特性显著相关,作为图形文件输出,每个交互 IPi_ProbeJ与每个模块的关联作为 .csv 文件输出。
    4. 注意"CNA 命中",它定义为与模块成员身份 (MM) > 0.7 和 p < 0.05 的交互,用于模块中标识与感兴趣的实验变量显著相关的成员身份,用于步骤 4.3.1 中。
  3. 积极的"点击"和可视化
    1. 对于 ANC 输出文件中的"3/4= 4/4 命中"列表中的每个交互(从步骤 4.1.4 开始),通过检查 CNA 输出文件(请参阅步骤 4.2.6)确定该交互是否也是"CNA 命中"。创建一个新列,指示每个 ANC 命中是否也是 CNA 命中。
    2. 通过计算步骤 4.1.3 中 ANC 输出电子表格"_Hits.csv"中给出的值,计算每个 ANC = CNA 的平均日志2倍更改值。将值转换为在平均之前记录2倍更改。对于仅在 3/4 次复制中显著的交互,请删除异常值。
    3. 制作一个电子表格,每个 ANC @ CNA 命中都列为一列中的 IP、第二列中的探测和第三列中的折叠更改值。使用此电子表格通过将文件导入为网络,在 Cytoscape 中创建节点边缘关系图。

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Representative Results

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抗体筛查
图 2B显示蛋白质 Connexin36 的屏幕结果。大多数 IP-probe 组合在 IgG 控制装置上不产生信号。与 IgG 对照组相比,具有单克隆抗体 1E5 和 1E5 或多克隆抗体 6200 的探针的 IP 在珠子分布中产生右移。在这里,选择 IP 1E5 和探针 6200poly 是为了避免使用与 IP 和探针相同的抗体,同时降低非特异性蛋白质被两个独立抗体识别的可能性,并增加使用不同的缩影。与 IgG 控件相比,最好选择至少具有 1-2 个日志更高的 MFI 的 IP_probe 组合,但偶尔,如果未识别任何替代项,则可能会使用产生与控件一致区分的较弱 MFI 的对。图 2C显示了 1E5-6200poly 组合的特异性验证实验。使用Connexin36质粒转染的293个细胞的Lysate在珠子分布中产生±1.5对原的右移,而未转染的细胞与IgG对照重叠。在确认一对的特异性时,来自没有靶蛋白的敲除动物或细胞系的负对照分酸应具有类似于IgG对照的MFI。

珠耦合
当与亮度指数在 3 到 5(如 PE 或 FITC)之间的荧光团结合的二次抗体染色时,典型的磁珠耦合质量控制反应将给出背景上方的 MFI 3-4 原木。图 4显示了一个典型的质量控制反应,比较了新磁珠与要更换的旧磁珠的偶联。

数据分析
在每个实验中,ANC比较了用户定义的控制和实验条件之间每个磁珠类的荧光分布(即所有可能的IP_Probe组合)。它为每个组合分配一个p值,以反映根据科洛莫格罗夫-什米尔诺夫 (K-S) 统计数据从相同种群中采样珠子的概率。然后,程序通过更正多个比较并计算技术可变性(技术复制之间的差异),计算生成 0.05 的误报率所需的 K-S p值。IP_probe 组合 (PiSCES),其 K-S 测试p值在所有四个实验中都低于计算截止值,或者至少识别 3/4 实验(3⁄4 = 4/4)。由于p值截止点因这些不同的严格级别而异,因此偶尔会在 4/4 中标识 PiSCES,但不会在 3/4 和 4/4 中标识 PiSCES,因此会计算单独的列表。有关详细的 ANC 方程,请参阅(Smith 等人,2016 年)。14 Langfelder等人对WCNA分析和结果进行了详细讨论,23

数据演示
ANC 和 CNA23分析用于识别 PiSCES,这两个测试条件(1)在至少 3/4 次运行中显示实验条件之间的显著折叠变化,以及 (2) 属于与实验变量相关的 CNA 模块。通过两种独立统计方法识别的这些高置信度 PiSCES 称为 ANC 和 CNA PiSCES。这些交互可以使用开源软件 Cytoscape(图 5a) 或使用补充材料中包含的 R 代码和分析说明作为节点边缘图可视化(图 5b)).

Figure 1
图 1.定量多路免疫沉淀概述。a) 先前筛选的抗体在不同反应中与不同类别的磁珠共价耦合。(b) 一夜之间,蛋白质复合物使用抗体耦合磁珠的混合物进行免疫沉淀。(c) 共免疫沉淀蛋白由探针抗体和荧光团标记。(d) 磁珠和标记蛋白复合物通过冷冻流式细胞计运行,以量化共享复合物中的蛋白质的相对数量。有关自定义制冷的原理图详细信息,请参阅图 S1。e) 流式细胞仪管理器软件按类别分隔 MagBead 和 (f) 显示每个珠区域的荧光直方图。(g) 数据导出为 .xml 文件,并通过两种独立的统计方法进行分析。只有两个分析标识的 PiSCES 都使用热图和节点边缘图可视化进行报告。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2.使用 IP-FCM 进行 Connexin 36 抗体筛查。a) 使用康奈辛 36 (Cx36) CML 磁珠和探针的 4x4 面板对小鼠大脑解酶执行 IP-FCM。莱沙被免疫沉淀与每个CML珠在板的单独行。沐瓦后,每个珠子分布在其行中,以便每列可添加一个探针抗体。(b) 大多数抗体组合在 IgG 背景(灰色、蓝色)上没有信号(橙色)。带有 6200Poly 探头的 1E5 IP 显示可接受的正极信号。1E5 珠/探针和 6200Poly 珠/探针对均显示可接受的信号,但对于珠子和探针使用相同的抗体并不理想。差异表位识别可最大化观察相互作用的机会,因为某些表位可能被某些蛋白质复合物遮挡。带有 1E5 探头的 6200Poly 珠子发出最强信号,并选择用于多路测定,等待特异性确认。(c) 使用从筛查中挑选的一对Cx36抗体对使用Cx36和非转染对照的293T细胞的解结物进行IP-FCM。Cx36 转染细胞发出明确信号,但非转染细胞与 IgG 珠/探针控制无法区分。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3.板布局示例。4 条件多路复用板设置在 96 孔板中。样本 1-4 以连续行加载(此处以不同颜色表示的每个生物样本),技术复制按以下 4 行的相同顺序加载。每列使用一个探头。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4.一种典型的质量控制反应,将新 MagBead 与更换的旧批次的偶联进行比较。珠子在背景上方提供 MFI 2-4 日志,新批次具有类似于旧批次的 MFI。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5.QMI 识别在培养皮质神经元中 5 分钟 NMDA 刺激后震级变化的突触 PiSCES。QMI实验比较了NMDA刺激的神经元与未刺激的(ACSF控制)神经元。介绍了非国大和CNA分析所确定的PiSCES。(a) 在使用开源软件 Cytoscape 生成的节点边缘图中,节点指示作为 IP 和探针包含在 QMI 面板中的抗体目标(蛋白质)。边缘代表 ANC ° CNA PiSCES,边缘的颜色和厚度指示 NMDA 处理和控制之间的折叠变化的方向和大小。在 NMDA 和控制条件之间未更改的 PiSCES 不包括在图中。(b) 使用热图.2 函数在 R 中生成的热图表示相同的 ANC + CNA PiSCES。ComBAT 规范化的日志2 MFI 值按行规范化,以考虑跨 ^3 个日志的数据,并显示每个实验复制的相对 MFI 以演示每个报告的 PiSCES 的相对量级和一致性。复制这些数字所需的数据和代码包含在补充文件中。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary Figure 1
图S1:流量细胞测定系统的定制制冷图。流式细胞仪的阵列读取器必须保持在室温下,但下部(微板平台)必须在分析过程中冷藏以保持 PiSCES。有关使用的流量细胞仪和三明治准备冰箱的型号信息,请参阅材料表。a) 上部附件和食物储存箱从三明治准备冰箱中取出。微板平台被放置在金属支架上,用来存放塑料食品储存箱。微板平台的塑料外壳被移除,使其适合。建造了一个定制的有机玻璃平台,其测量值显示在 (b) 中,以覆盖冰箱的上部开口。有机玻璃采用1/2"泡沫绝缘切割绝缘,以匹配有机玻璃的大小,用绝缘胶带密封间隙。然后,通过有机玻璃钻一个洞,使流式细胞计测定器中的样品针在扩展时进入微板平台。一个最初拧入微板平台顶部的黑色耦合装置被拆除,并从有机玻璃上方拧回微板平台,这有助于对齐。当微孔板盖中的门伸出设备时,用户可以访问微孔板托架。请注意,流量细胞仪软件会提醒用户板载波太冷,但用户可以覆盖警告并运行冷却 QMI 实验。(c) 装配系统的照片。(d) 右前角的细节,如绘制于 (a) 中,显示有机玻璃盖和绝缘体的组件。(e) 在孔上方对齐的样品针的细节。(f) 绝缘层的下部细节,允许装置下的空气流动。(g) 打开门的详细信息,显示下面的流量细胞仪微孔板平台。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplementary File
补充文件。复制这些数字所需的数据和代码。请点击此处下载此文件。

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Discussion

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QMI 测定需要在抗体面板开发、设备和试剂方面投入大量资金,但一旦建立了检测,就可以收集高维数据来观察蛋白质相互作用网络,因为它们对实验控制的反应刺激。从技术上讲,QMI 需要仔细移液和跟踪样品和抗体井位置。仔细标记化片是有用的,就像在纸上制作井位的详细模板一样,然后保存该模板进行数据分析。在任何时候保持珠子和流源性冷的重要性,包括在流式细胞仪微孔板载体中(有关定制制冷说明,见图 S1)的重要性怎么强调也不为过。蛋白质相互作用在室温下会迅速分离,早期使用未经修饰的室温流细胞仪的尝试以识别许多温度-实验室相互作用而告终,而不是那些与预期变化的相互作用刺激。

QMI是一种基于抗体的测定,因此抗体的初始选择至关重要。应尽可能使用单克隆或重组抗体,以减少结果的变异性。多克隆体显示批次到批次的变化,但肽基多克隆到短表位似乎相对稳定随着时间的推移。通过购买大批量抗体可以最大限度地减少漂移;这还允许定制无载体抗体,从而排除使用甜胶和旋转柱净化抗体的需要,以及相关的抗体损失。

还必须注意,由于检测信号依赖于可用表位,因此缺少信号并不一定表示缺乏相互作用,这一限制与其他蛋白质相互作用方法是常见的。14此外,当检测到信号时,不可能明确地说明蛋白质相互作用是直接的(A 与 B 相互作用)或间接(A 与 X 和 Y 相互作用,然后与 B 交互),这就是为什么观察到的相互作用是称为PiSCES,而不是蛋白质-蛋白质相互作用(PPI),这可能意味着直接结合。所有基于抗体的方法的局限性是,添加抗体可能会破坏或稳定蛋白质复合物。使用流式细胞学而不是西方印迹的另一个限制是,无法确认抗体特异性的大小信息。为了克服这一限制,IgG控制用于筛选每个抗体对,在进行QMI实验之前,通过敲出或敲撞细胞系或动物确认特异性(第1.4节)。

在 QMI 测定中不使用 IgG 控件,因为每个 IgG 都会产生不同级别的背景信号,因此无法知道要减去的正确背景值。例如,如果 IP (X)_探针 IgG 给出的 MFI 为 100,而 IP IgG_probe Y 给出的 MFI 为 200,则应从 IP X_probe Y 中减去哪个背景值?同样,有时未检测到的交互(例如 IP X 探针 Z)的 MFI 比非特异性 IgG 交互低。考虑到不知道绝对 MFI 信号的这一限制,PiSCES 不会仅因检测到任意背景级别以上而报告。相反,只有针对给定刺激的响应变化的 PiSCES 才会报告。虽然高 MFI 可能由非特异性噪声引起,但此噪声不会随刺激而改变。此外,部分 (10-20%)观察到的条件相关相互作用通常通过第二种方法(通常是 IP-west)进行确认。此确认类似于使用 RT-PCR 确认高通量 RNA 测序结果,旨在增强 QMI 结果的置信度。

如果没有额外的测试,不能排除影响QMI结果的表达效应,因为QMI不能区分蛋白质的绝对水平增加和蛋白质的同质化增加。为了尽量减少表达的不确定性,可以使用时间较短的急性治疗条件进行实验,以尽量减少蛋白质表达水平的潜在变化。需要其他方法来排除慢性治疗条件或原发性患者样本的表达效应。

为 QMI 选择适当的莱沙缓冲液至关重要。洗涤剂过弱会使膜完好无损,并保存在一起的蛋白质,而太强的洗涤剂可以破坏蛋白质复合物。其他因素(如钙或其包合剂的存在)会显著影响 PiSCES,在筛选抗体以包含在 QMI 面板中之前,应仔细考虑。对于 IP-west 实验,通常针对每个 PiSCES 逐案优化莱沙条件,但检测单个 PiSCES 的最佳条件可能不会转换为同一蛋白质网络中的其他 PiSCES22 。洗涤剂的选择提出了鸡和蛋的困境,因为需要一个解液缓冲液来筛选抗体候选物,但需要一组抗体来筛选适当的解液缓冲液。虽然不是一个完美的解决方案,但可以选择一小块特别感兴趣和/或已知关联或解散的珠子和探针面板,并在CML磁珠的不同溶解条件下测试它们的行为最初用于筛选抗体(步骤 1.1.3)。理想的洗涤剂应允许可靠地检测 PiSCES 和重述已知生理蛋白质行为(关联/分离)与给定刺激。如果有人担心洗涤剂不能完全溶解膜,可以添加负对照抗体,只有在两种蛋白质由膜24连接时才会发出信号。当选择适当的莱沙缓冲液时,甚至可以弱相互作用的变化(如激酶和基板之间的相互作用)可以可靠地检测到(例如TCR-LCK)14。

以前在神经元和T细胞中使用QMI的工作都仔细证实了以前的发现,以提高对QMI结果有效性的信心,并产生了新的假设,导致对信号转导和疾病通路的发现。将来,QMI 可以适应其他蛋白质相互作用网络,并扩展至多达 500 种蛋白质,并采用当前的微球类别。使用 QMI 研究多蛋白复合物网络在控制细胞过程时如何随着刺激而变化,有可能对健康和疾病产生重要的见解。

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Disclosures

提交人没有利益冲突可披露。

Acknowledgments

作者希望感谢 Tessa Davis 对 QMI 测定开发做出的重要贡献,以及史密斯和施鲁姆实验室的现任和前任成员的技术指导和智力投入。这项工作由NIMH赠款R01 MH113545和R00 MH 102244资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

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使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化
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Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).More

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