Vurdering af lymfocyt migration i et ex vivo-Transmigrerings system
Summary
I denne protokol er lymfocytter placeret i det øverste kammer af et transmigrerings system, adskilt fra det nederste kammer af en porøs membran. Chemokin tilsættes til det nederste kammer, som inducerer aktiv migration langs en chemokine gradient. Efter 48 h tælles lymfocytter i begge kamre for at kvantificere overførsel.
Abstract
Heri præsenterer vi en effektiv metode, der kan udføres med grundlæggende laboratorie færdigheder og materialer til at vurdere lymfocyt chemokinetisk bevægelse i et ex vivo transmigrerings system. Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) og CD4+ T hjælpe celler blev isoleret fra deres og lunger af hønseæg ægalbumin (OVA)-udfordrede Balb/c-mus. Vi bekræftede udtrykket af CCR4 på både CD4+ T- celler og ILC2, forholdsvis. CCL17 og CCL22 er de kendte ligander for CCR4; ved hjælp af denne ex vivo-transmigrerings metode undersøgte vi derfor CCL17– og CCL22-induceret bevægelse af CCR4+ lymfocytter. For at etablere kemo gradienter blev CCL17 og CCL22 anbragt i det nederste kammer af transmigrerings systemet. Isolerede lymfocytter blev derefter føjet til top kamre og over en 48 h periode lymfocytter aktivt migreret gennem 3 μm porer mod chemokine i nederste kammer. Dette er et effektivt system til bestemmelse af de chemokinetik af lymfocytter, men, forståeligt nok, ikke efterligner de kompleksiteter findes i in vivo orgel mikromiljøer. Dette er en begrænsning af den metode, der kan overvindes ved tilsætning af in situ billeddannelse af orgel og lymfocytter under undersøgelse. I modsætning hertil fordelen ved denne metode er, at der kan udføres af en entry-level tekniker på en langt mere omkostningseffektiv sats end Live imaging. Som terapeutiske forbindelser bliver tilgængelige for at øge migration, som i tilfælde af tumor infiltrerende cytotoksiske immunceller, eller at hæmme migration, måske i tilfælde af autoimmune sygdomme, hvor immunopatologi giver anledning til bekymring, denne metode kan bruges som en screening værktøj. Generelt, metoden er effektiv, hvis chemokine af interesse er konsekvent genererer chemokinetics på et statistisk højere niveau end medierne kontrol. I sådanne tilfælde kan graden af hæmning/forbedring af en given forbindelse bestemmes så godt.
Introduction
Denne oprindelige transmigrering metode blev præsenteret af Stephen BoyDen i 1962 i Journal of eksperimentel medicin1. Meget af det, vi ved om chemotaxis og chemokinetik, ville ikke være muligt uden udvikling af BoyDen-kammeret. Før opdagelsen af den første chemokine i 1977, ex vivo transmigrering systemer blev brugt til at lære om serum-faktorer, der kunne arrestere cellulære bevægelse i makrofager mens forstærke cellulære motilitet i neutrofiler1,2. En massiv rigdom af viden er blevet udviklet med hensyn til immuncelle migration, og til dato, 47 kemokiner er nu blevet opdaget med 19 tilsvarende receptorer3,4. Desuden er fler mængder af hæmmere/smagsforstærkere af disse kemo okinveje undergået udvikling til terapeutiske formål5,6,7,8. Mange af disse forbindelser er blevet testet i lignende vandring kamre til at forstå direkte interaktioner mellem forbindelser og immuncelle reaktionsevne til en given chemokine9.
Transmigration, eller diapedesis, i betændelses vævet væv er en vigtig proces til en sund inflammatorisk respons på klar infektion10,11. Et BoyDen-kammer, transmigrerings system eller transwell-apparatur består almindeligvis af to kamre adskilt af en porøs membran1,12. Den nederste kammer oftest holder medier, der indeholder chemokine af interesse, mens leukocytter er placeret i øverste kammer. Størrelsen af pore i membranen kan vælges baseret på størrelsen af cellen af interesse. Til dette projekt, vi har valgt en 3 μm porøs membran, som lymfoide celler er 7-20 μm i størrelse, afhængigt af den fase af cellulære udvikling. Denne porestørrelse sikrer, at disse celler ikke passivt falder gennem porerne, men at de aktivt migrerer som reaktion på chemokine gradient.
Den største fordel ved denne protokol er dens omkostningseffektivitet. In vivo transmigration er vanskelig, fordi det kræver omfattende uddannelse i dyre håndtering og kirurgi, og ofte involverer høj-drevne mikroskopi, der ikke altid er til rådighed for en forsker. Omkostningseffektiv screening af forbindelser menes at forbedre eller hæmme overførsel kan opnås forud for in vivo Imaging. Da transmigrerings systemet er stramt kontrolleret, kan cellerne i første omgang behandles derefter til transwell-apparatet, eller, omvendt, kan chemokin behandles først med en chemokine-hæmmer, derefter tilsættes cellerne til transwell-apparatet. Endelig kan endotel celler og/eller kælder membran proteiner tilsættes til bunden af transwell INSERT 1-2 dage før transmigration eksperiment for at forstå inddragelsen af disse barriere celler i chemokinetics. Igen, disse manipulationer af systemet giver et effektivt middel til at bestemme vigtige oplysninger om effektiviteten af en given forbindelse forud for mere komplicerede in vivo undersøgelser.
Anvendelse af et transmigrerings kammer system er en effektiv metode til at vurdere lymfocyt mobilitet under forskellige in vivo-og in vitro-forhold12,13,14. Heri beskrives en optimeret metode til vurdering af ex vivo-lymfocyt respons på kemo okiner i et transmigrationskammer. I dette eksempel eksperiment blev CD4+ T- celler og gruppe 2-medfødte lymfoide celler (ILC2) isoleret fra mænd og kvinder, Balb/c-mus efter eksponering af æg-allergen. En hypotese blev genereret, at CCR4+ CD45+ LINEAGE-(Lin-) ILC2 fra allergen-udfordrede mus ville migrere mere effektivt mod CCL17 og CCL22 end CCR4+ CD4+ T hjælpe celler. CCL17 og CCL22 er kemo okiner, der almindeligvis produceres af dendritiske celler og makrofager af m2 (allergisk) fænotype, blandt andre celler, i allergi15,16. CCL17 og CCL22 kan opfattes som biomarkører af allergisk inflammation, da de let påvises i lungerne under luftvejs eksacerbationer16,17,18. Det er vigtigt, CCR4 ekspression er forhøjet i forhold til ubehandlede Kontroller, som afsløret i bioinformatiske data genereret fra ILC2 isoleret fra House Dust mide behandlede dyr, og tilsvarende ILC2 fra naive dyr behandlet ex vivo med Il-33 ( allergen-fremme af medfødte cytokin) opregulerer CCR419,20. Desuden, ifølge data for ILC2 i den immunologiske genom Project database (www.immgen.org), CCR4 mRNA er stærkt udtrykt i disse medfødte immunceller. Til dato, er lidt kendt om handel med ILC2 i væv, men det er sandsynligt, at ILC2 og CD4+ T celler bruger lignende kemo okiner og receptorer for chemotaxis og chemokinetics som de udtrykker lignende transkriptionsfaktorer og receptorer. Således sammenlignede vi CCL17 versus CCL22 reaktionsevne, af ILC2 og CD4+ T-lymfocytter, fra både mandlige og kvinder, æg-udfordrede dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri præsenterer vi en veletableret metode til vurdering af kemo-induceret migration af lymfocytter i et ex vivo transmigrerings system. Der er flere kritiske trin i protokollen, hvoraf den første er at kontrollere ekspression af den korrekte chemokine receptor på immuncellerne i forsøget. I vores hænder, valgte vi CCR4 på grund af litteraturen, der fremhæver vigtigheden af CCR4 på Th2 hjælper T celler i allergisk inflammation. Ovalbumin-induceret inflammation blev tidligere påvist at være begrænset af mindst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af American Lung Association (K.J.W.), mindesmærket Eugene Kenney fond tildelt T.A.W. og K.J.W., generøs start-up støtte fra University of Utah for K.J.W., og en afdeling af veteraner anliggender Award til T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. er modtager af en forskerkarriere videnskabsmand Award (IK6 BX003781) fra Department of Veterans Affairs. Forfatterne ønsker at anerkende redaktionel bistand fra MS. Lisa Chudomelka. Forfatterne takker unmc flow flowcytometri Core for deres støtte til at indsamle de flow cytometri-data, der genereres for dette manuskript.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
- Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
- Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
- Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
- Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
- Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn’s and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
- Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
- Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
- Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
- Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
- Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
- Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
- Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
- Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
- Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
- Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
- Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
- Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
- Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
- Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
- Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
- Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
- Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
- Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
- Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
- Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
- Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
- Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
- Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
