Bedömning av Lymfocytmigration i ett transmigrations system ex vivo
Summary
I detta protokoll är lymfocyter placeras i den övre kammaren i ett transmigration system, separerade från botten kammaren av ett poröst membran. Chemokine läggs till botten kammaren, som inducerar aktiv migration längs en Chemokine lutning. Efter 48 h räknas lymfocyter i båda kamrarna för att kvantifiera transmigration.
Abstract
Häri presenterar vi en effektiv metod som kan utföras med grundläggande laboratorie kunskaper och material för att bedöma lymfocytkemokinetiska rörelser i ett transmigrations system ex vivo. Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2) och CD4+ T Helper celler isolerades från mjälte och lungor av kyckling ägg äggalbumin (ova)-ifrågasatte Balb/c möss. Vi bekräftade uttrycket av CCR4 på både CD4+ T-celler och ILC2, jämförelsevis. CCL17 och CCL22 är de kända liganderna för CCR4; Därför, med hjälp av denna ex vivo transmigration metod undersökte vi CCL17– och CCL22-inducerad förflyttning av CCR4+ lymfocyter. För att fastställa Chemokine gradienter, CCL17 och CCL22 placerades i botten kammaren av transmigration systemet. Isolerade lymfocyter lades sedan till översta kamrarna och över en 48 h period lymfocyter aktivt migreras genom 3 μm porer mot Chemokine i botten kammaren. Detta är ett effektivt system för bestämning av chemokinetik av lymfocyter, men, förståeligt, inte efterlikna de komplikationer som finns i in vivo organ mikromiljöer. Detta är en begränsning av den metod som kan övervinnas genom tillsats av in situ-avbildning av det organ och de lymfocyter som studeras. Fördelen med denna metod är däremot att den kan utföras av en tekniker på ingångsnivå med en mycket mer kostnadseffektiv hastighet än Live Imaging. Som terapeutiska föreningar blir tillgängliga för att förbättra migration, som i fallet med tumör infiltrerande cytotoxiska immunceller, eller att hämma migration, kanske i fallet med autoimmuna sjukdomar där immunopatologi är oroande, denna metod kan användas som en screening verktyg. I allmänhet är metoden effektiv om Chemokine av intresse konsekvent genererar chemokinetics på en statistiskt högre nivå än Media kontroll. I sådana fall kan graden av hämning/förbättring av en viss förening bestämmas också.
Introduction
Denna ursprungliga transmigration metod presenterades av Stephen Boyden i 1962 i Journal of experimental Medicine1. Mycket av vad vi vet om chemotaxis och chemokinetics skulle inte vara möjligt utan utvecklingen av Boyden kammaren. Före upptäckten av den första Chemokine i 1977, ex vivo transmigration system användes för att lära sig om serum-faktorer som kan gripa cellulära rörligheten i makrofager samtidigt förstärka cellulära motilitet i neutrofiler1,2. En massiv rikedom av kunskap har utvecklats när det gäller immun cell migration, och hittills har 47 chemokiner nu upptäckts med 19 motsvarande receptorer3,4. Dessutom, mängder av hämmare/förstärkare av dessa Chemokine vägar har genomgått utveckling för terapeutiska ändamål5,6,7,8. Många av dessa föreningar har testats i liknande transmigration kammare för att förstå direkt interaktion mellan föreningarna och immuncellernas reaktionsförmåga till en given Chemokine9.
Transmigration, eller diapedesis, till inflammerad vävnad är en viktig process för att en hälsosam inflammatorisk reaktion på klar infektion10,11. En Boyden kammare, transmigration system, eller transwell apparater är i allmänhet består av två kammare åtskilda av ett poröst membran1,12. Botten kammaren oftast innehar media som innehåller Chemokine av intresse, medan leukocyter placeras i den övre kammaren. Storleken på pore i membranet kan väljas baserat på storleken på den cell av intresse. För detta projekt valde vi ett 3 μm poröst membran, eftersom lymfoida celler är 7-20 μm i storlek, beroende på stadiet av cellulära utveckling. Denna porstorlek säkerställer att dessa celler inte passivt faller genom porerna, men att de aktivt migrerar som svar på Chemokine lutning.
Den stora fördelen med detta protokoll är dess kostnadseffektivitet. In vivo transmigration är svårt eftersom det kräver omfattande utbildning i djurhantering och kirurgi, och ofta innebär hög driven mikroskopi som inte alltid är tillgänglig för en forskare. Kostnadseffektiv screening av föreningar som tros förbättra eller hämma transmigration kan åstadkommas i förväg av in vivo Imaging. Eftersom transmigration systemet är tätt kontrollerad, celler kan behandlas initialt sedan läggas till transwell apparaten, eller vice versa, Chemokine kan behandlas först med en Chemokine hämmare sedan celler läggas till transwell apparaten. Slutligen, endotelceller och/eller basalmembran proteiner kan läggas till botten av transwell infoga 1-2 dagar före transmigration experimentet att förstå inblandning av dessa barriär celler i chemokinetics. Återigen, dessa manipulationer av systemet ger ett kraftfullt sätt att fastställa viktig information om effektiviteten av en given förening i förväg av mer komplicerade in vivo studier.
Att använda ett transmigrations kammar system är ett effektivt sätt att bedöma lymfocytrörligheten under olika in vivo-och in vitro-villkor12,13,14. Häri, beskriver vi en optimerad metod för att bedöma ex vivo lymfocytreaktionsförmåga till chemokiner i en transmigration kammare. I detta exempel experiment, CD4+ T-celler och grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2) isolerades från manliga och kvinnliga, Balb/c möss efter OVA-allergen exponering. En hypotes genererades att CCR4+ CD45+ Lineage-(LIN-) ILC2 från allergen-utmanade möss skulle MIGRERA mer effektivt mot CCL17 och CCL22 än CCR4+ CD4+ T Helper celler. CCL17 och CCL22 är chemokines vanligen produceras av dendritiska celler och makrofager av m2 (allergisk) fenotyp, bland andra celler, i allergi15,16. CCL17 och CCL22 kan betraktas som biomarkörer för allergisk inflammation eftersom de lätt upptäcks i lungorna under luftvägarna exacerbationer16,17,18. Viktigt, CCR4 uttrycket är förhöjd i jämförelse med obehandlade kontroller, som avslöjas i bioinformatiska data som genereras från ILC2 isolerade från hus dammkvalster behandlade djur, och likaså ILC2 från naiva djur behandlade ex vivo med IL-33 ( allergen-främja medfödda cytokin) uppreglerar CCR419,20. Dessutom, enligt uppgifter för ILC2 i den immunologiska genomprojektet databas (www.immgen.org), CCR4 mRNA är starkt uttryckt i dessa medfödda immunceller. Hittills är lite känt om handel med ILC2 i vävnader, men det är troligt att ILC2 och CD4+ T-celler använder liknande chemokines och receptorer för chemotaxis och chemokinetics som de uttrycker liknande transkriptionsfaktorer och receptorer. Således jämförde vi CCL17 kontra CCL22 lyhördhet, av ILC2 och CD4+ T-lymfocyter, från både manliga och kvinnliga, OVA-utmanade djur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri presenterar vi en väl etablerad metod för att bedöma Chemokine-inducerad migration av lymfocyter i ett ex vivo transmigration system. Det finns flera kritiska steg i protokollet, varav den första är att kontrollera uttrycket av rätt Chemokine receptor på immuncellerna i experimentet. I våra händer valde vi CCR4 på grund av kroppen av litteratur som belyser vikten av CCR4 på Th2 helper T-celler i allergisk inflammation. Ovalbumin-inducerad inflammation visades tidigare att begränsas av minst två CCR4-an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av American lung Association (K.J.W.), minnesmärket Eugene Kenney Fund tilldelas T.A.W. och K.J.W., generösa start-up stöd från University of Utah för K.J.W., och en avdelning för Veterans Affairs Award till T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. är mottagare av en forskarkarriär Scientist Award (IK6 BX003781) från Department of Veterans Affairs. Författarna vill erkänna redaktionellt stöd från MS Lisa Chudomelka. Författarna tackar UNMC Flow flödescytometrianalys Core för deras stöd för att samla in flödet flödescytometrianalys data som genereras för detta manuskript.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
- Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
- Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
- Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
- Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
- Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn’s and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
- Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
- Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
- Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
- Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
- Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
- Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
- Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
- Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
- Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
- Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
- Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
- Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
- Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
- Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
- Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
- Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
- Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
- Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
- Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
- Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
- Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
- Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
- Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
