Summary
미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.
Abstract
인간 게놈의 대부분 (~98%) 비코딩 시퀀스로 구성됩니다. Cis-조절요소(CRE)는 유전자 발현을 조절하기 위한 전사 조절부위를 포함하는 비코딩 DNA 서열이다. CR의 변경은 암을 포함하여 각종 질병에서 연루되었습니다. 프로모터와 인핸서는 유전자 조절을 연구하기위한 기본 CR이었지만, 유전자 억압을 중재하는 CRE의 또 다른 유형인 소음기의 역할에 대해서는 거의 알려져 없습니다. 원래 원핵 생물에 적응 면역 시스템으로 확인, CRISPR/Cas9 진핵 게놈 편집을 위한 강력한 도구로 악용 되었습니다. 여기에서, 우리는 인간 RUNX1 유전자에 있는 내향성 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에 있는 유전자 발현에 대한 충격을 조사하기 위하여 이 기술의 사용을 제시합니다. 우리의 접근은 2개의 미리 조립된 Cas9/가이드 RNA (gRNA) 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체의 전기 개화 매개 전달에 의존하여 소음기 측면의 두 개의 이중 가닥 브레이크(DSBs)를 생성합니다. 조각 분석을 통해 삭제를 쉽게 스크리볼 수 있습니다. 다른 mRNAs의 발현 분석은 대체 프로모터로부터 전사되어 프로모터 의존효과를 평가하는 데 도움이 됩니다. 이 전략은 그밖 CREs를 공부하기 위하여 이용될 수 있고 플라스미드 기지를 둔 방법으로 수시로 transfect하기 어려운 조혈 세포에 특히 적당합니다. 플라스미드 및 바이러스 없는 전략을 사용하면 유전자 조절 기능을 간단하고 빠르게 평가할 수 있습니다.
Introduction
Cis-조절요소(CRE)는 유전자 발현을 조절하기 위한 전사 조절부위를포함하는 비코딩 DNA 서열1,2. 이러한 요소는 일반적으로 100 ~ 1,000개의 기본 쌍(bp)입니다. 프로모터와 인핸서는 가장 특징이 있는 두 가지 유형의 CR입니다. 프로모터는 전사 시작 부위에 근접하여 존재하며 전사의 기본 단위를 구성한다. 많은 유전자는 하나 이상의 프로모터를 가지고 있으며 이들의 대체 용도는 전사체 다양성 및 조직 특이성에 기여3,4. 다른 한편으로는, 증강인자는 전사를 활성화하고 표적 유전자의 상류, 다운스트림 또는 인트론 내에 위치할 수 있다. 인핸서는 먼 거리에서 (메가 베이스를 통해)방향 1,2와독립적으로 작동 할 수 있습니다. CR은 또한 소음기와 절연체5,6을포함한다. 전자는 전사 억제제에 결합하여 유전자 발현을 억제하는 강화제에 반대작용하는 반면, 후자는 게놈을 이산 토폴로지 도메인으로 분할하여 인접한 도메인으로부터 다른 CR로부터 유전자를 절연합니다. 이 요소는 단거리 및/또는 장거리 염색질 상호 작용을 통해 서로 협력하여 행동하고 적당한 spatiotemporal 유전자 발현을 지시하기 위하여 규제 허브로 조직됩니다. 고처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전은 계보 특정 유전자를 지시하는 전사 네트워크의 우리의 이해를 크게 촉진한 많은 CR의 식별 및 기능적 추가를 가속화했습니다. 다른 세포와 조직 유형7,8,9,10,11,12에서발현 .
전사 를 조절하는 데 있어 CREs의 근본적인 역할을 감안할 때, 그들의 변경은 비정상적인 유전자 발현으로 이어질 수 있습니다. CR은 다양한 유형의 인간 암에서 유전적 및 후생유전학적 변화에 의해 자주 중단되는 것으로 나타났으며, 이로 인해 종양 개시, 진행 및 공격성에 기여하는13,14. 또한, CRE 결합 인자는 종종 다양한 암 유형에서 돌연변이 및/또는 잘못 발현되며, 종양 발생15에서CRE 규제 완화의 중요성을 더욱 부각시다. CREs는 또한 B 세포 림프종16에서인접한 종양 유전자의 비정상적인 활성화를 초래하는 면역 글로불린 무거운 (IgH) 유전자 증강의 빈번한 염색체 재배열에 의해 예시된 바와 같이 구조적 수차에 의해 영향을 받을 수 있다. 급성 골수성 백혈병에서 (AML), 염색체 3 q 재배열에 의해 단일 증강의 재배치는 수반되는 GATA2 다운 조절 및 EVI1 활성화를 일으키는 원인이 되며, 이는 잠재적으로 인핸서 기능의 BET 억제에 의해 표적으로 될 수 있습니다 17. 최근, 우리는 소아 환자18에서AML 진행에 기여할 수있는 RUNX1 인트로닉 소음기의 교란과 관련된 새로운 염색체 전좌를 특징으로합니다. 따라서, 비코딩 암 게놈을 해독하는 것은 궁극적으로 환자 결과를 향상시키는 질병 병인, 바이오마커 발견 및 치료 내정간섭을 해명하기위한 유익한 길을 제공합니다.
원래 원핵 세포에서 적응형 면역 계통으로 확인된 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 경로는 살아있는 세포 및 유기체에서 사이트 별 게놈 편집을 위한 신속하고 비용 효과적인 수단으로 이용되고 있습니다19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9 시스템은 gRNA 및 연쇄상 구균 pyogenes-파생 된 Cas9 뉴클레아제의 두 가지 주요 구성 요소를 포함합니다. gRNA는 표적 지구를 인식하고 편집을 위해 Cas9를 지시하는 protospacer에게 불린 특정 순서를 포함합니다. gRNA는 두 부분으로 구성된다: CRISPR RNA (crRNA), 전형적으로 표적 DNA에 상보적인 20-머티누티드 서열, 및 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA), 이는 뉴클레아제에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 한다. 표적 부위에 바로 인접한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)(5'-NGG)는 Cas9 절단 부위에 필요하며, 절단 부위는 PAM의 상류에 위치한 3개의 뉴클레오티드를 위치시키고 있다. Cas9및 복제 된 gRNA23을인코딩하는 플라스미드 . 그러나, 이 접근은 수시로 transfect하기 어렵고 긴 바이러스 기지를 둔 transduction 방법을 요구하는 조혈 세포를 위해 도전적입니다. 대안적인 접근법은 미리 조립된 Cas9/gRNA RNP 복합체24의직접 세포 전달이다. RNP 전달을 위한 일반적인 방법은 세포막에 일시적인 기공을 생성하는 전기 포출이며, 따라서 RNP 복합체를 세포 내로 의 진입을 허용한다25,26. 이 접근법의 장점은 사용 용이성, 오프 타겟 효과 감소 및 RNP 복합체의 안정성을 포함합니다. 여기서, 우리는 AML 환자의 말초 혈액으로부터 확립된 OCI-AML3 백혈병 세포주(18)에서 RUNX1 내성사일러의 전사 역할을 조사하기 위해 RNP 전달 방법을 사용하는 프로토콜을 설명한다. 프랑스-미국-영국 M4 아류형27로진단. 프로토콜은 crRNA의 설계, RNP 복합체의 제제, 전기 화뿐만 아니라 원하는 클론의 스크리닝 및 후속 특성화를 포함한다.
Protocol
1. crRNA의 디자인
- 웹 기반 CRISPR 설계 도구28,29,30,31을사용하여 대상 CRE의 두 crRNAs, 1개 5' 및 다른 3'을 디자인합니다. NGG의 PAM이 Cas9 인식을 위한 대상 시퀀스의 바로 하류에 위치하도록 합니다. RUNX1 소음기(18)의 삭제를 위한 두 crRNA(crRNA-1 및 crRNA-2)의 설계는 도 1에도시되어 있다.
참고: crRNA는 전형적으로 표적 서열에 상보적인 20-mer 프로토스페이서를 포함한다. - 온라인 게놈 브라우저(예를 들어, NCBI 1000 게놈 또는 UCSC 게놈 브라우저)의 검색 상자에 서열의 게놈 위치를 입력하여 표적 및 인접 PAM 서열에 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)/인델의 존재를 확인한다.
참고: 일반적인 SP/indels는 일반 인구에서 적어도 1%의 사소한 대말레 빈도가 있습니다. - 상용 공급 업체와 합성을 위해 선택한 crRNA 서열을 제출합니다. 또한, gRNA 이중 형성을 위한 tracrRNA를 구입하십시오.
2. 삭제 스크리닝 프라이머의 설계
- 의도한 삭제 영역 측면에 있는 프라이머 쌍을 디자인합니다. 프라이머가 Cas9 절단 부위로부터 50bp 이상 인지 하여 PCR 증폭이 절단 부위에 형성된 인델에 의해 최소한의 영향을 받도록 한다.
- 앰플리온이 1,200bp보다 작아야 합니다(더 나은 크기 해상도를 위해 600bp보다 작음). 또한, 검출을 위해 5'-엔드에 형광 염료(예를 들어, 6-카르복플루오레세인(6-FAM)))로 프라이머 중 하나를 라벨을 붙입니다. RUNX1 소음기삭제(18)의 스크리닝에 사용되는 프라이머는 그림 1에나타내었다.
3. Cas9/gRNA RNP 복합체의 준비
- crRNA 및 트라크RNA를 1x TE 버퍼(10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)에서 200 μM의 최종 농도로 재중단시켰다.
- 각 crRNA에 대해 2.2 μL의 200 μM crRNA, 200 μM tracrRNA의 2.2 μL 및 0.2 mL 튜브에 1x TE 버퍼 (총 10 μL)의 5.6 μL을 혼합하여 44 μM의 최종 이중 농도를 얻습니다.
- 95°C에서 열자전거에서 5분 동안 배양합니다. gRNA 복합체 형성을 위해 튜브를 실온으로 식힙니다.
- 10.4 μL의 62 μM 재조합 Cas9 뉴클레아아제를 1x 인산완충 식염수(PBS)의 7.6 μL로 희석하여 36 μM의 최종 뉴클레아제 농도를 얻었다.
참고: 이 양은 2개의 Cas9/gRNA 복합체의 제조를 위해 충분하다. - 3.3단계에서 수득된 각 gRNA 듀플렉스와 희석된 뉴클레아제의 동일한 부피(8.5 μL)를 혼합한다.
- RNP 복합체 형성을 허용하기 위해 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 혼합물을 전기 가산 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
4. OCI-AML3 세포로 RNP 복합체의 전기 화기
- RPMI 1640 배지에서 배양 OCI-AML3 세포는 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS), 글루타맥스 100 단위/mL, 페니실린 100 μg/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL(이하 완전한 RPMI 1640 배지라고 함) 5 % C5% C .
- 트라이판 블루 염색을 사용하여 세포를 계산합니다. 전기 천공 시 전지 생존가능성이 90% 이상인지 확인하십시오.
- 원심분리기 2.5 x 106 세포에서 실온에서 5 분 동안 500 x g에서 1.5 mL 튜브. 상한체를 제거하고 1 x PBS의 1 mL로 세포를 씻으하십시오. 세포를 다시 스핀 다운하고 모든 잔류 상한체를 제거하십시오.
- 페놀 적색 없이 RPMI 1640 배지의 163 μL에서 세포를 재중단하였다. 각 RNP 복합체의 16.7 μL(단계 3.6부터)과 100 μM 전기 천공 증강인자의 3.6 μL을 세포에 추가합니다(총 부피 = 200 μL). 파이펫팅하여 부드럽게 섞으세요.
참고: 전기 개공 증강은 편집 효율을 향상시키기위한 캐리어 DNA입니다. - 혼합물을 기포 없이 0.2 cm 갭 전기 큐벳으로 옮니다. 전기 천공 시스템으로 전기 천공 을 수행 (모드 : 지수; 전압 =: 150 V; 정전 용량 = 700 μF; 저항 = 50 Ω).
- 완전한 RPMI 1640 배지의 6 mL을 함유하는 T-25 조직 배양 플라스크에 세포를 전달하고5% CO2로 37°C에서 배양한다.
5. 바이알레트 삭제를 가진 세포 클론의 선별 그리고 선택
- 전기 천공 후 하루동안 완전한 RPMI 1640 배지에서 세포를 5 x 10 3/mL로 희석한다. 희석된 세포 현탁액의 100 μL을 96웰 조직 배양판의 각 웰에 넣고 세포가 7-14일 동안 자랄 수 있도록 한다.
- 고처리량 정제 시스템을 사용하여 세포에서 게놈 DNA를 추출합니다.
- 96웰 추출 플레이트의 각 웰에 100 μL의 플레이트 결합 및 용해 버퍼를 추가합니다. 버퍼에 10 μL의 10 μL에서 다시 매달린 5 x 104 셀을 추가하고 파이펫팅하여 혼합하십시오.
- 유전체 DNA를 웰에 결합할 수 있도록 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 우물 표면을 긁지 않고 우물에서 용액을 흡인합니다. 120 μL의 세척 버퍼로 우물을 씻으하십시오.
- 경계 DNA를 포함하는 우물을 공기 건조.
- 20 μL의 PCR 혼합물(10x 고충실도 완충제 2 μL, 50 mM MgSO4의0.8 μL, 10 mM dNTP의 0.4 μL, 10 μM FAM 표지 된 전방 프라이머의 0.4 μL (단계 2.2), 0.4 μL의 10m 비표지 역프라이머 및 0.4 μL의 각 Uq.
참고: 각 샘플에 표준화된 양의 시약이 첨가되도록 마스터 믹스를 준비합니다. - 추출 플레이트의 각 웰에 PCR 혼합물을 추가하고 열사이클러에서 반응을 실행합니다(조건: 초기 94°C에서 2분, 15s의 경우 94°C의 35사이클, 30s의 경우 56°C, 1분 동안 68°C).
- 형광계를 사용하여 선택한 수의 샘플에서 농도를 측정하여 제품의 양을 추정합니다. 모든 시료를 뉴클레아제 프리 H2O ~ 0.5 ng/μL로 희석합니다.
- 희석된 PCR 제품의 1 μL을 유전 분석기와 호환되는 96웰 플레이트에 8.5 μL의 탈이온화된 포름아마이드 및 0.5 μL의 형광 염료 표지 크기 표준과 혼합합니다.
참고: 탈이온화된 포름아미드와 크기 표준을 포함하는 마스터 믹스를 준비한다. - 플레이트 를 중격으로 덮고 열사이클러에서 3 분 동안 95 °C에서 샘플을 변성시. 기기 뚜껑을 닫지 마십시오.
- 모세관 겔 전기동동을 수행하여 앞서 설명한 바와 같이 표지된 PCR 제품을분리한다(32).
- 전기 동동 후, 결과를 분석하기 위해 분석 소프트웨어를 엽니 다.
- 새 프로젝트를 클릭하고 마이크로위성을선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 프로젝트에 샘플 추가를 클릭하고 결과 파일(.fsa 확장명 포함)을 선택합니다. 그런 다음 목록에 추가를 클릭하여 파일을 가져옵니다.
- 선택한 결과 파일을 표시하는 표에서 분석 방법 열에서 마이크로위성 기본값을 선택합니다. 또한 크기 표준 열에 사용된 크기 표준을 선택합니다. 그런 다음 분석 아이콘을 클릭하고 실험 이름을 입력하고 실험을 저장합니다.
- 플롯 표시를 클릭하여 결과를 보고 플롯 설정에서 조각 해석을 선택합니다.
- 분석을 위해 적절한 색상 채널을 선택합니다. 주황색 아이콘을 확인하여 크기 표준의 레이블이 지정된 조각을 확인하여 크기 호출 품질을 평가합니다.
- 파란색 아이콘을 확인하여 레이블이 지정된 PCR 제품을 확인합니다. 야생 형 및 돌연변이 (즉, 예상 삭제를 베어링) 제품에 해당하는 피크를 식별합니다. 각 샘플의 돌연변이 수준을 야생형 및 돌연변이 피크 하에서 영역의 합으로 돌연변이 피크 아래의 영역으로 나누어 추정한다.
- 추가 직렬 희석에 대한 예상 삭제 수준이 높은 여러 셀 풀을 선택합니다.
- DNA 추출, 형광 PCR 및 모세관 전기 동아 단계를 반복합니다. 후속 분석을 위해 이중 균 탈약을 나타내는 돌연변이 수준 >95%를 가진 세포 클론을 선택합니다.
- Sanger 시퀀싱을 통해 선택한 클론에서 삭제의 ID를 확인합니다.
6. 실시간 정량적 RT-PCR 분석에 의한 소음기 삭제의 기능 분석
- 선택된 클론으로부터 총 RNA를 추출하고 상보적인 DNA(cDNA) 합성을 수행한다.
- RNA 1 μg를 50 μM 올리고(dT)20 μr 20 프라이머와 1 μL의 1 μL을 총 부피에서 10 μL로 혼합한 다음 65°C에서 5분 동안 얼음위에 놓습니다.
- 10x RT 버퍼 2 μL, 25 mM MgCl 2, 0.1 MDTT의 2 μL, RNase 억제제 1 μL (40 U/μL) 및 역전사 제라스타제 1 μL (200 U/μL)을 포함하는 cDNA 합성 믹스 10 μL을 추가합니다. 50°C에서 50분 동안 배양한 다음 85°C에서 열전도에서 5분 동안 배양합니다.
참고: 역전사를 위한 마스터 믹스를 준비한다. - 얼음에 샘플을 냉각. RNase H 1 μL을 넣고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 설계 프라이머 및 TaqMan 프로브는 대체 프로모터로부터 생성된 개별 전사체 변이체를 구체적으로 인식합니다.
참고: 사전 설계된 전사체 별 프라이머/프로브 세트는 시판되고 있습니다. - 플라스미드 DNA로 특정 전사체 서열을 포함하는 DNA 단편을 복제한다. 재조합 플라스미드의 10배 희석 계열(10 6~10부)을 전사체 정량화를 위한 표준 곡선으로서 준비한다.
- 각 샘플(cDNA 및 플라스미드 표준 모두)에 대해 20 μL의 PCR 혼합물(DNA 템플릿 0.5 μL, 미리 설계된 TaqMan 프로브/프라이머 분석기 1μL 및 2x TaqMan PCR 마스터 믹스 10 μL)을 준비합니다. 각 샘플을 세 배로 측정합니다.
참고: 실시간 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. - 실시간 PCR 기계에서 반응을 실행합니다(조건: 초기 50°C에서 2분, 10분 동안 95°C, 15s의 경우 94°C의 40사이클, 1분 동안 60°C).
- 증폭 후 소프트웨어의 분석 아이콘을 클릭하여 데이터를 분석합니다. 표준 곡선의 경사 및 상관 계수를 확인하여 반응의 효율및 선형성을 평가합니다. 경사가 -3.1과 -3.6 사이이고 상관 계수가 0.99보다 큰지 확인합니다.
- 하우스키핑 유전자(예를 들어, GAPDH)를 사용하여 각 샘플에서 표적 전사체의 카피 수를 정규화한다.
Representative Results
이 실험의 목적은 RUNX1 유전자에서 내향성 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 세포에서 RUNX1 전사에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 소음기는 조합 분자 접근법에 의해 확인되었고 209 bp 코어엘리먼트(18)를 함유하는 것으로 밝혀졌다. RUNX1 발현을 제어하는 데 서 이러한 핵심 요소를 보다 정확하게 평가할 수 있도록, crRNA(crRNA-1 및 crRNA-2)는 이부위18을 밀접하게 표적으로 하도록 설계되었다(도 1). crRNA-1 및 crRNA-2에 의해 가져온 예측된 Cas9 절단 부위는 각각 코어 원소로부터 29 bp 및 35 bp였다(도 1). 두 crRNA의 PAM 사이트가 반대 가닥에 상주하는 동안 DSB는 PAM 시퀀스 위치와 독립적으로 발생합니다. 따라서, crRNA-1 및 crRNA-2에 의해 유도된 2개의 Cas9/gRNA RNP 복합체의 수반되는 도입은 RUNX1 궤적으로부터 의 소음기 요소를 절제할 것으로 예상된다.
다수의 샘플에서 원하는 삭제를 스크리피하기 위해, 고처리량 정제를 위해 96웰 포맷의 게놈 DNA 추출 키트를 사용하였다. 또한 추출 플레이트의 우물에 결합된 DNA는 직접 증폭을 받을 수 있으므로 반복된 시료 전달로 인한 오류 또는 오염을 최소화할 수 있습니다. 삭제(18)의 스크리닝에 사용되는 프라이머는 도1에 도시되어 있다. 야생형 PCR 제품의 예상 크기는 약 500bp입니다. 의도된 결실은 273 bp에 걸쳐 있기 때문에, 돌연변이 생성물은 약 230 bp가 될 것으로 예상된다. 이 크기 범위는 모세관 겔 전기 동에 의한 간단하고 신속한 단편 분석을 가능하게 합니다. 총 160개의 초기 세포 풀을 스크리션하고 14개는 적어도 70%의 돌연변이 수준으로 예상되는 삭제를 운반하는 것으로 나타났습니다. 그런 다음 이중 탈설을 베어링하는 클론을 식별하기 위해 추가 직렬 희석을 위해 5개의 풀을 선택했습니다. 돌연변이 제품의 다른 수준을 가진 세포 클론에서 대표적인 전기 전형은 그림 2A에도시되어 있습니다. 삭제의 동일은 Sanger 시퀀싱에 의해 확인되었다(그림2B). 예상대로, DSBs33의 비상동성 말단 결합 수리에 의해 형성된 인델은 결실 클론에서 예측된 절단 부위에서 관찰되었다. 이들은 또한 모세관 전기 동공에 의해 검출될 수 있던 다양한 크기의 돌연변이 제품의 증폭 귀착되었습니다 (그림2A).
RUNX1 유전자는 2개의 프로모터즉 원위 P1 및 근위 P2를 포함하며, 이는 소음기 원소(34)를 포함하는 큰 인트론에 의해 분리된다. P1에 의한 RUNX1c및 RUNX1a및 RUNX1b에 의한 P234의3가지 주요 mRNA 전사체가 이러한 프로모터에 의해 생성된다. RUNX1c 및 RUNX1b의 뉴클레오티드 서열은 특이적인 TaqMan 유전자 발현 분석이 설계될 수 있는 독특한 N-말단을 가지는 것을 제외하고는 동일하다(도3A). RUNX1b를측정하기 위해 RUNX1b와 RUNX1c을 모두 인식하는 TaqMan 분석기를 사용했습니다(그림3A). 그런 다음 RUNX1b 레벨을 RUNX1c에서 총 RUNX1b/RUNX1c를 빼서 결정했습니다. RUNX1a는 대체 접합으로 인해 뚜렷하게 더 짧은 이소폼이며 특정 TaqMan 분석이 이 변이체에 대해 사용할 수 있다(도3A). 따라서, P1 및 P2 프로모터의 활성은 개별적으로 결정될 수 있다. 실시간 정량적 RT-PCR은 소음기 요소의 삭제가 P1-및 P2 유래 전사체 모두의 발현 수준을 현저하게 상승시키는 것으로 나타났다(도3B).
그림 1 : RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하는 전략. 상기 소음기(red box)는 두 프로모터 P1 및 P2를 분리하는 RUNX1 유전자의 제1 인트론에 위치한다(hg19 좌표가 도시됨). 2개의 crRNA (crRNA-1 및 crRNA-2)는 소음기 요소를 측면에 DSBs를 소개하도록 디자인되었습니다. 예측된 Cas9 분열 사이트는 세로 빨간색 선으로 표시되고 PAM 사이트(NGG)는 보라색으로 표시됩니다. 삭제의 스크리닝에 사용되는 두 프라이머는 열린 화살표로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 삭제 클론식별. (A) 돌연변이 PCR 제품 (MUT)의 상이한 수준을 나타내는 세포 클론의 대표적인 전기 전보. 돌연변이 제품의 크기는 분열 부위에 형성된 인델 때문에 클론간에 다양합니다. WT = 와일드 타입. (B) Sanger 시퀀싱에 의한 대표 클론의 삭제 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 소음기 삭제의 기능적 결과. (A) 3개의 주요 RUNX1 아이소폼(RUNX1a, RUNX1b 및 RUNX1c)이 표시됩니다. 이들 변이체는 동일한 Runt DNA 결합 도메인을 포함하지만 다른 N-(주황색) 또는 C-종단(파란색)을 함유한다. TaqMan 프로브/프라이머 쌍의 위치는 빨간색 선으로 표시됩니다. 숫자는 아미노산 잔류물을 나타냅니다. (B) RUNX1 P1- 및 P2 유래 전사체의 실시간 정량적 RT-PCR 분석은 (DEL) 또는 없이(WT) 이중 알릴체 결실(18)을 가진 세포 집단에서의 전사체이다. GAPDH는 정규화를 위해 사용되었다. * 및 ** 는 Mann-Whitney 테스트에 의해 각각 P < 0.05 및 P < 0.01을 나타냅니다. 이 수치는 청 외18에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
CRISPR/Cas9 시스템은 유전자 녹아웃 및 노크인 연구35,36,전사 조절37,38,다양한 유전 공학 과 같은 광범위한 게놈 편집 응용 분야에서 사용되어 왔다. 모델 유기체39,40,41,42,43,44 및유전자 치료45,46. 여기에서는 RUNX1 유전자에 대한 내향성 소음기를 삭제하는 기능적 결과를 조사하기 위해 CRISPR/Cas9의 사용을 입증합니다. 우리의 접근에 있는 CRISPR 분대의 납품은 plasmid DNA, gRNA 또는 바이러스의 복제 그러나 미리 조립된 Cas9/gRNA RNP 복합체의 전기 천공에 의존하지 않았습니다. 외인성 DNA의 사용은 숙주 게놈에 외래 벡터 서열의 바람직하지 않은 통합과 연관될 수 있는 것으로 나타났으며, 독성 및 저효율25,47,48,반면에 바이러스 변환 방법은 시간이 많이 걸립니다. 또한, 플라스미드 DNA로부터 Cas9의 장기간 발현은 오프 타겟 효과를 증가시킬 수 있다48. 반대로, 직접 RNP 기반 전달 접근법은 향상된 편집 효율성, 선택성 및 세포 생존율로 빠르고 간단하기 때문에 바람직한 방법으로 확립되었다. 실제로, 지질 49,50,전기 천공25,51,나노 입자52,세포 관통 펩티드53,iTOP54 및 TRIAMF와 같은 다양한 방법 55 는 다양한 세포 유형뿐만 아니라 동물 및 식물 종24,25,26,56,57로 효율적인 CRISPR / Cas9 전달을 위해 개발되었습니다. , 58세 , 59세 , 60 , 61세 , 62세 , 63. 비 코딩 DNA 서열은 유전 적 변이64의핫스팟이기 때문에 표적 및 인접 PAM 서열에서 일반적인 SP / 인델의 존재를 확인하는 것은 규제를 대상으로 하는 gRNA를 설계 할 때 특히 관련이 있습니다. 요소.
CRISPR/Cas9 게놈 편집에 있는 병목 현상은 견본의 다수에 있는 원하는 돌연변이 클론의 검열을 관련시킵니다. 표적 돌연변이가 약 300 bp의 작은 게놈 결실이기 때문에 우리는 모세관 겔 전기동동아와 결합된 형광 PCR을 스크리닝하였다. 이 방법은 빠르고 민감하며 처리량이 높은 방식으로 수행할 수 있습니다. 또한 이 방법을 사용하면 돌연변이 수준과 삭제 크기를 동시에 정확하게 추정할 수 있습니다. 또한, 상이한 형광 염료로 표지된 PCR 단편의 다중 분석이 지원된다. 우리는 골수성 신 생물65,66에있는 작은 삽입/삭제를 유전자형하기 위하여 이 기술을 일상적으로 이용하고 있습니다 . 우리의 경험에서, 우리는 지속적으로 ~ ~ 3 %까지 높은 정밀도와 돌연변이 부담으로 4 bp에 의해 다른 조각 크기를 감지 할 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 1,200 bp의 단편 크기 한계를 가지므로, 따라서 큰 삭제의 스크리닝에 적합하지 않다는 점에 유의해야 한다. 또한 기본 치환(변경되지 않은 조각 크기로 생성)과 다른 게놈 영역에서의 잠재적인 오프 타겟 이벤트를 감지할 수 없습니다. 후자의 경우, 표적 클론의 글로벌 바람직하지 않은 변화를 포괄적으로 프로파일링하기 위해 비용이 많이 드는 전체 게놈 시퀀싱이 필요합니다. 큰 비코딩 규제 서열 (>1,000 bp)의 조사를 위한 우리의 현재 접근을 채택하기 위하여는, 시험관 내 리포터 유전자 분석을 사용하여 putative 전사 인자 결합 사이트의 상세한 결실 및 돌연변이 분석이 수행될 수 있습니다 사전에 CRISPR/Cas9 편집18에대한 최소 기능 영역을 설명합니다.
많은 유전자가 하나 이상의프로모터 3,4를함유하고 있기 때문에, 조절 기소가 조절되는 요소를 조작하는 것이 프로모터에 차등적으로 영향을 미칠 수 있으므로 표적 유전자 궤적에서 대체 프로모터의 존재를 인식하는 것이 중요하다. 따라서, 상이한 프로모터로부터 유래된 전사체 변이체는 임의의 프로모터 특이적 반응을 평가하기 위해 개별적으로 측정될 필요가 있다. TaqMan 프로브 기반 분석법의 사용은 더 나은 특이성 및 재현성 때문에 SYBR 녹색보다 선호됩니다. 고급 디지털 PCR 시스템을 사용할 수 있는 경우 표준 곡선 구성 없이도 전사체 정량화를 보다 정확하게 수행할 수 있습니다.
암 세포주에서 CRISPR/Cas9 실험을 수행하는 데 중요한 고려 사항은 구조 및 카피 수 변이를 포함한 유전적 변화를 항구하는 거의 모든 암 세포주로 사용되는 세포의 계략 및 표적 유전자 카피 수입니다. 우리의 경우에, OCI-AML3에는 45 50 염색체를 가진 hyperdiploid karyotype가 있습니다. 또한, 세포주 18에서 암 세포주 백과사전67 및 형광에서 밝혀진 바와 같이 정상적인 RUNX1 카피 번호를전달하는 것으로 나타났다. 카피 수 이득을 가진 유전자를 표적으로 할 때, 전달 방법은 편집을 위한 CRISPR 성분의 충분한 수준을 제공하기 위하여 최적화될 필요가 있을 수 있습니다. 또한 전체 녹아웃을 식별하려면 더 많은 클론을 선별해야 할 수 있습니다. 중요한 것은, 증폭된 게놈 지구, 특히 구조적인 재배열에 기인한 그 표적화는, 암세포에 있는 유전자 독립적인 항증식성 반응을 시작할 수 있다는 것을 보여주었습니다, 유전자에 있는 거짓 양성 결과로 이끌어 내는 기능 연구68,69,70. 이와 관련하여, RNA 간섭 (RNAi) 녹다운 및/ 또는 cDNA 과발현과 같은 대체 접근법은 CRISPR 사실 인정을 확인하기 위하여 이용되어야 합니다. 또한, 다중 세포주 세포주 세포주 특이적 그러나 유전자 독립적인 CRISPR 편집 효력의 오해를 피하기 위하여 이용되어야 합니다.
CRISPR/Cas9 시스템은 게놈 편집에 대한 간단하고 효율적인 수단을 제공함으로써 기본 및 번역 연구에 혁명을 일으켰습니다. 여기에서 우리는 CRISPR/Cas9를 사용하여 암 세포주에서 전사 연구를 위한 내향적 소음기를 방해하는 용이성을 보여줍니다. 이 기술은 DNA 수준에 있는 CREs의 연구 결과 허용하고 전통적인 이종 기자 유전자 보다는 오히려 내인성 맥락에서 CRE 기능을 검토하는 기회를 제안합니다. 최근, CRISPR 기반 RNA 편집 시스템은또한 71으로 확인되었으며 규제 요소로부터 전사된 RNA를 표적으로 하여 CR을 연구하는 새로운 도구로 작용할 수 있다. 염색체 형태 포획 기술과 결합함으로써 CRISPR/Cas9는 다양한 건강 문제와 연결된 변경된 게놈 조직 및 유전자 발현에서 CR의 개입을 해독하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 OCI-AML3 세포주 제공을 위한 M.D. 민든 교수 (공주 마가렛 암 센터, 대학 건강 네트워크, 토론토, 캐나다)에게 감사하고 싶습니다. 또한, 저자는 암 유전체학 및 병리학의 핵심 유틸리티 (홍콩의 중국 대학)가이 연구를 지원하는 시설과 지원을 제공한 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 cm gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
| 1×TE buffer, pH 7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| 3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
| 7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
| 7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
| Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
| ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
| crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
| crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
| Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| PBS, 10x Solution, pH 7.4 | Affymetrix | 75889 | |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
| RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
| RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
| RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
| RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
| tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |
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