Denne protokollen beskriver en ny fargemetrisk metode for påvisning av antimalariamidler primaquine (PMQ) i syntetiske urinen og humant serum.
Primaquine (PMQ), en viktig anti-malarial narkotika, har blitt anbefalt av verdenshelseorganisasjon (WHO) for behandling av livstruende infeksjoner forårsaket av P. vivax og ovale. Men, PMQ har uønskede bivirkninger som fører til akutt hemolyse hos pasienter med glukose-6-fosfat dehydrogenase (G6PD) mangel. Det er behov for å utvikle enkle og pålitelige metoder for PMQ besluttsomhet med det formål å dosering overvåking. I begynnelsen av 2019-tiden har vi rapportert en UV-Vis og en naken-øye-basert tilnærming for PMQ-metrisk kvantifisering. Oppdagelsen var basert på en Griess-lignende reaksjonen imellom PMQ og aniliner, hvilke kanne utvikle farget AZO produktene. Deteksjons grensen for direkte måling av PMQ i syntetisk urin er i nanomolar området. Videre har denne metoden vist stort potensiale for PMQ kvantifisering fra humane serumprøver ved klinisk relevante konsentrasjoner. I denne protokollen vil vi beskrive de tekniske detaljene om synteser og karakterisering av fargede AZO produkter, reagens forberedelsen og prosedyrene for PMQ bestemmelse.
PMQ er en av de viktigste antimalariamidler narkotika, det fungerer ikke bare som en vev schizontocide for å hindre tilbakefall, men også som en gametocytocide å avbryte sykdom overføring1,2,3,4. Intravaskulær hemolyse er en av de om bivirkninger av PMQ, som blir svært alvorlig i de mangelfull i G6PD. Det er kjent at G6PD genetiske uorden er distribuert over hele verden med en gen frekvens mellom 3-30% i malaria endemiske områder. Alvorlighetsgraden av PMQ svakhet avhenger av graden av G6PD mangel samt dose og varigheten av PMQ eksponering5,6. For å redusere risikoen, WHO har anbefalt en enkelt lav dose (0,25 mg base/kg) av PMQ for malaria behandling. Men dette er fortsatt utfordret av variasjoner i pasientens medikament følsomhet5,7. Dose overvåkning er nødvendig for å vurdere farmakokinetikken etter PMQ-administrasjon, som kan påvirke Dosejustering for en vellykket behandling med begrenset toksisitet.
Høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) er den mest brukte teknikken for PMQ klinisk bestemmelse. Endoh et al. rapporterte et HPLC-system med en UV-detektor for serum PMQ kvantifisering ved hjelp av en C-18 polymer gel kolonne8. I deres system ble serumproteiner først utløst med acetonitril, og deretter PMQ i supernatanten ble separert for HPLC. Kalibreringskurven var lineær over konsentrasjons området fra 0,01 til 1,0 μg/mL8. En annen metode basert på en omvendt fase HPLC med UV-deteksjon ved 254 NM er rapportert for kvantifisering av PMQ og dens viktigste metabolitter9. Kalibreringskurven for PMQ var lineær i området mellom 0.025-100 μg/mL. En ekstra væske-væske ekstraksjon med blandede Heksan og etanol acetate som organiske fase ble brukt for PMQ separasjon med prosentvis gjenvinning nådd 89%9. Mer nylig utviklet Miranda et al. en UPLC-metode med UV-deteksjon ved 260 NM for PMQ-analyse i tablett formuleringer med en deteksjonsgrense på 3 μg/mL10.
Selv om HPLC metoder viser lovende følsomhet i narkotika bestemmelse og følsomheten kan forbedres ytterligere hvis HPLC er utstyrt med en masse spektrometer, er det fortsatt noen ulemper. Direkte narkotika målinger i biologiske væsker er vanligvis utilgjengelige for HPLC, ettersom mange biomolekyler i stor grad kan påvirke analysen. Ytterligere utdrag er nødvendig for å fjerne endogene molekyler før HPLC analyse11,12. Videre er PMQ deteksjon av en HPLC-UV-detektor vanligvis utført på sin maksimale absorpsjon bølgelengde (260 NM).; Det er imidlertid mange endogene molekyler i biologiske væsker med en sterk absorbansen på 260 NM (f. eks, aminosyrer, vitaminer, nukleinsyre syrer og urochrome pigmenter), og dermed forstyrrer PMQ UV-deteksjon. Det er behov for å utvikle enkle og kostnadseffektive metoder for PMQ bestemmelse med rimelig følsomhet og selektivitet.
Den Griess reaksjonen ble først presentert i 1879 som en metrisk test for nitritt deteksjon13,14,15,16. Nylig har denne reaksjonen blitt grundig utforsket for å oppdage ikke bare nitritt, men også andre biologisk relevante molekyler17,18,19,20. Vi har tidligere rapportert den første systematiske studien av en uventet Griess reaksjon med PMQ (figur 1). I dette systemet, PMQ er i stand til å danne fargede AZOS når kombinert med erstattet aniliner i nærvær av nitritt ioner under Sure forhold. Vi har videre funnet at fargen på AZOS varierte fra gult til blått når du øker elektron donerer effekten av substituent på aniliner21. En UV-Vis absorpsjon basert fargemetrisk metode for PMQ kvantifisering har blitt utviklet gjennom den optimaliserte reaksjonen mellom 4-methoxyaniline og PMQ. Denne metoden har vist stort potensiale for sensitiv og selektiv påvisning av PMQ i bio-relevante væsker. Her har vi som mål å beskrive de detaljerte prosedyrene for PMQ bestemmelse basert på denne farge metriske strategien.
Vi beskrev et fargemetrisk metode for praktisk PMQ kvantifisering. Det er potensielt den mest enkle og kostnadseffektive gjeldende metoden. Enda viktigere, denne metoden tilbyr muliggjør nakne øyne basert PMQ måling uten å bruke noe utstyr.
Den optimaliserte Griess-reaksjonen for PMQ-deteksjon kan generere en rød farge AZO med maksimal absorpsjon ved 504 NM. Den potensielle påvirkningen fra UV-Vis absorpsjon av endogene biomolekyler er begrenset, og dermed gjør metoden lovende for direk…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner oppstart Grant fra Guangzhou University of Chinese Medicine og ungdom vitenskapelig forskning trening prosjektet GZUCM (2019QNPY06). Vi erkjenner også Lingnan Medical Research Center ved Guangzhou University of Chinese Medicine for støtte på fasiliteter.
4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |