Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering af specifikke neuron populationer fra rundorm Caenorhabditis elegans

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/60145
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

Summary

Her præsenterer vi en protokol for enkel isolering af specifikke grupper af levende neuronal celler, der udtrykker grønt fluorescerende protein fra transgene Caenorhabditis elegans linjer. Denne metode muliggør en række ex vivo-undersøgelser med fokus på specifikke neuroner og har kapacitet til at isolere celler til yderligere kort tids dyrkning.

Abstract

Under aldringsprocessen, mange celler ophobes høje niveauer af skader, der fører til cellulære dysfunktion, som ligger til grund for mange geriatriske og patologiske forhold. Post-mitotiske neuroner repræsenterer en større celletype påvirket af aldring. Selv om flere pattedyr modeller af neuronal aldring findes, de er udfordrende og dyre at etablere. Den rundorm caenorhabditis elegans er en kraftfuld model til at studere neuronal aldring, da disse dyr har kort levetid, en tilgængelig robust genetisk værktøjskasse, og godt katalogiseret nervesystem. Den metode, der præsenteres heri, giver mulighed for problemfri isolering af specifikke celler baseret på ekspression af et transgene grønt fluorescerende protein (GFP). Transgene dyre linjer, der udtrykker GFP under særskilte, celletype-specifikke initiativtagere er fordøjet for at fjerne den ydre neglebånd og forsigtigt mekanisk forstyrret til at producere gylle, der indeholder forskellige celletyper. De celler af interesse er derefter adskilt fra ikke-målceller gennem fluorescens-aktiverede celle sortering, eller ved anti-GFP-koblede magnetiske perler. De isolerede celler kan derefter dyrkes i en begrænset periode eller straks anvendes til celle specifikke ex vivo-analyser, såsom transkriptional analyse af realtids kvantitativ PCR. Således, denne protokol giver mulighed for hurtig og robust analyse af celle-specifikke reaktioner inden for forskellige neuronal populationer i C. elegans.

Introduction

I løbet af de sidste mange årtier, den metazoiske model organisme Caenorhabditis elegans har været et enormt aktiv i studiet af neuroner, neuronal kredsløb og dens rolle i fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, og aldrende-associerede neurodegenerative Sygdomme. Et unikt træk ved C. elegans er, at dyrene er gennemsigtige, hvilket gør det muligt for alle voksne somatiske cellernes afstamning at blive kortlagt1. C. elegans også havne håndterbare mængde af neuroner, fører til morfologi og tilslutningsmuligheder i nervesystemet er godt forstået2. Den invariant celle Lineage, kort levetid, og overflod af High-gennemløb genetiske værktøjer til rådighed for C. elegans gør det til en ideel model organisme til studiet af aldring inden for forskellige neuronal populationer.

Aldring af neuroner og neurodegenerative lidelser er komplekse, og hver lidelse har unikke patologiske signaturer forbundet med det. Men for mange af disse lidelser, såsom Parkinsons og Alzheimers sygdom, et fælles træk er den progressive belastning af misfoldede proteiner3,4,5. I begge disse sygdomme, misfoldes og aggregerer proteiner i cellen for at forårsage toksicitet, hvilket i sidste ende fører til celledød4,5. For korrekt aldring af neuroner, den homøostase af mitokondrier, mere specifikt protein homøostase, er vigtigt, som forstyrrelser og dyshomeostase kan føre til neurodegeneration6,7,8. Celler er udstyret med forskellige mekanismer til at opretholde protein homøostase, hvoraf den ene er den udfoldet proteinrespons (UPR) – en klassisk vej, hvor signaler fra endoplasmatiske reticulum (er) aktiverer intracellulære signal kaskader, hvilket fører til en transkriptional svar9. Beslægtet med denne UPRer, metazoans vise en lignende respons på tab af mitokondrie protein homøostase, den såkaldte mitokondrie UPR (UPRMT)7,8. C. elegans synes at være den mest basale organisme til at have en bekræftet og veldefineret UPRMT pathway7.

Funktionen/dysfunktion af specifikke neuronal populationer i et større netværk kan være vanskeligt at vurdere på grund af deres iboende konnektivitet og kompleksitet3. Men, der er ofte et behov for at studere særskilte neuronal populationer på grund af celletype-specifikke sygdomme med komplekse patologier, såsom dem forbundet med nedsat cellulære protein homøostase. I C. elegans, specifikke neuronal populationer kan genetisk manipuleret giver mulighed for facile observation in vivo. Nervesystemet af C. elegans består primært af neuroner, med en lille procentdel af gliale celler. I voksne hermafrodit orme, der er ca 302 neuroner, opdelt i over 100 forskellige klasser2,10. Neuroner som kolinerge neuroner dominerer i neuromuskulære vejkryds, mens dopaminerge neuroner primært er involveret i sensation10,11. Da både motorisk aktivitet og sensoriske evner falder med alderen, er det vigtigt at detaljeret mekanistisk indsigt om defekter i disse individuelle neuroner11,12. Der er derfor behov for en enkel og robust metode til isolering af intakte celler af interesse for efterfølgende ex vivo-undersøgelser.

Her beskriver vi en optimeret effektiv metode til hurtig isolering af specifikke neuronal celler, som udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) fra C. elegans. Denne isolationsmetode kan udføres på larve, Juvenile eller voksne orme. Isolering af celler fra larve Worms blev tidligere udgivet af Zhang et al.13 og vil ikke blive diskuteret her. En vigtig bemærkning her er, at alle orme skal være på samme livstrin for at forhindre over fordøjelse af dyret eller kontaminering fra dyr i forskellige livsstadier. Gennem både enzymatisk og mekanisk afbrydelse af fyrretræsnematoden neglebånd, et Exoskelet højt i kollagen og andre strukturelle proteiner, kan en bred vifte af celler isoleres13,14. Cellerne kan derefter isoleres via flowcytometri eller antistof mærket magnetiske perler. Typisk er RNA isoleret via en phenol og guanidin isothiocyanat metode til at sikre berigelse af den ønskede cellepopulation15. Med megen omhu kan disse isolerede celler vedligeholdes i en dyrknings kolbe eller en multi-brønd skål. Denne metode repræsenterer et unikt og kraftfuldt værktøj i studiet af specifikke neuroner og har kapacitet til at isolere levende og funktionelle celler til yderligere dyrkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse og indsamling af gamle orme til celle isolation

Bemærk: forklaret nedenfor er isolering af kolinerge neuroner fra den transgene UNC-17:: gfp stamme (OH13083) opnået fra Caenorhabditis genetik Center (CGC) stamme repository på University of Minnesota. Det er bydende nødvendigt at opretholde sterile forhold for at forhindre kontaminering fra svampe eller bakterier.

  1. Forbered og Synkroniser orme via blegning metode som beskrevet af T. Stiernagle16. Til ældnings eksperimenter, plade orme på fyrretræsnematoden Growth medium (NGM) plader indeholdende 25 μM vand opløsning af fluorodeoxyuridine (FuDR) for at reducere ægproduktionen og arrestere ægklækning. Inspicér agarpladerne regelmæssigt for at undgå kontaminering eller ægklækning, da dette vil medføre upålidelige resultater.
    Bemærk: for UNC-17:: gfp-celler bruges typisk 3 100 mm x 15 mm NGM-plader til at isolere en tilstrækkelig mængde af celler af interesse16.
  2. Indsaml orme, og Forbered buffere til celle isolation.
    1. Der opsamles orme i et 15 mL konisk rør. Vask orme fra pladen med 1,5 mL M9 buffer (1 mM MgSO4, 85 mm nacl, 42 mm na2HPO4· 7H2O, 22 mm KH2Po, pH 7,0) og centrifuge i 5 min ved 1.600 x g. Kassér supernatanten og vask orme med 1 mL M9 buffer. Gentag Centrifugerings-og vask i alt fem gange for at fjerne så meget E. coli -kontaminering som muligt.
      Bemærk: tilsætning af antibiotika (50 μg/mL), såsom ampicillin, på dette trin kan medvirke til at reducere bakteriekontaminering.
    2. For to prøver, Forbered 2 mL natriumdodecyl sulfat-dithiothreitol (SDS-DTT) lysis buffer: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0), og 3% (w/v) saccharose.
    3. Der forberedes 15 mL isolations buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mmMGCL 2,25mm hepes [pH 7,3]) og opbevares på is.
      Bemærk: både SDS-DTT lysis-bufferen og isolations bufferen skal gøres friske før hvert eksperiment.
  3. Cutikel afbrydelse og enkelt celle isolation
    1. Centrifuge dyr opsamlet i trin 1.2.1 i 5 min ved 1.600 x g. Fjern alle supernatanten, og Afbryd orme i 1 mL M9-medie, og Overfør til 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
    2. Pellet orme med centrifugering ved 1.600 x g i 5 min.
    3. Tilsæt 200 μL SDS-DTT lysis-buffer til orme og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Orme bør synes at være "vinklet" langs kroppen, hvis de ses under et let mikroskop.
      Bemærk: langvarig udsættelse for SDS-DTT lysis buffer kan resultere i død af orme, som kan overvåges ved at observere orme. Orme, der er døde, vil forlænge og vil ikke krølle.
    4. Tilsæt 800 μl iskold isolations buffer og bland forsigtigt med at svirpe røret.
    5. Pellet orme i 1 min ved 13.000 x g ved 4 °c, Fjern supernatanten og vask med 1 ml isolations buffer.
    6. Gentag trin 1.3.5 i alt fem gange, og fjern forsigtigt isolations bufferen hver gang.
    7. Tilsæt 100 μL proteaseblanding fra Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabel over materialer) opløst i isolations buffer til pellet og Inkuber i 10 − 15 minutter ved rt.
      Bemærk: som med SDS-DTT lysis-bufferen kan den forlængede proteasefordøjelse resultere i overdreven spaltning af proteiner langs plasma membranen, hvilket forhindrer isolering af overflade eksponeret GFP via magnetiske perler.
    8. Under inkubation med proteaseblanding påføres mekanisk forstyrrelse ved pipette Rings prøver op og ned mod bunden af 1,5 mL mikrocentrifuge røret med en 200 μL mikropipette spids til ~ 60 − 70 gange. Hold pipettespidsen mod væggen af mikrocentrifuge røret med konstant tryk for at fjerne tilknytningen af cellerne korrekt.
    9. For at bestemme den fase af fordøjelsen, fjerne en lille volumen (~ 1 − 5 μL) af fordøjelsen blandingen, drop det på et glas slide og inspicere det ved hjælp af en vævskultur mikroskop. Efter 5 − 7 min inkubation bør orme fragmenter have synligt reduceret neglebånd, og en opslæmning af cellerne vil være let synlig.
    10. Stop reaktion med 900 μL af kommercielt tilgængelige kold Leibovitz s L-15 medium suppleret med 10% føtal bovin serum (FBS) og penicillin-streptomycin (endelig koncentration på 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL streptomycin).
    11. Pellet isolerede fragmenter og celler ved centrifugering i 5 min ved 10.000 x g ved 4 °c. Skyl de pelleterede celler med 1 mL kold L-15-suppleret medier to gange mere for at sikre, at overskydende snavs og neglebånd fjernes.
    12. Resuspendere pelleterede celler i 1 mL L-15-suppleret medier og lad på is i 30 min. Tag det øverste lag, ca. 700 − 800 μL, til et mikrocentrifuge glas. Dette lag indeholder celler uden cellerester og vil blive brugt i den efterfølgende isolering af celler af interesse.
    13. Følg producentens anvisninger, brug en automatiseret celle tæller eller hemocytometer til at målecelle tætheden på 10 − 25 μL af isolerede celler.

2. isolering af GFP-positive celler via flowcytometri eller anti-GFP magnetiske perler

Bemærk: der er to metoder, der kan implementeres for at isolere bestemte celletyper. Den første metode er at bruge fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS), mens den anden metode bruger antistof-konjugeret magnetiske perler til at samle celler, der udtrykker forskellige plasma membran-lokaliseret proteiner. Sidstnævnte metode kræver lokalisering af GFP til plasma membranen, således at den er tilgængelig for interaktion med den antistof-koblede magnetiske perle.

  1. Isolering af GFP-positive celler ved flow cytometri
    1. Fra isoleret cellesuspension indsamlet i trin 1.3.12, centrifuge celler i 5 min ved 10.000 x g ved 4 °c. Kassér supernatanten og suspendere pelleterede celler i L-15-suppleret medium til en celletæthed på højst 6 x 106 celler/ml for at undgå overbelastning af flow cytometer.
    2. Sorter celler efter GFP-positivt udtryk ved hjælp af et flow-flowcytometer, der kan sortere prøver. GFP-negative celler kan bruges som et kontrolelement for ikke-celletype specifik analyse.
      Bemærk: som nævnt ovenfor kan der anvendes en alternativ metode til isolering af GFP-positive celler, hvis det GFP-mærkede protein af interesse er lokaliseret til cellernes plasma membran. I dette tilfælde kan den protokol, der er beskrevet i afsnit 2,2, anvendes.
  2. Isolering af GFP-positive celler via anti-GFP magnetiske perler
    1. Fra isoleret cellesuspension indsamlet i trin 1.3.12, centrifuge celler i 5 min ved 10.000 x g ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og cellerne suspenderes i 485 μL L-15-suppleret medium. Tilsæt 15 μL ddH2O forvasket α-gfp-antistof-koblede magnetiske perler til opløsningen.
    2. Inkuber celler med den magnetiske perle gylle ved 4 °C i 1 time med meget blid drejning. Overdreven drejning vil beskadige cellerne.
    3. Efter inkubation udtages centrifuge prøven i 5 minutter ved 10.000 x g ved 4 °c, hvorefter man vasker pellet 2x med 1 ml L-15-suppleret medium for at fjerne gfp-negative celler.
  3. Dyrkning af isolerede celler
    1. Plade isolerede celler i en steril 6-brønd multi-brønd plade.
      Bemærk: disse plader kan være belagt med jordnødde lektin at øge celle fastgørelse; Hvis cellerne skal anvendes med det samme, kan der dog ses bort fra dette trin.
    2. Læg pladen i en plastikbeholder, og Inkuber cellerne ved 20 °C med en fugtig serviet eller blødt serviet papir (Tilsæt 50 μg/mL ampicillin til ddH2O for at sikre, at der ikke er nogen bakterievækst ved aftørring) for at tilføre fugt til cellerne. Må ikke inkubere i en CO2 inkubator, som forhøjede Co2 niveauer kan beskadige cellerne.

3. fluorescerende billeddannelse af isolerede GFP-positive celler

  1. Tænd for den fluorescerende pære af et inverteret mikroskop med fluorescens fastgørelse og lad den varme op i ca. 10 minutter.
  2. Fjern cellekulturen fra inkubator og sæt på scenen af inverteret mikroskop med florescens fastgørelse. Skub GFP-filteret ind i rillerne under mikroskopet.
  3. Få vist cellerne med en forstørrelse på 50x. Med succes isolerede GFP-positive celler vil være let synlige. Tag billeder ved hjælp af kameraets fastgørelse på mikroskopet.

4. ekstraktion af RNA fra isolerede celler

Bemærk: ekstraktion af RNA skal udføres umiddelbart efter celle isolation for at sikre høj kvalitet af materiale. Isoleret RNA kan anvendes til fremstilling af cDNA og efterfølgende måling af transskriptions niveauer ved kvantitativ PCR (qPCR). Alle rør, spidser og reagenser skal være RNase-fri, og arbejdsområdet skal være ethanol-vasket før RNA-ekstraktion.

  1. Fra isolerede celler indsamlet ved trin 2.1.2, centrifuge celler i en 1,5 mL steril, RNase-fri mikrocentrifuge tubefor 5 min ved 10.000 x g ved 4 °c. Hvis cellerne isoleres via magnetiske perler, Følg celle indsamlingen som anført ovenfor.
  2. Brug en mikropipette til at fjerne supernatanten fra centrifugeret mikrocentrifuge slange og tilsæt 100 μL M9 medium til at vaske væk L-15-suppleret medium. Centrifuge cellerne 5 min ved 10.000 x g ved 4 °c og Fjern supernatanten. For at sikre, at alle medier fjernes, gentages for i alt tre skyller forsigtigt at fjerne supernatanten hver gang.
  3. Tilsæt 1 mL phenol og guanidin isothiocyanatopløsning (tabel over materialer) til cellerne, og afpipettér suspensionen op og ned omhyggeligt. Blandingen inkubates ved RT i 5 min.
  4. Efter inkubation tilsættes 250 phenol og guanidin isothiocyanat opløsning
  5. Opløsningen centrifugeres i 5 min. ved 10.000 x g ved 25 °c.
  6. Fjern forsigtigt så meget af det øverste vandige lag med en mikropipette som muligt uden at forstyrre de nederste organiske lag, og overfør det nederste lag til et nyt 1,5 mL RNase-frit mikrocentrifuge glas. Til det nye rør tilsættes 500 μL isopropanol og blandes ved at invertere røret. Denne opløsning inkubates ved RT i 5 min.
  7. Centrifugeglasset centrifugeres ved 14.000 x g i 20 minutter ved 25 °c.
  8. Mens prøverne holdes på isen, fjernes så meget isopropanol som muligt med en mikropipette, og tilsæt forsigtigt 1 mL 70% (v/v) ethanol i RNase-fri ddH2O til røret. Sørg for ikke at skubbe opløsningen ud direkte på bunden af røret; Påfør ethanol/vand blanding til siden af røret.
  9. Centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter ved 25 °c.
  10. Fjern det meste af ethanol og luft tørt på is i 3 − 5 minutter.
    Bemærk: ethanol bør fjernes efter dette trin; men omhyggelig inspektion af bunden af røret er vigtigt at sikre, at ingen ethanol er tilbage.
  11. Når røret er lufttørret, tilsættes 15 − 20 μL RNase-fri ddH2O og mål RNA-koncentration og renhed ved hjælp af et spektrofotometer ved 260 nm bølgelængde. Prøvens renhed skal måles som et 260 nm/280 Nm-forhold. Dette forhold bør være ca. > 2.
    Bemærk: isoleret RNA kan fryses og opbevares ved-20 °C. Det er dog meget præference at bruge et cDNA syntese kit så hurtigt som muligt for at sikre høj kvalitet cDNA produktion. Kvantitativ PCR kan følge ved hjælp af anvisninger fra producenten af termo cycleren, der anvendes i laboratoriet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for specifik isolering af UNC-17:: gfp-positive kolinerge neuroner fra rundorm C. elegans til efterfølgende ex vivo-undersøgelser såsom celletype-specifikke genekspressions profilering og eventuel kortsigtet dyrkning for patch-clamp Elektrofysiologi målinger.

Figur 1 viser UNC-17:: gfp-positive kolinerge neuroner i deres normale indstilling. UNC-17 genet udtrykkes i hele C. elegans krop og koder for en vesikulær acetylcholin transmembran transporter17. Udtrykket af dette gen kan observeres i hoved, midbody, og hale neuroner og neuron projektioner.

Figur 2a viser en billedoversigt over neuron-isolations proceduren, der er skitseret i afsnittet metoder. Trin et er at synkronisere og kultur orme. Derudover viser figur 2b repræsentative fluorescens mikrografer af UNC-17:: gfp-positive neuroner efter isolation samt respektive negative kontrol fra umodificerede N2 vilde type dyr. Isolerede celler kan holde sig i live op til 3 dage, når de suppleres med Leibovitz s L-15 medium og 10% FBS.

Figur 3 viser repræsentative data for qPCR fra gfp, som udtrykker kolinerge neuroner samt gfp-udtrykker muskelceller. Efter en vellykket sortering af cellerne ved hver metode blev RNA isoleret via en phenol-og guanidin isothiocyanatmetode, hvorefter cDNA blev fremstillet ved hjælp af et syntese kit. Ekspression af kolinerge neuron-specifikke gener, tph-1 og SNB-1, en tryptophan hydroxylase og synaptisk vesikelprotein transporter, henholdsvis, er forhøjet i UNC-17::gfp isolerede celler, men er ikke til stede i MYO-3::gfp isolerede celler. Det omvendte er sandt med udtrykket af den muskel-specifikke myosin tunge kæde afskrift af MYO-2. Ekspression af sidstnævnte gen er begrænset til isolerede Muskelceller, men ikke de isolerede kolinerge celler.

Figure 1
Figur 1: rekonstrueret billede af kolinerge neuroner i en-dag-gammel vildtype transgene dyr, som udtrykker UNC-17:: gfp reporter. Billedet blev samlet fra fire separate konfokale fluorescensbilleder af samme orm, der dækkede hele dyrets længde. Skala bjælken for hvert enkelt billede er 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: arbejdsgang for celle isolering og repræsentative GFP-udtrykker celler isoleret fra UNC-17::gfp stamme. (A) skematisk workflow skildring for isolering af specifikke cellepopulationer beriget i UNC-17:: gfp-udtrykker kolinerge neuroner fra respektive C. elegans transgene stammer. B) repræsentative fluorescensbilleder, der viser tilstedeværelsen af gfp-signal i de isolerede UNC-17:: gfp-positive celler. Bemærk, at billedet viser et enkelt brændplan. Skala bjælke = 10 μm. Figur 2B er gengivet med tilladelse fra Journal of Cell Science og er blevet offentliggjort af Tyskland et al.12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentativ qPCR analyse af UNC-17-neuron specifikke markører (tph-1, UNC-47 og SNB-1) i hele-dyr versus UNC-17:: gfp reporter celle isolater bekræfter specifik berigelse af kolinerge neuroner af interesse. Yderligere negative kontroller, der anvendes her var MYO-3:: gfp reporter-udtrykker muskelceller, som var blevet isoleret efter den samme protokol. Data viser middelværdier ± SD (n = 3 biologiske replikater). * p < 0,05; * * p < 0,01; p < 0,001 ved parvis t -test. Dette tal er blevet ændret fra Tyskland et al.12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rundorm C. elegans er en veletableret og kraftfuld model til at studere neuronal sundhed og sygdom2. Med rigelig genetiske værktøjer til at manipulere disse dyr og håndterbare mængde af præcist kortlagt forskellige neuron typer, en stor del af data kan indsamles med en relativt lille mængde materiale. Her skitserer vi en optimeret metode til at isolere forskellige neuroner fra hele dyr. Ved at forstyrre ormen ydre neglebånd proteiner, en gylle af forskellige celletyper kan isoleres, herunder neuroner og muskuløse celler5. Disse isolerede celler kan bruges i en lang række unikke eksperimenter. Evnen til at bruge enten celle sortering gennem flow cytometri eller antistof-mærkede magnetiske perler giver mulighed for en adaptiv teknik afhængig af parametrene for specifikke eksperiment. Udvinding RNA fra en bestemt C. elegans celletype giver også mulighed for en mere grundig undersøgelse og en mekanistisk forståelse af forskellige cellulære processer.

Der er her tale om kritiske trin, som skal følges nøje: 1) ældning og høst af velnærede orme fra 25 μM FuDR-plader; 2) tid i SDS-DTT inkubation eller behandling med proteaseblanding; 3) udvælgelse af GFP-positive celler. For det første, under ældning af orme, er det bydende nødvendigt at være flittig til at sikre, at eventuelle æg lagt ikke klækkes, da dette vil forårsage alder heterogenitet i de indsamlede orme, forårsager betydelig variation i data. Vask trin ved høst af orme til isolation er også nødvendigt for at sikre, at eventuelle døde eller umodne dyr ikke indsamles. For det andet kan overdreven inkubation af orme i SDS-DTT-bufferen forårsage uønsket nedbrydning af vigtige cellulære komponenter og toksicitet for orme, hvilket forhindrer isolering af målcelle typer. Opretholdelse af cellelevedygtighed er afgørende for en vellykket RNA-ekstraktion fra eller yderligere kortsigtet dyrkning af isolerede celler. Fordi størstedelen af neuronal celler er sarte, overdrevent barske behandling under enten SDS-DTT buffer eller proteaseblandingen behandling kan resultere i massive skader på disse celler. Hvis en stress reaktions pathway er målet for forsøget, kan forholdene for inkubationer ændres en smule, da den meget reduktive effekt af DTT kan forårsage øget ekspression af visse stress respons gener. I dette tilfælde er det vigtigt at kunne vaske celle piller med L-15-suppleret medium til at standse reaktionen og hurtigt re-forsyne cellerne med næringsstoffer. Endelig skal du omhyggeligt vælge, hvilket valg trin der passer bedst til celle typen af interesse, vil give mulighed for maksimal genopretning af disse celler. Ligeledes, overvejer cellulære lokalisering af celletype-specifikke markører kan hjælpe forskerne vælge den mest optimale celle berigelse tilgang. Ved hjælp af flow cytometri vil give en mere homogen og levedygtig cellekultur, mens brug af anti-GFP magnetiske perler er mindre tidskrævende og arbejdskrævende.

Det er vigtigt at bemærke, at den metode, der er beskrevet her, har nogle begrænsninger. For det første bør robust ekspression af GFP i de ønskede celletyper verificeres for at sikre passende isolering af FACER eller antistofkoblede magnetiske perler. For det andet, selv blid neglebånd afbrydelse kan føre til en dårlig udbytte eller endda tab af visse krops væggen celler, eller andre lav-overflod cellepopulationer såsom dat-1 dopaminerge neuroner. Når du vælger celletyper, den mere rigelige celletype kan normalt give en mere vellykket udbytte. Ikke desto mindre, denne metode kan bruges til isolering af mindre rigelige celletype populationer samt.

Sammenfattende, den procedure, som diskuteres i denne artikel præsenterer en effektiv metode til udvinding og isolering af individuelle celletyper fra rundorm C. elegans. Metoden er robust nok til at give mulighed for udvinding af RNA, og efterfølgende gen profilering, og følsom nok til at give mulighed for dyrkning af de isolerede celler. Selv om den nøjagtige metode, der anvendes til at isolere bestemte grupper af celler, kan variere mellem forskellige celletyper, er arbejdsprocessen beskrevet i denne rapport generelt effektiv og kan anvendes på stort set alle slags orme celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Jennifer Fox og medlemmerne af Khalimonchuk laboratorium for indsigtsfulde kommentarer. Vi anerkender den støtte fra de nationale institutter for sundhed (R01 GM108975 til O.K. og T32 GM107001-01A1 til E.M.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Fisher Scientific 12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade VWR A0930
CaCl2 Sigma C5670
Chloroform Sigma 496189
Contess Automated Cell Counter Invitrogen Z359629
DTT USBiological D8070
Ethanol Decon Labs 2701
FBS Omega Scientific FB-02
Fluorodeoxyuridine Sigma F0503
HEPES Sigma H3375
Isopropanol VWR BDH1133
KCl Amresco O395
KH2PO4 USBiological P5110
Kimwipes Kimberly-Clark Professionals 7552
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
MgCl2 Sigma M8266
MgSO4 USBiological M2090
Na2HPO4·7H2O USBiological S5199
NaCl VWR X190
NaOCl (Bleach) Clorox
NaOH Amresco O583
Penicillin-Streptomicen Fisher Scientific 15140122
Peptone Y USBiological P3306
Pronase E Sigma 7433 protease mixture from Streptomyces griseus
SDS Amresco O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope Tritech Research
Sucrose USBiological S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit ThermoFisher 12594025
TRIzol Invitrogen 15596026 phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain Invitrogen T10Z82
α-GFP magnetic beads MBL D153-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
  3. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
  4. Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
  5. Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
  6. Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
  7. Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
  8. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
  9. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  10. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
  11. Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
  12. Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
  13. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
  14. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
  15. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
  16. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
  17. Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).

Tags

Udviklingsmæssige biologi C. elegans celle isolation neuroner aldring neuronal markører grøn fluorescerende protein
Isolering af specifikke neuron populationer fra rundorm <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Germany, E. M., Zahayko, N.,… More

Germany, E. M., Zahayko, N., Khalimonchuk, O. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (150), e60145, doi:10.3791/60145 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter