Summary
该协议的目标是使用胚胎组织移植技术，从Cas9诱变的供体组织中提取单倍体前肢的嵌合体轴片。
Abstract
越来越多的基因技术和资源使研究人员能够探索某些种类的蜥蜴（如阿索洛特人）在成年后再生整个四肢的能力的分子起源。在这里，我们概述了用于生成具有Cas9诱变性单倍体前肢的嵌合轴球的技术，可用于探索基因功能和肢体再生的保真度。我们将多种胚胎学和遗传技术相结合，包括通过体外活化、CRISPR/Cas9诱变生成和组织移植到一个协议中，在再生模型生物体中产生单倍体遗传筛选的独特系统。这种策略减少了肢体再生中基因功能分析所需的动物数量、空间和时间。这也允许研究其他基本过程（如器官形成、组织形态生成和其他基本胚胎过程）可能需要的基因的再生特定功能。本文描述的方法是在脊椎动物模型系统中进行单倍体遗传筛选的独特平台。
Introduction
从历史上看，两栖动物的胚胎组织移植一直是探索发育生物学和再生的基本机制的重要技术。axolotl是一种蜥蜴，在受伤或截肢后，具有再生组织和复杂结构（如四肢和器官）的惊人能力。同样令人印象深刻的是，他们可以在胚胎期、幼年期和成人期1、2、3接受其他个体的组织移植，而不会被拒绝。产生整个结构的胚胎区域，如四肢、尾巴、眼睛和头部，以及更特定的组织，如神经切除和索米特，可以在胚胎之间移植，以产生嵌合动物1，2，4，5，6。近一个世纪以来，对这种嵌合动物的研究为再生、组织分化、尺寸控制和模式1、7、8提供了重要的见解。
在过去的十年里，许多再生组织的转录研究已经产生了对基础蜥蜴再生9，10，11，12，13的遗传程序的见解。这些研究增加了候选基因的扩大列表，迄今为止，这些基因在再生背景下基本上没有特征。靶向诱变技术，如CRISPR/Cas，现在允许研究这种基因，这种基因方法大大促进了大轴醇基因组14，15，16的最近测序和组装。
我们寻求开发将经典发育生物学与新的基因技术相结合的技术，以解剖再生机制。产生单倍体胚胎的方法已经建立了几十年。虽然这些技术一直被认为是作为遗传模型生物18的蜥蜴的优势，但随后的遗传研究很少纳入单倍体动物。我们使用体外活化在axolotl生产单倍体胚胎，作为组织捐赠者移植19。利用携带荧光遗传标记的胚胎，我们设计了可靠的方法来生成几乎完全来自供体组织的四肢（图1A）。通过结合这两种技术，我们绕过了与单倍体相关的晚期胚胎杀伤力，允许生产完全发育的、移植的单倍体四肢（图1B，图1B'和图2）。
通过在移植前在单倍体胚胎中进行CRISPR/Cas介导的诱变，以产生具有突变单倍体四肢的嵌合体轴片，我们可以在肢体发育和再生的背景下专门研究基因功能。这允许从潜在的胚胎致命变异表型中拯救四肢。虽然CRISPR/Cas显微注射可以产生高度突变的动物，这类动物通常是高度马赛克，在目标部位14、20上保留一定程度的野生型等位基因和各种不同的突变。单倍体细胞中基于CRISPR的诱变增加单等位基因丧失功能突变的渗透，因为它们不能被保留的野生型等位基因掩盖。因此，在单倍体细胞系中基于CRISPR的筛选越来越多地用于研究许多细胞过程21、22、23的遗传基础。通过将基于CRISPR的谱系追踪与我们的单倍体肢体芽移植方案相结合，本文描述的方法可以作为活动物中单倍体遗传屏幕的平台。
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Protocol
该协议中使用的实验程序由耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，2017–10557）批准，并符合所有联邦关于脊椎动物使用的政策和准则。所有动物实验都是在耶鲁大学的设施中对墨西哥的阿姆比托马（axolotls）进行的。
1. 双倍体胚胎生成
- 获得GFP®二倍体胚胎，作为移植宿主通过自然交配使用一个或两个gfp父母24。
- 收集新鲜铺设的二倍体鸡蛋，并将其放入金属筛中。
- 用 40% Holtfreter 溶液彻底冲洗鸡蛋（20 mM NaCl，0.2 mM KCl，0.8 mM NaHCO3，0.2 mM CaCl2，4mM MgSO4，pH到 7.4）。
- 将鸡蛋放入新鲜 40% Holtfreter 溶液中，并储存在 12°C。
注：在进入单倍体胚胎生成之前，应始终获得双倍体胚胎。
2. 单倍体胚胎生成
- 女性配药供体准备
- 48 h 进行体外激活前，通过在 40% 霍尔特弗雷特溶液25中浸入 1 g/L HEPES 缓冲 MS-222 中，麻醉性成熟的白色或白色/RFP 女性 axolotl。
- 确保动物在大约30分钟的浸泡后完全麻醉，在拇指和食指之间用力捏住尾巴。完全麻醉的动物不会身体反应任何捏。
- 制备含有10，000 U/mL的无菌盐水的人类性促性腺激素（HCG）溶液。
- 使用 30 G 胰岛素注射器，将 0.15 CC HCG（1，500 个单位）注射到麻醉女性后肢的肌肉背，角度为 45°，与脊髓接触。
- 将雌性返回到新鲜的 40% Holtfreter 溶液中，并放入 8~12 °C 的冰箱中。
- 48小时后，将雌性恢复到室温。将几块石头或塑料植物放在容器内作为产卵的表面。
注：注射HCG的女性在产卵前通常会将空果冻箱沉积几个小时。 - 在雌性开始持续产卵后，清除石头或塑料植物。
- 让女性在空水箱中坐30分钟至1小时。
注：为动物产卵的预扣材料将允许更严格地控制卵母细胞的收集。
- 男性游戏系列
- 当女性的卵子产卵停滞时，麻醉性成熟的GFP®雄性axolotl作为精子捐赠者，如步骤2.1.1。
- 将完全麻醉的男性放在湿纸巾上的解剖显微镜下。
- 如果实验者是右手，用右手将P1000移液器的尖端放在氯卡底部。
- 将左手食指和左手拇指2⁄3厘米的罗斯特放在骨盆上。轻轻挤压动物，同时将手指移向后腿，以冲洗精子尿样。
- 收集每个被冲出的氯卡到单独的微离心管。重复此过程以收集 6 到 10 个样本。
- 将5.0 μL从每个样品转移到培养皿上，使用倒置显微镜检查精子的质量。
注：浓缩精子样本为乳白色，通常范围为5至20μL，通常在提取多个体积较高的精子尿样后取回。精子将收集在管的底部在高体积样品，当离开不受干扰。健康精子的浓缩样本具有很强的可动性，随着浓度的降低而失去活性。健康的雄性可以产生高达50μL的浓缩精子。
- 女性游戏系列
- 获得并确认健康的精子样本后，如步骤2.1.1中所示，麻醉HCG注射的雌性异种乳液。
- 将完全麻醉的女性放在她背上的湿纸巾上。
- 使用类似于步骤 2.2.4 中的手运动从雌性中提取未受精的卵子。
- 收集鸡蛋使用湿钳，并转移到一个10厘米的培养皿。在收集后15分钟内用辐照精子处理卵子。
- 雄性配药制备和体外激活
- 使用 P10 或 P20 移液器上下移液，将团块分解，形成均匀的悬浮液。
- 通过将 0.5 μL 未稀释的精子悬浮液放在培养皿盖或玻璃滑块上，并用倒置显微镜检查，近似于动质精子的百分比。
- 添加 9.5 μL 的 0.1 倍 Marc 的改性环铃解决方案 （MMR;材料表）到这个样本，使20倍的精子稀释。轻轻上下移液以混合。
- 使用倒置显微镜，在培养皿盖或血液细胞计上，将20x稀释的等分液中的三个1.0μL滴计数，以估计未稀释悬浮液的精子浓度。
- 通过将原始精子样本的等分稀释至无菌 0.1x MMR 中约 80，000 个活动细胞/mL，准备精子进行辐照。
- 计算过去15分钟内获得的卵子数量。将新稀释的精子的0.5 μL从每个卵子步骤2.4.5添加到培养皿中。使用移液器尖端将此悬架铺入 1 mm 厚的层中。
- 使用塑料升降机，将样品从 254 nm 交联器的灯泡中取出 4 厘米。通过用800，000 uJ/mm2照射样本，使精子在基因上失去活性。
- 使用P10移液器，将悬浮液移至未受精的卵子上，给每个卵子涂上0.25~0.5 μL的辐照精子。让鸡蛋在室温下坐30分钟。
- 30分钟后，用0.1x MMR淹没鸡蛋。立即将卵子放入8~10°C培养箱中，第二天注射，或在激活后7小时内注射18°C（hpa）。
- 水化后30分钟使用锋利钳的Dejelly单倍体。立即将卵子放入8~10°C培养箱中，第二天注射，或在同一天在18°C注射。
3. 单倍体突变与维持
- CRISPR/Cas9显微注射
- 设计sgRNA使用CRISPRscan和合成26，27。
- 对于多倍诱变，制备5个sgRNA（每个sgRNA10纳克/μL）和Cas9蛋白（1微克/μL）的库存。准备100倍稀释这种股票（0.1纳克/μL每sgRNA，10纳克/μL Cas9）注射。对于单基因，高突变频率突变，遵循先前概述的协议28。
- 如果在18°C下储存，在单细胞阶段7 hpa注射单倍体胚胎;如果储存在8~10°C，则第二天在2~8细胞阶段注射单倍体胚胎。
- 将胚胎转移到1.0x MMR，用20%多糖400。
- 如果单个细胞，注入每个胚胎注射5 nL滴的注射溶液（大约1/4半径的鸡蛋），包含总质量为0.5 pg/sgRNA和50 pg Cas9蛋白质。如果多细胞，通过将较小的体积注入多个细胞来分配此质量。
- 让胚胎在聚糖400中愈合，至少4小时，在18°C时最多18小时。
- 单倍体胚胎外壳
- 将胚胎转移到0.1x MMR与抗生素抗菌。
- 将每个胚胎安置在24孔板的单独井中，因为有些人会死亡或发育异常。保持在16~18°C。如有必要，较低温度可用于延长发育。
- 每隔一天用新的 0.1x MMR 更换介质，使用抗生素抗菌药。
4. 双倍体宿主胚胎制备
- 将胚胎保存在12至16°C的果冻涂层中，直到其达到22至26阶段。
- 收集准备移植的胚胎，将它们放入筛子（4毫米网形大小），然后用40%的霍尔特弗雷特溶液轻轻冲洗。
- 将胚胎转移到过滤灭菌的0.1x MMR中，含有1.5%漂白剂长达2分钟。 完全浸入漂白液中的胚胎，轻轻旋转，以确保果冻涂层与漂白液完全接触，杀死微生物存在于胚胎上。
- 2分钟后，用相同体积的过滤灭菌0.1x MMR稀释含有胚胎的漂白液。
- 轻轻地将胚胎倒入漂白消毒筛（4 毫米网状大小），然后用过滤消毒的 0.1x MMR 冲洗胚胎五次。
- 将胚胎放入无菌的10厘米培养皿中，用0.1x MMR与抗生素进行脱脂（青霉素100单位/mL，链霉素100微克/μL，0.25微克/mL，温霉素25微克/mL）。
- 在荧光立体显微镜下，使用锋利的钳子（尖端尺寸0.05 x 0.01 mm2）从GFP®胚胎中取出果冻涂层和玻璃膜。
- 将GFP®胚胎转移到新的培养皿中。尽量减少从培养皿中转移的液体量。
- 用抗生素冲洗GFP®宿主胚胎4至6次，以去除污染物。
- 在移植前，将干净的胚胎放在4°C处过夜。
注：冷却胚胎使它们更刚性和更干净的分离的中生代从内皮是可行的。
5. 倍体-双体花生成
- 手术盘和介质准备
- 通过将 0.1x MMR 中的 2% 甘蔗甘油倒入无菌 35 mm 易握培养皿中，准备无菌手术盘。半路上装满角菜，用甘蔗。
- 在Agarose冷却后，使用无菌手术刀在Agarose中切开一个25毫米长的斜槽，将胚胎抱在原位。
- 用无菌手术介质填充盘中（0.1x MMR，使用抗支原体 2.5 μg/mL，五聚他素 B 0.25 μg/mL，以及西普洛沙星 10.0 μg/mL），并在 4°C 下冷藏。
- 胚胎移植程序
- 将一个健康的单倍体供体与一个或两个阶段匹配的GFP®二倍体宿主胚胎放在含有手术介质的预冷却手术盘的槽内（图3）。
注：如果可能，在冷却阶段（10°C 或更低）上执行该过程。 - 使用两个超精细的高压灭子（直尖，尖端尺寸 0.05 x 0.02 mm2） 从主机上去除外皮和中皮层，边缘芽靠近中心（图 4）。
注：矩形组织移植区域包括肢体芽，并沿前后轴从第九个索米特延伸到刺凸起的后半部分，约2毫米。沿着多索文拉尔轴，嫁接区域跨度约为1.5毫米，包括索米特，刚到刺凸起的腹边缘。移植区域包括所有侧板中代和索米特的侧半部分，没有干扰底层内皮。有关详细信息，请参阅图 4和随附的视频。 - 留出宿主组织，用同样的方法从单倍体捐赠者中取出同等大小的组织片。
- 将单倍体供体组织表放在供体胚胎的相应区域。
- 用高压灭的矩形玻璃碎片从粉碎的显微镜盖玻璃上覆盖组织，然后轻轻地将其压入宿主胚胎体，从而固定组织。
- 将单倍体供体胚胎翻转到另一侧，为第二宿主胚胎收获肢体芽。重复步骤 5.2.2 到 5.2.5。
- 小心地从培养皿中取出剩余的多余宿主组织和供体胚胎。
- 将带有玻璃碎片锚的移植物留在原位 60-75 分钟，每 20 分钟检查一次，以确保玻璃没有滑落。
- 组织移植完全粘附后，使用钳子慢慢剥去玻璃碎片锚。
- 将一个健康的单倍体供体与一个或两个阶段匹配的GFP®二倍体宿主胚胎放在含有手术介质的预冷却手术盘的槽内（图3）。
- 奇梅拉维护
- 将移植的胚胎转移到新的手术培养基中，并在8~12°C过夜愈合。在12或24孔板中单独植入胚胎。
- 36⁄48小时后，将移植的胚胎转移到无菌的0.1x MMR抗生素抗菌药。手术介质中的强抗生素在3天后引起移植胚胎的毒性。
- 每 2⁄3 天更换一次新鲜的 0.1x MMR 和抗生素。
- 将移植的胚胎保持在18°C，直到它们能够喂养28。
- 经过1至2个月的发育和护理，使用荧光解剖显微镜可以对单倍体肢体进行移植纯度评分。
注：四肢中存在非神经或非血液宿主衍生的GFP-组织是不纯移植的指标，通常与异常肢体发育有关。这些动物应该被排除在进一步分析之外。
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Representative Results
开发单倍体胚胎可以通过其"单倍体综合征"表型29来区分双倍体胚胎。在移植阶段，单倍体胚胎沿前后轴和蛋黄塞的不完全外壳表现出较低的曲率（图3A）。荧光显微镜可用于确保单倍体胚胎不含父系衍生的GFP表达（图3B）。
当移植物清洁时，GFP表达应主要限于从宿主脊髓衍生的神经网络胸膜丛，如图2所示。Punctate GFP表达也将存在于单个细胞中，这些细胞似乎是感觉神经元和血液衍生的宿主细胞，它们迁移到发育中的肢体。当使用RFP+捐赠者时，单倍体移植四肢将显示RFP的普遍表达（图1B'）。在整个发育过程中，非诱变单倍体四肢明显短于大小匹配的嵌合动物中相对的双倍体前肢（图1B，图1B'和图5，n= 16肢对， 单倍体均值 = 0.522 厘米，SD = 0.087 厘米，双倍体均值 = 0.667 厘米，SD = = 0.069 m，成对 T 测试 p 值 < 0.0001，平均比率 = 0.784，SD = = 0.113。非诱变单倍体四肢也完全再生（4/4倍体和4/4倍体完全再生，图6），尽管与二倍体相比，它们在达到数字外生长阶段时略有延迟（n = 4倍体，n = 4 倍体;截肢后23天：单倍体 = 3个调色板和1个数字生长阶段四肢;二倍体 = 4 个数字外生长阶段四肢）。
成功的嫁接需要实践，一致性将因技术人员的微操作技能和无菌技术而异。失败和未纯移植物会产生多种表型，如图7和图8所示。在我们手中，大约 38.7%（SD = = 8.78%）卵母细胞发育成正常发育的单倍体胚胎和11.1%（SD = = 5.46%）所有单倍体-倍体移植物中，有正常发育、移植的倍体四肢的活的动物（图9）。
图 1：协议概述和嵌合轴乐的实例。（A） 概述为生成单倍体和嵌合体胚胎而为生成倍体宿主胚胎而采取的步骤的相对时间。（B） 由胚胎肢体芽移植从RFP+单倍体胚胎移植到GFP+双倍体宿主（B'）的胚胎肢体芽移植产生的幼体轴球的复合明亮图像，覆盖相同的8厘米幼体轴球的绿色和红色荧光图像。单倍体肢体非常正常，但比相反的双倍体肢体短。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：正常发育和干净嫁接的单倍体肢体的荧光图像。移植到GFP®双倍体宿主的GFP-单倍体肢体显示GFP表达模式，似乎仅限于脊髓神经内压肢体（黄色箭头）和单个感觉神经元和血液衍生细胞（白色箭头）。照片中的肢体属于一个4厘米的少年。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：双倍体和单倍体胚胎的比较。（A） 双倍体（左）和单倍体（右）的光图像。注意减少的AP轴曲率和单倍体胚胎的突出内端（白色箭头）。（B） 同一胚胎的绿色荧光图像。GFP-单倍体是使用来自GFP-雌性精子的卵子和来自GFP+的辐照精子产生的。双倍体是 GFP+。图为胚胎大约是阶段2530。暂存系列。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：概述单倍体肢体芽移植程度的图解。（A） 阶段25倍体胚胎的横向视图.虚线显示应移植的近似区域，相对于刺凸起和肢体芽。（B） 阶段 25 的横向示意图。虚线显示应从宿主中取出并替换为相应的单倍体供体组织的近似区域和组织类型。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：单倍体和双倍体肢体长度的比较。（A） 单倍体四肢的长度（粉红色）和16个类似大小的嵌合动物的反向双倍体四肢（绿色）的散射图（单倍体均值 = 0.522 厘米，SD = 0.087 厘米，双倍体均值 = 0.667 厘米，SD = 0.069 厘米）。从沸高脚底到数字2和3的交界处测量了肢体。（B） 16种动物的倍体肢体长度与双倍体肢体长度比的散射图（平均比 = 0.784，SD = = 0.113 cm）。（C） 16 个测实嵌合体体长度 （cm） 的散射图（平均动物长度 = 8.72 厘米 = 0.456 厘米）。动物从鼻尖到尾尖被测量。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：单倍体和双倍体四肢再生的比较。（A） 截肢前的倍体肢体.（B） 再生后的同一单倍体肢体。（C） 截肢前双体肢。（D） 再生后的同一双倍体肢体。4/4单倍体四肢和4/4双倍体四肢以正常形态再生。黑色虚线表示截肢平面。比例尺 = 1 毫米。对大小匹配的幼年动物（8.5 厘米）进行截肢。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：单倍体四肢正常和异常发育的例子。（A） 具有严重正常形态的单倍体肢体.（B-E）未能支持单倍体完全发展的移植物示例。（B） 奥利戈德蒂。（C）更严重的是。（D） 没有明显的数字结构。（E） 无肢体.所描绘的四肢属于大小相似的青少年（8.0至10厘米）。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：不纯单倍体肢体移植中的GFP+细胞示例。（A， A'）形态正常的单倍体移植肢体与GFP®双倍体细胞在皮肤和真皮（白色虚线轮廓）显示荧光显微镜。（B，B'）具有GFP®双倍体细胞的移植异常单倍体肢体，对真皮和皮肤（白色轮廓）广泛贡献。（C，C'）移植的异常单倍体肢体，其中表皮已替换为GFP®双倍体细胞（白色轮廓）。所描绘的四肢属于大小相似的青少年（8.0至10.0厘米）。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图9：单倍体胚胎和单倍体肢体生成成功率。（A） 使用体外活化产生的活的倍体胚胎的百分比.数据是从五个独立的体外活化实验中收集的。绿色表示产生可用于移植的25级单倍体胚胎的卵子的比例（平均值= 38.7%，SD = = 8.78%）。灰色表示没有裂解迹象、无法存活或正常发育的鸡蛋比例。（B） 正常发育的、干净嫁接的单倍体四肢的百分比。紫色表示产生清洁、正常发育的单倍体肢体的移植物的分数（平均值 = 11.1%，SD = = 5.46%）。绿色表示正常发育但有污染GFP®宿主组织的四肢（平均值= 11.3%，SD = = 8.64%）。红色表示移植四肢未正常发育（平均值 = 27.1%，SD = = 30.3%）。蓝色表示所有移植的胚胎和动物没有存活完成肢体发育（平均 = 50.5%，SD = = 31.2%）。移植动物的流失分布在胚胎晚期和幼虫期。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在我们的协议中，有几个关键步骤用于生成单倍体-双倍体嵌合体，操作技术人员应考虑这些步骤，以便获得一致的嫁接结果。
单倍体生成失败的最可能原因是体外激活条件不佳。必须使用适当数量的活化精子来激活卵子。为了延长活力，精子样本应始终保持在4°C。在将任何精子样本涂在卵子上之前，使用倒置显微镜检查精子的存活性。完全非活动性精子绝不应使用，浓度应调整为80，000块细胞/mL。激活步骤中的精子过多也会阻碍卵子的正常发育。精子坑在卵子表面以小而暗的凹痕出现，是精子细胞已经渗透到卵子的物理迹象，通常在应用精子后20至60分钟出现。有十个或更多精子坑的卵子可能无法正常激活。
未受精的卵子在水下下15分钟内收集，放入干培养皿中，并在精子应用前用纸巾彻底干燥，可以激活。或者，如视频所示，鸡蛋可能从激素注射的女性中挤出。我们发现，这些"干"鸡蛋提供更一致的结果，虽然我们经常使用这两种方法。
成功的移植需要将双倍体胚胎与适当分期单倍体肢体芽组织适当耦合。该协议包含许多确保阶段匹配的措施。由于自然交配并不总是导致产卵，HCG注射获得单倍体卵母细胞，不应该进行，直到自然交配的雌性开始下双倍体卵子。注射后，诱导雌性应放在较低的温度（8至12°C），这将减少产卵率。在正常温度下容纳激素刺激的雌性可能导致大多数卵子在短时间内下蛋。冷冻雌性卵子的产卵开始表明，雌性已做好麻醉和卵母细胞提取的准备。卵母细胞激活必须在卵母细胞提取的15分钟内发生。由于活性单倍体胚胎在发育中自然产生的双倍体胚胎将落后几天，我们建议在12°C下孵育双倍体胚胎，同时在18°C下孵育倍体的相对发育速度。由于诱导雌激素注射和卵子产卵之间的间隔会有一些变化，因此可能需要对单倍体或双倍体的孵育温度进行细微调整，以便在移植时配对宿主和供体胚胎。胚胎在移植前应冷却至4°C，这几乎会阻碍发育。在移植之前，冷却单倍体和双倍体胚胎的发病时间不同，可以实现阶段匹配。虽然单倍体胚胎在形态上不同于双倍体，但单倍体和双倍体在神经折叠关闭后达到阶段21，胚胎位于其侧面。与双倍体一样，第25阶段单倍体胚胎有突出的刺和易发性肾上部凸起。大头突出的角度相对于身体在单倍体，虽然这大大减少相比阶段25双发体胚胎，其头从身体突出近一个直角30。
无菌技术对于成功的组织移植是绝对关键的。从单倍体生成到奇美器的胚胎发育，整个实验都应保持无菌条件。我们建议在产卵期间将所有母性动物保持清洁、非系统水状况，以尽量减少在手术开始时对有机物的污染量。在整个过程中持续、每天取出死亡或垂死的胚胎对于维持其他胚胎的健康非常重要。我们建议单独容纳所有单倍体和嵌合体胚胎，以尽量减少交叉污染。
胚胎微解剖和组织移植技术是通过实践获得的。在移植过程中，重要的是不要刺穿或撕裂肢体芽本身。从宿主和供体胚胎中取出的组织应延伸到肢体芽之外，如图所示，以提供缓冲区。如果移植的组织面积太小，单倍体四肢将被GFP®双倍体皮肤和其他组织渗透。
这种移植技术的局限性之一是四肢的神经组织和血液来自宿主体。在少数罕见的情况下，我们已经能够产生移植的单倍体四肢，完全缺乏GFP®表达神经的所有迹象。在这些情况下，我们能够用宿主动物的神经组织替换足够的神经组织。然而，如此广泛的移植是困难的，不可靠的，并经常产生发育异常以外的肢体。
单体动物在阿索洛特尔中是胚胎致死的。同样，许多基因的突变对肢体发育和再生可能至关重要，也是早期胚胎致命。我们的方案绕过了用于生产实验四肢的单倍体的胚胎杀伤力，也可用于候选再生基因突变产生胚胎致命表型的情况。我们的肢体芽移植技术提供了一个优势，以做到这一点与以前描述的肢体芽和贡献组织移植的方法，因为它是在早期胚胎发育期间执行，涉及移植完整的外皮和中皮层1，2。
手部肢芽移植之前已经描述过;然而，在这项早期的研究中，单倍体肢体芽被移植到异位31。从这些移植物中衍生的异位肢体的微观核分析显示，双倍体组织具有广泛贡献。虽然这些四肢发育异常，但它们能够再生31。而不是移植异位肢体芽，我们取代整个内源性肢体芽与等效单倍体组织。通过使用荧光标记，我们能够直观地识别单倍体四肢，除了神经和血细胞，而不会牺牲单倍体肢体本身。我们发现单倍体四肢发育和再生正常。然而，GFP®宿主的四肢对神经和血液衍生细胞以外的组织作出贡献，通常表现出异常。因此，在调查单倍体四肢的基因功能时，必须排除那些具有过多宿主贡献的人，才能将基因型与在突变单倍体四肢中观察到的任何表型相关联。
最近的创新，如轴醇基因组的组装和最近基于CRISPR/Cas的插入方法15，16，32，已经极大地扩展了轴醇的基因延展性。限制基因操作的方法在时间和空间上大有可为，但它们目前的应用受到生成、容纳和分配动物线所需的资源的限制。此处详述的协议加速了在肢体发育和再生中研究基因扰动后果的过程。在再生四肢中发现的许多基因几乎没有表征，这些基因可能涉及各种基本的发育和细胞过程。虽然我们预计肢体再生所需的许多基因也需要肢体发育，但这种方法可能会发现任何与再生相关的基因是否具有再生特异性功能丧失的表型。CRISPR/Cas突变在异形体中通常产生等位马赛克，包括保留的野生型等位基因，这种马赛克本身可以被视为可量化的表型20。利用截肢原肢和再生肢体的下一代测序，研究人员可以量化在再生后，具有基因突变的单倍体细胞是否优先丢失。这种方法可能允许研究由干扰其他基本发育基因产生的再生表型。
单倍体功能丧失的基因筛选有助于研究许多生物过程的遗传起源，而无需建立双体突变细胞系。通过结合单倍生成、CRISPR/Cas9 诱变和肢体芽移植，我们为单倍体遗传屏幕提供了一个探索活体动物肢体发育和再生的新平台。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢凯瑟琳·罗伯茨对阿索洛特尔殖民地的关心。这项工作的资金由康涅狄格州创新再生医学研究基金（15RMA-YALE-09和15元人民币-YALE-01）和尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康和人类发展研究所（个人博士后）提供。奖学金 F32HD086942）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
