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Genetics

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

Published: January 29, 2020 doi: 10.3791/60156
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

Summary

Questo obiettivo di questo protocollo è quello di produrre axolotl chimerici con arti anteriori aploidi derivati dal tessuto donatore mutageno Cas9 utilizzando tecniche di innesto di tessuti embrionali.

Abstract

Un insieme crescente di tecniche e risorse genetiche consente ai ricercatori di sondare le origini molecolari della capacità di alcune specie di salamandre, come gli axolotl, di rigenerare interi arti da adulti. Qui, illustremo le tecniche utilizzate per generare axolotl chimerici con arti anteriori aploidi aploidi con anammi aploidi con anamne aploidi con anamne mutagenizzati di Cas9 che possono essere utilizzati per esplorare la funzione genica e la fedeltà della rigenerazione degli arti. Uniamo diverse tecniche embrionali e genetiche, tra cui la generazione di aploidi tramite attivazione in vitro, la mutagenesi CRISPR/Cas9 e l'innesto di tessuto in un unico protocollo per produrre un sistema unico per lo screening genetico aploide in un organismo modello di rigenerazione. Questa strategia riduce il numero di animali, lo spazio e il tempo necessari per l'analisi funzionale dei geni nella rigenerazione degli arti. Ciò consente anche di sapiere le funzioni specifiche della rigenerazione dei geni che possono essere necessarie per altri processi essenziali, come l'organogenesi, la morfogenesi dei tessuti e altri processi embrionali essenziali. Il metodo qui descritto è una piattaforma unica per condurre lo screening genetico degli aploidi in un sistema modello di vertebrato.

Introduction

Storicamente, l'innesto di tessuto embrionale negli anfibi è stata una tecnica importante per esplorare i meccanismi fondamentali della biologia dello sviluppo e della rigenerazione. L'axolotl, una specie di salamandra, possiede un'impressionante capacità di rigenerare i tessuti e strutture complesse come arti e organi dopo lesioni o amputazioni. Allo stesso modo impressionante, possono ricevere, senza rigetto, innesti tissutali da altri individui a stadi embrionali, giovani e adulti1,2,3. Regioni di embrioni che producono intere strutture come arti, code, occhi e teste, e tessuti più specifici, come neuroectodermi e somiti, possono essere innestati tra embrioni per produrre animali chimerici1,2,4,5,6. Per quasi un secolo, studi su tali animali chimerici hanno fornito informazioni cruciali sulla rigenerazione, la differenziazione dei tessuti, il controllo delle dimensioni e il patterning1,7,8.

Nell'ultimo decennio, numerosi studi trascrizionali sui tessuti rigeneranti hanno prodotto approfondimenti sui programmi genetici alla base della rigenerazione della salamandra9,10,11,12,13. Questi studi hanno aggiunto un elenco in espansione di geni candidati che, ad oggi, sono in gran parte caratterizzati nel contesto della rigenerazione. Tecniche mirate di mutagenesi, come CRISPR/Cas, ora permettono lo studio di tali geni, e tali approcci genetici sono notevolmente facilitati dal recente sequenziamento e assemblaggio del grande genoma axolotl14,15,16.

Abbiamo cercato di sviluppare tecniche che associavano la biologia dello sviluppo classico alla nuova tecnologia genetica allo scopo di sezionare i meccanismi di rigenerazione. I metodi per la generazione di embrioni aploidi di axolotle e altre salamandre sono stati stabiliti per decenni17. Mentre queste tecniche sono state a lungo notate come vantaggi delle salamandre come organismi modellogenetico 18, pochi studi genetici successivi hanno incorporato animali aploidi. Usiamo l'attivazione in vitro nell'axolotl per produrre embrioni aploidi che fungono da donatori di tessuti per l'innesto19. Utilizzando embrioni che trasportano marcatori genetici fluorescenti, abbiamo ideato metodi affidabili per generare arti derivati quasi interamente dai tessuti donatrici (Figura 1A). Combinando queste due tecniche, abbiamo aggirato la letale embrionale tardiva associata all'aploidia, consentendo la produzione di arti aploidi completamente sviluppati e innestati (Figura 1B, Figura 1Be Figura 2).

Conducendo la mutagenesi mediata DA CRISPR/Cas in embrioni aploidi prima dell'innesto per creare axolotli chimerici con arti aploidi mutanti, possiamo studiare la funzione genica specificamente nel contesto dello sviluppo e della rigenerazione degli arti. Ciò consente il salvataggio di arti da fenotipi mutanti potenzialmente embrionali-letali. Mentre la microiniezione CRISPR/Cas può generare animali altamente mutanti, tali animali sono tipicamente altamente mosaici, con un certo grado di ritenzione di alleli wildtype e una varietà di mutazioni distinte nei siti mirati14,20. La mutagenesi a base di CRISPR nelle cellule aploidi aumenta la penetrazione delle mutazioni della perdita di funzione di singolo allele, in quanto non possono essere mascherate da alleli wildtype conservati. Per questo motivo, lo screening basato su CRISPR nelle linee cellulari aploidi viene sempre più utilizzato per studiare la base genetica di molti processi cellulari21,22,23. Combinando il tracciamento del lignaggio basato su CRISPR con i nostri protocolli di innesto di boccioli aploidi, l'approccio qui descritto può servire come piattaforma per schermi genetici aploidi in animali viventi20.

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Protocol

Le procedure sperimentali utilizzate in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yale (IACUC, 2017–10557) ed erano conformi a tutte le politiche e linee guida federali che disciplinano l'uso degli animali vertebrati. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati sull'Ambystoma mexicanum (axolotls) in strutture dell'Università di Yale.

1. Generazione di embrioni diploide

  1. Ottenere embrioni diploidi GFP per fungere da ospiti di innesto attraverso l'accoppiamento naturale utilizzando uno o due genitori gfp 24.
  2. Raccogliere le uova diploide appena posate e metterle in un setaccio di metallo.
  3. Sciacquare accuratamente le uova con la soluzione del 40% di Holtfreter (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7.4).
  4. Mettete le uova nella soluzione fresca del 40% di Holtfreter e conservatele a 12 gradi centigradi.
    NOTA: gli embrioni diploidi devono sempre essere ottenuti prima di passare alla generazione di embrioni aploidi.

2. Generazione di embrioni aploidi

  1. Preparazione del donatore di gameti femminili
    1. 48 h prima di effettuare l'attivazione in vitro, anestesizzare un axolotl femminile bianco o bianco/RFP sessualmente maturo per immersione in MS-22 2thong tampone HEPES nel 40% soluzione Holtfreter25.
    2. Assicurarsi che l'animale sia completamente anetizzato dopo circa 30 min di immersione pizzicando saldamente la coda tra il pollice e l'indice. Gli animali completamente anestesizzati non rispondono fisicamente ad alcun pizzico.
    3. Preparare una soluzione di gonadotropina corionica umana (HCG) contenente 10.000 U/mL in salina sterile.
    4. Utilizzando una siringa insulinica da 30 G, iniettare 0,15 CC di HCG (1.500 unità) nella muscolatura dorsale all'arto posteriore della femmina anetizzata con un angolo di 45 gradi rispetto alla linea mediana per evitare il contatto con il midollo spinale.
    5. Riportate la femmina al 40% di Holtfreter e mettetela in un frigorifero da 8,12 gradi centigradi.
    6. Dopo 48 h, riportare la femmina a temperatura ambiente. Mettere alcune pietre o piante di plastica nel suo contenitore come superfici per la deposizione delle uova.
      NOTA: Le femmine iniettate con HCG spesso depositano casi di gelatina vuoti per diverse ore prima di deporre le uova.
    7. Rimuovere le pietre o piante di plastica dopo che la femmina ha iniziato costantemente deponendo le uova.
    8. Lasciare che la femmina si sieda nel serbatoio vuoto per 30 min a 1 h.
      NOTA: Trattenendo i materiali per l'animale di deporre le uova permetterà un controllo più rigoroso della raccolta degli ovociti.
  2. Collezione di gameti maschili
    1. Mentre la deposizione dell'uovo della femmina è in stallo, anestesizza un axolotl maschile GFP -essere sessualmente maturo per fungere da donatore di sperma, come nel punto 2.1.1.
    2. Posizionare il maschio completamente anetizzato sulla schiena su asciugamani di carta umidi sotto un microscopio dissegente.
    3. Se lo sperimentatore è destrorso, posizionare la punta di una pipetta P1000 alla base della cloaca con la mano destra.
    4. Posizionare l'indice sinistro e il pollice della mano sinistra di 2,3 cm rostral sul bacino. Spremere delicatamente l'animale mentre si spostano le dita verso le zampe posteriori per eliminare i campioni di urina spermica.
    5. Raccogliere ciascuno che viene lavato fuori dalla cloaca in un singolo tubo di microcentrifuga. Ripetere questo processo per raccogliere da 6 a 10 campioni.
    6. Pipetta 5,0 l da ogni campione su una piastra di Petri per ispezionare la qualità dello sperma utilizzando un microscopio invertito.
      NOTA: I campioni di spermatozoi concentrati sono di colore bianco latteo, in genere vanno da 5 a 20 -L, e di solito vengono recuperati dopo che vengono estratti diversi campioni di urina spermica di volume più elevato. Lo sperma raccoglierà nella parte inferiore dei tubi in campioni di volume più elevato quando lasciato indisturbato. I campioni concentrati di spermatozoi sani sono altamente motili e perdono attività man mano che la loro concentrazione diminuisce. I maschi sani possono produrre fino a 50 -L di sperma concentrato.
  3. Collezione gamete femminile
    1. Dopo aver ottenuto e confermato un campione di spermatozoi sano, anestesizzare l'axolotl femminile iniettato da HCG come nel passo 2.1.1.
    2. Posizionare la femmina completamente anetizzata su asciugamani di carta umidi sulla schiena.
    3. Estrarre le uova non fecondate dalla femmina utilizzando un movimento della mano simile a quello nel passaggio 2.2.4.
    4. Raccogliere le uova con pinze bagnate e trasferirle in una piastra di petri di 10 cm. Trattare le uova con sperma irradiato entro 15 min dalla raccolta.
  4. Preparazione di gameti maschili e attivazione in vitro
    1. Utilizzare una pipetta P10 o P20 per pipettare lo sperma su e giù, rompendo i grumi per formare una sospensione omogenea.
    2. Approssimare la percentuale di spermatozoi motili posizionando una goccia di 0,5 ll di sospensione dello sperma non diluita su un coperchio della piastra di Petri o su un vetrino di vetro ed esaminando con un microscopio invertito.
    3. Aggiungete 9,5 ll di 0,1 x la soluzione di Ringer modificata di Marc (MMR; Tabella dei materiali) a questo campione per fare una diluizione di spermatoma 20x. Delicatamente pipette su e giù per mescolare.
    4. Con un microscopio invertito, contare lo sperma in tre gocce da 1,0 ll dell'aliquota diluita 20 volte su una copertura di piastra di Petri o su un emocitometro per stimare la concentrazione di spermatozoi della sospensione non diluita.
    5. Preparare lo sperma per l'irradiazione diluindo un'aliquota del campione di sperma originale a circa 80.000 cellule motili/mL in sterile 0,1x MMR.
    6. Contare il numero di uova ottenute negli ultimi 15 min. Utilizzare la punta della pipetta per distribuire questa sospensione in uno strato spesso 1 mm.
    7. Utilizzando un ascensore di plastica, posizionare il campione a 4 cm dalle lampadine di un parassa da 254 nm. Geneticamente disattivare lo sperma irradiando il campione con 800.000 uJ/mm2.
    8. Utilizzando una pipetta P10, pipette la sospensione sulle uova non fecondate, ricoprendo ogni uovo con 0,25-0,5 litri di sperma irradiato. Lasciare che le uova si siedano a temperatura ambiente per 30 min.
    9. Dopo 30 min, allagare le uova con 0,1x MMR. Mettete immediatamente le uova in un'incubatrice di 8-10 gradi centigradi per le iniezioni il giorno successivo o a 18 gradi centigradi per le iniezioni entro 7 ore dopo l'attivazione (hpa).
    10. Dejelly aploidi con forza affilata 30 min dopo l'idratazione. Mettete immediatamente le uova in un'incubatrice di 8-10 gradi centigradi per le iniezioni il giorno successivo o a 18 gradi centigradi per le iniezioni lo stesso giorno.

3. Mutagenesi e manutenzione haploid

  1. Microiniezioni CRISPR/Cas9
    1. Progetta sgRNA utilizzando CRISPRscan e sintetizza26,27.
    2. Per la mutagenesi multiplex, preparate uno stock di 5 sgRNA (10 ng/L per ogni sgRNA) e una proteina Cas9 (1 g/l). Preparare una diluizione di 100 volte di questo stock (0,1 ng/L per sgRNA, 10 ng/L Cas9) per l'iniezione. Per il singolo gene, alta frequenza di mutazione, seguire il protocollo descritto in precedenza28.
    3. Iniettare gli embrioni aploidi allo stadio a cella singola di 7 ha se immagazzinati a 18 gradi centigradi o iniettare gli embrioni il giorno successivo allo stadio di 2/8 cellule se sono immagazzinati a 8.10 gradi centigradi.
    4. Trasferire gli embrioni a 1,0 x MMR con 400 polisucrosi al 20%.
    5. Se a singola cellula, iniettare a ogni embrione una goccia di 5 nL della soluzione di iniezione (circa 1/4 raggio dell'uovo) contenente una massa totale di 0,5 pg/sgRNA e 50 pg Proteina Cas9. Se multicellulare, distribuire questa massa iniettando volumi più piccoli in più cellule.
    6. Lasciare che gli embrioni guariscano nella polisucrosi 400 per un minimo di 4 h e un massimo di 18 h a 18 gradi centigradi.
  2. Alloggiamento embrionale aploide
    1. Trasferire gli embrioni a 0,1x MMR con antibiotico-antimicotico.
    2. Casa ogni embrione in un pozzo individuale di una piastra di 24 pozze, come alcuni moriranno o si svilupperanno in modo anomalo. Mantenere a 16/18 gradi centigradi. Temperature più basse possono essere utilizzate per prolungare lo sviluppo, se necessario.
    3. Sostituire i supporti con mMR fresco 0.1x con antibiotico-antimicotico a giorni alterni.

4. Preparazione dell'embrione dell'ospite diploide

  1. Mantenere gli embrioni nel rivestimento della gelatina a 12-16 gradi centigradi fino a raggiungere lo stadio da 22 a 26.
  2. Raccogliere gli embrioni pronti per l'innesto, posizionarli all'interno di un setaccio (dimensioni della rete di 4 mm) e sciacquarli delicatamente con il 40% della soluzione di Holtfreter.
  3. Trasferire gli embrioni in mMR calibro sterilizzato 0,1x contenenti 1,5% di candeggina fino a 2 min. Sommergendo completamente gli embrioni nella soluzione di candeggina e vorinferoli delicatamente per garantire che il rivestimento della gelatina entri pienamente in contatto con la soluzione di candeggina per uccidere i microbi presenti sugli embrioni.
  4. Dopo 2 min, diluire la soluzione di candeggina contenente gli embrioni con un volume uguale di filtro-sterilizzato 0.1x MMR.
  5. Versare delicatamente gli embrioni in un setaccio candeggina sanitizzato (dimensioni maglia 4 mm) e risciacquare gli embrioni cinque volte con 0,1m MMR sterilizzato con filtro.
  6. Collocare gli embrioni in sterili piatti di Petri da 10 cm con 0,1 mM con antibiotici per la denicecciatura (penicillina 100 unità/mL, streptomicina 100 g/l, 0,25 g/mL, gentamicin 25 g/mL).
  7. Sotto uno stereoscopio fluorescente, rimuovere i cappotti di gelatina e le membrane vitelline dagli embrioni GFP utilizzando pinze affilate (dimensioni della punta 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Trasferire gli embrioni di GFP in una nuova piastra di Petri. Ridurre al minimo la quantità di liquido trasferito dalla piastra di Petri dove sono stati dejellied.
  9. Risciacquare gli embrioni dell'ospite di GFP con sterili 0,1 volte MMR con antibiotici da quattro a sei volte per rimuovere i contaminanti.
  10. Collocare gli embrioni puliti a 4 gradi centigradi durante la notte prima dell'innesto.
    NOTA: Il raffreddamento degli embrioni li rende più rigidi e puliti separazioni del mesoderma dall'endoderma fattibile.

5. Generazione Chimera aploide-diploide-diploide

  1. Preparazione chirurgica di piatti e supporti
    1. Preparare sterili piatti chirurgici operativi versando autoclaved 2% agarose in 0.1x MMR in sterili 35 mm piatti di Petri facile afferratura. Riempire i piatti di petri a metà strada con agarose.
    2. Dopo che l'agarose si raffredda, utilizzare un bisturi sterile per tagliare una depressione lunga 25 mm nell'agarose per tenere gli embrioni in posizione.
    3. Riempire il piatto con supporti chirurgici sterili (0,1m MMR con anti-micoplasma 2,5 g/mL, amphotericin B 0,25 g/mL e ciprofloxacin 10,0 g/mL) e conservare in frigorifero a 4 gradi centigradi.
  2. Procedura di innesto dell'embrione
    1. Collocare all'interno della depressione della parabola operativa prescolata un donatore sano di aploide con uno o due embrioni dell'ospite diploide GFP e corrispondente allo stadio all'interno della depressione della parabola operativa preclata contenente supporti chirurgici (Figura 3).
      NOTA: Se possibile, eseguire la procedura su una fase di raffreddamento (10 o inferiore).
    2. Utilizzare due pinze ultra-sottili e autoclaved (punta dritta, dimensioni della punta 0,05 x 0,02 mm2) per rimuovere gli strati di ectoderm e mesodermi dall'ospite con l'arto gemma vicino al centro (Figura 4).
      NOTA: La regione di innesto di tessuto rettangolare comprende il bocciolo dell'arto ed estende dalla nona somite alla metà posteriore del rigonfiamento branchiale, circa 2 mm, lungo l'asse posteriore anteriore. Lungo l'asse dorsoventrale, la regione innestata si estende per circa 1,5 mm, comprese le somiti appena oltre il bordo ventrale del rigonfiamento branchiale branchiale. La regione innestata comprende tutto il mesoderma laterale della piastra e le metà laterali dei somiti, senza disturbare l'endoderma sottostante. Vedere Figura 4 e il video di accompagnamento per i dettagli.
    3. Mettere da parte il tessuto ospite e rimuovere un lasso di tessuto di dimensioni equivalenti dal donatore aploide utilizzando gli stessi metodi.
    4. Posizionare la lastra di tessuto del donatore aploide sulla regione corrispondente dell'embrione del donatore.
    5. Fissare il tessuto coprendolo con un frammento di vetro rettangolare autoclato da un vetro di copertura del microscopio schiacciato e premendolo delicatamente nel corpo dell'embrione ospite.
    6. Capovolgere l'embrione del donatore aploide sul suo lato opposto per raccogliere il germoglio dell'arto per il secondo embrione ospite. Ripetere i passaggi da 5.2.2 a 5.2.5.
    7. Rimuovere con cautela i tessuti ospiti in eccesso rimanenti e l'embrione del donatore dal piatto.
    8. Lasciare gli innesti con le ancore del frammento di vetro in posizione per 60-75 min, controllando ogni 20 min per assicurarsi che il vetro non sia scivolato via.
    9. Dopo che gli innesti di tessuto aderiscono completamente, utilizzare le pinze per staccare lentamente le ancore del frammento di vetro.
  3. Manutenzione Chimera
    1. Trasferite gli embrioni innestati su supporti chirurgici freschi e manteneteli a 8,12 gradi centigradi durante la notte per guarire. Casa individualmente embrioni innestati in piastre 12 o 24-bene.
    2. Dopo 36-48 h, trasferire gli embrioni innestati in sterile 0,1x MMR antibiotic-antimicotic. I forti antibiotici nei media chirurgici causano tossicità negli embrioni innevati dopo 3 giorni.
    3. Sostituire i supporti con mMR freschi 0,1x e antibiotici ogni 2/3 giorni.
    4. Mantenere gli embrioni innestati a 18 gradi centigradi fino a quando non sono in grado di nutrirsi di28.
    5. Dopo 1 o 2 mesi di sviluppo e cura, gli arti aploidi possono essere segnati per la purezza dell'innesto utilizzando un microscopio a dissezione fluorescente.
      NOTA: La presenza di tessuto GFP non neurale o non-sanguinario derivato da host negli arti è un indicatore di innesto impuro ed è spesso associata allo sviluppo anormale degli arti. Questi animali dovrebbero essere esclusi da ulteriori analisi.

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Representative Results

Lo sviluppo di embrioni aploidi può essere distinto dagli embrioni diploidi dal loro fenotipo29della loro "sindrome aploide". In fase di innesto, gli embrioni aploidi presentano una curvatura ridotta lungo l'asse anteriore-posteriore e un recinto incompleto della spina del tuorlo (Figura 3A). Un microscopio fluorescente può essere utilizzato per garantire che gli embrioni aploidi siano privi di espressioni GFP di derivazione paterna (Figura 3B).

Quando gli innesti sono puliti, l'espressione GFP dovrebbe essere limitata principalmente al plesso brachiale, la rete neurale derivata dal midollo spinale dell'host, come illustrato nella Figura 2. L'espressione Punctate GFP sarà presente anche nelle singole cellule che sembrano essere neuroni sensoriali e cellule ospiti derivate dal sangue, che migrano nell'arto in via di sviluppo. Quando si utilizzano i donatori RFP, gli arti aploidi dell'innesto mostreranno l'espressione universale della RFP (Figura 1B ). Durante lo sviluppo, gli arti aploidi non mutagenizzati sono significativamente più corti degli arti anteriori diploidi opposti in animali chimerici abbinati alle dimensioni(Figura 1B, Figura 1B'e Figura 5, n - 16 coppie di arti, haploid media , 0,522 cm, SD , 0,087 cm, media diploide , 0,667 cm, SD , 0,069 m, valore p del test T accoppiato < 0,0001, rapporto medio , 0,784, SD e 0,113). Anche gli arti aploidi non mutagenizzati si rigenerano completamente (4/4 dialogi aploidi e 4/4 diploidi rigenerazione completa, Figura 6), anche se mostrano un leggero ritardo nel raggiungere la fase di escapsione digitale rispetto ai diploidi (n - 4 aploidi, n - 4 diploidi; 23 giorni dopo l'amputazione: aploidi - 3 tavolozza e 1 stadio di esbocremento digitale arti; diploidi - 4 arti fase di esbocco digitale).

L'innesto di successo richiede pratica e la consistenza varia a seconda delle capacità di micromanipolazione del tecnico e della tecnica sterile. Gli innesti falliti e impuri producono una varietà di fenotipi, come illustrato nella figura 7 e nella figura 8. Nelle nostre mani, circa il 38,7% (SD - 8,78%) di ovociti si sviluppano in embrioni aploidi normalmente sviluppati e l'11,1% (SD - 5,46%) di tutti gli innesti aploidi-diploidi producono animali vitali con arti aploidi normalmente sviluppati e puliti (Figura 9).

Figure 1
Figura 1: Panoramica del protocollo e un esempio di axolotl chimerico. (A) Schematico che illustra la tempistica relativa delle misure adottate per ottenere embrioni ospiti diploidi, spermatozoi e ovuli al fine di generare aploidi ed embrioni chimerici. (B) Immagine luminosa composita di un asaxolotlo giovanile prodotto dall'innesto di boccioli embrionali dagli innesti di un embrione aploide RFP a un ospite diploide GFP(B') Sovrapposizione di immagini fluorescenti verdi e rosse dello stesso axolotllo giovanile di 8 cm. L'arto aploide è grossolanamente normale, ma più corto dell'arto diploide opposto. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine fluorescente di un arto aploide normalmente sviluppato e innestato in modo pulito. L'arto aploide GFP- innestato in un host diploide GFP mostra un modello di espressione GFP che sembra essere limitato ai nervi spinali che innervano l'arto (freccia gialla) e ai singoli neuroni sensoriali e alle cellule derivate dal sangue (frecce bianche). L'arto raffigurato apparteneva a un giovane di 4 cm. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Confronto di embrioni diploidi e aploidi. (A) Immagine chiara dei diploidi (a sinistra) e degli aploidi (a destra). Si noti la curvatura dell'asse AP ridotta e l'endodermo sporgente degli embrioni aploidi (frecce bianche). (B) Immagine fluorescente verde degli stessi embrioni. Gli aploidi GFP sono stati generati utilizzando uova di uno sperma torbiere GFP e irradiato da un GFP. I diploidi sono GFP. Gli embrioni raffigurati sono approssimativamente stadio 2530. Serie di staging. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Schematico che delinea l'estensione di un innesto di boccioli aploidi. (A) Vista laterale di un embrione aploide stadio 25. Le linee tratteggiate mostrano l'area approssimativa che dovrebbe essere trapiantata, rispetto al rigonfiamento branchiale e al bocciolo degli arti. (B) Schema trasversale della fase 25. Le linee tratteggiate mostrano l'area approssimativa e i tipi di tessuto che devono essere rimossi dall'ospite e sostituiti con il tessuto donatore aploide corrispondente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Confronto delle lunghezze degli arti aploidi e diploidi. (A) Grafico a dispersione delle lunghezze degli arti aploidi (rosa) e degli arti diploidi opposti (verde) di 16 animali chimerici di dimensioni simili (media aploide , 0,522 cm, SD - 0,087 cm, media diploide , 0,667 cm, SD , 0,069 cm). Gli arti sono stati misurati dalla base dello zeugopod alla giunzione delle cifre 2 e 3. (B) Grafico a dispersione della lunghezza dell'arto aploide ai rapporti di lunghezza degli arti diploidi dei 16 animali (rapporto medio : 0,784, SD - 0,113 cm). (C) Grafico a dispersione delle lunghezze del corpo (cm) delle 16 chimere misurate (lunghezza media dell'animale di 8,72 cm - 0,456 cm). Gli animali sono stati misurati dalla punta del muso alla punta della coda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Confronto della rigenerazione negli arti aploidi e diploidi. (A) Pre-amputazione dell'arto aploide. (B) Lo stesso arto aploide dopo la rigenerazione. (C) Pre-amputazione degli arti diploide. (D) Lo stesso arto diploide dopo la rigenerazione. 4/4 arti aploidi e arti diploidi 4/4 rigenerati con morfologia normale. Le linee tratteggiate nere indicano il piano di amputazione. Le barre di scala n. 1 mm. Sono state eseguite amputazioni su animali giovani di dimensioni corrispondenti (8,5 cm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Esempi di sviluppo normale e anormale degli arti aploidi. (A) Un arto aploide con morfologia grossolanamente normale. (B-E) Esempi di innesti che non hanno supportato lo sviluppo completo dell'aploide. (B) Oligodactyly. (C) Più grave oligodo. (D) Non sono presenti strutture digitali distinte. (E) Nessun arto. Gli arti raffigurati appartengono a giovani di dimensioni simili (8,0 a 10 cm). Barre di scala - 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Esempi di cellule GFP in innesti di arti aploidi impuri. (A, A ') Arto di innesto aploide morfologicamente normale con cellule diploidi GFP nella pelle e dermis (contorno bianco tratteggiato) rivelato dalla microscopia fluorescente. (B, B') Un arto aploide anormale innestato con cellule diploidi GFP che contribuiscono ampiamente al derma e alla pelle (contorno bianco). (C,C') Un arto aploide anormale innestato in cui l'epidermide è stata sostituita con cellule diploidi GFP (contorno bianco). Gli arti raffigurati appartengono a giovani di dimensioni simili (8,0 a 10,0 cm). Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Tassi di successo dell'embrione aploide e della generazione di arti aploidi. (A) Percentuale di embrioni aploidi vitali generati con attivazione in vitro. Sono stati raccolti dati da cinque esperimenti indipendenti di attivazione in vitro. Il verde indica la frazione di ovuli che producevano 25 embrioni aploidi allo stadio 25 che potrebbero essere utilizzati per l'innesto (media : 38,7%, SD - 8,78%). Il grigio indica la frazione di uova che non mostravano segni di scissione, non erano vitali o erano normali in fase di sviluppo. (B) Percentuale di arti aploidi normalmente sviluppati e puliti. Il viola indica la frazione di innesti che hanno prodotto arti aploidi puliti e normalmente sviluppati (media: 11,1%, SD - 5,46%). Il verde indica gli arti che si sviluppavano normalmente, ma che avevano tessuti ospiti contaminanti (media : 11,3%, SD - 8,64%). Il rosso indica gli arti di innesto che non si sono sviluppati normalmente (media : 27,1%, SD - 30,3%). Il blu indica tutti gli embrioni innestati e gli animali che non sono sopravvissuti allo sviluppo completo degli arti (media: 50,5%, SD - 31,2%). La perdita di animali innestati è stata distribuita tra gli stadi embrionali e larvali tardivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ci sono alcuni passaggi critici nel nostro protocollo per la generazione di chimere aploidi-diploidi che il tecnico operativo dovrebbe prendere in considerazione per risultati di innesto coerenti.

La ragione più probabile per cui la generazione di aploidi fallisce è dovuta a cattive condizioni di attivazione in vitro. Le quantità adeguate di spermatozoi motile devono essere utilizzate per attivare le uova. Per prolungare la motilità, i campioni di sperma devono sempre essere mantenuti a 4 gradi centigradi. Prima di applicare qualsiasi campione di sperma agli ovuli, controllare la vitalità dello sperma utilizzando un microscopio invertito. Lo sperma completamente non motile non deve mai essere utilizzato e la concentrazione deve essere regolata a 80.000 celle motili /mL. Troppo spermato. Le fosse di sperma, che appaiono come piccole rientranze scure sulla superficie dell'uovo, sono un'indicazione fisica che una cellula sperma è penetrata nell'uovo e in genere appaiono da 20 a 60 minuti dopo l'applicazione dello sperma. Le uova con dieci o più pozzi di sperma potrebbero non essere attivate correttamente.

Le uova non fecondate possono essere attivate se raccolte entro 15 minuti dopo essere state deposte sott'acqua, poste in una piastra di Petri secca e asciugate accuratamente con asciugamani di carta prima dell'applicazione dello sperma. In alternativa, come mostrato nel video, le uova possono essere spremute da una femmina con iniezione di ormone. Troviamo che queste uova "secche" danno risultati più coerenti, anche se impieghiamo regolarmente entrambi i metodi.

L'innesto di successo richiede il corretto accoppiamento di embrioni diploidi con tessuto aploide dell'arto aploide opportunamente messo in scena. Questo protocollo contiene una serie di misure per garantire la corrispondenza delle fasi. Poiché l'accoppiamento naturale non sempre si traduce in deposizione delle uova, l'iniezione di HCG per ottenere ovociti aploidi non deve essere eseguita fino a quando la femmina accoppiata naturalmente non inizia a deporre le uova diploidi. Dopo questa iniezione, la femmina indotta deve essere alloggiata a temperatura ridotta (da 8 a 12 gradi centigradi), il che ridurrà il tasso di deposizione delle uova. L'alloggiamento della femmina stimolata dall'ormone a temperature normali può comportare la deposizione della maggior parte delle uova in un breve periodo di tempo. L'insorgenza di uova che depongono in una femmina refrigerata indica che la femmina è pronta per l'estrazione di anestesia e ovociti. L'attivazione degli ovociti deve avvenire entro 15 mdall'estrazione di ovociti. Poiché gli embrioni aploidi attivati saranno diversi giorni indietro rispetto agli embrioni diploidi prodotti naturalmente in fase di sviluppo, si consiglia di incubare gli embrioni di diploide a 12 gradi centigradi aumentando il relativo tasso di sviluppo degli aploidi incubanoli a 18 gradi centigradi. Poiché ci sarà qualche variazione nell'intervallo tra l'iniezione di HCG e la deposizione degli ovuli delle femmine indotte, possono essere necessarie lievi regolazioni nelle temperature di incubazione di aploidi o diploidi in modo che la messa in scena di embrioni ospiti e donatori siano accoppiati al momento dell'innesto. Gli embrioni devono essere raffreddati a 4 gradi centigradi per diverse ore prima dell'innesto, e questo quasi arresta lo sviluppo. Diversi il tempo di insorgenza degli embrioni aploidi e diploidi refrigeranti prima dell'innesto possono consentire la corrispondenza dello stadio. Mentre gli embrioni aploidi differiscono morfologicamente dai diploidi, sia gli aploidi che i diploidi raggiungono lo stadio 21 dopo che le pieghe neurali si sono strette e gli embrioni si trovano uno ai loro lati. Come i diploidi, gli embrioni aploidi di stadio 25 hanno rigonfiamenti branchieli e proneofici. La grande testa sporge ad angolo rispetto al corpo in aploidi, anche se questo è notevolmente ridotto rispetto agli embrioni diploidi dello stadio 25, le cui teste sporgono dal corpo ad un angolo quasi retto30.

La tecnica sterile è assolutamente fondamentale per il successo dell'innesto dei tessuti. Le condizioni sterili devono essere mantenute attraverso l'intero esperimento dalla generazione aploide fino allo sviluppo embrionale delle chimere. Si consiglia di mantenere tutti gli animali padre in condizioni di acqua pulita e non di sistema durante il periodo di deposizione delle uova per ridurre al minimo la quantità di materiale organico contaminante all'inizio della procedura. La rimozione costante e quotidiana di embrioni deceduti o in morte durante l'intero processo è importante per mantenere la salute degli altri embrioni. Si consiglia di alloggiare individualmente tutti gli embrioni aploidi e chimera per ridurre al minimo la contaminazione incrociata.

La microdissezione embrionale e le capacità di innesto dei tessuti vengono acquisite attraverso la pratica. Durante il processo di innesto, è importante non forare o strappare il germoglio dell'arto stesso. I tessuti che vengono rimossi dagli embrioni dell'ospite e del donatore dovrebbero estendersi oltre il germoglio dell'arto, come nella foto, per fornire una zona di buffering. Se troppo piccolo di un'area di tessuto è innestato, gli arti aploidi saranno infiltrati dalla pelle diploide GFP e da altri tessuti.

Uno dei limiti di questa tecnica di innesto è che il tessuto neurale e il sangue negli arti sono derivati dal corpo ospite. In alcuni rari casi, siamo stati in grado di generare arti aploidi innestati che non hanno tutti i segni di GFP che esprime i nervi. In questi casi, siamo stati in grado di sostituire abbastanza del tessuto neurale nell'animale ospite con quello del donatore. Tuttavia, tale esteso innesto è difficile, inaffidabile, e spesso produce anomalie di sviluppo al di fuori dell'arto.

L'aploidia è letale embrionale nell'axolotl. Allo stesso modo, le mutazioni in molti geni potenzialmente essenziali per lo sviluppo e la rigenerazione degli arti sono anche letali embrionali iniziali. Il nostro protocollo bypassa la letalità embrionale dell'aploidia per la produzione di arti sperimentali e potrebbe essere utilizzato anche nei casi in cui la mutazione di un gene di rigenerazione candidato produce un fenotipo letale embrionale. La nostra tecnica di innesto di boccioli d'arto fornisce un vantaggio per realizzare questo metodo rispetto a descritto in precedenza di germogli omologhi e contribuire all'innesto dei tessuti, in quanto viene eseguita durante lo sviluppo embrionale precoce e comporta il trapianto di ectoderm completo e gli strati di mesodermi1,2.

L'innesto delle gemme dell'arto aploide è stato descritto in precedenza; tuttavia, in questo studio precedente, le gemme degli arti aploidi sono state innestate ectopicamente31. L'analisi nucleare microscopica degli arti ectopici derivati da questi innesti ha rivelato ampi contributi di tessuto diploide. Mentre questi arti si sviluppavano in modo anomalo, erano in grado di rigenerare31. Piuttosto che innestare gemme ectopiche, sostituiamo l'intero germoglio dell'arto endogeno con tessuti aploidi equivalenti. Attraverso l'uso di marcatori fluorescenti, siamo in grado di identificare visivamente gli arti aploidi che sono privi di contributi diploidi, ad eccezione del nervo e delle cellule del sangue, senza sacrificare l'arto aploide stesso. Troviamo che gli arti aploidi si sviluppano e si rigenerano normalmente. Tuttavia, gli arti in cui gli ospiti di GFP contribuiscono a tessuti diversi dalle cellule neurali e derivate dal sangue spesso mostrano anomalie. Pertanto, quando si studia la funzione genica negli arti aploidi, quelli con contributi eploidi eccessivi devono essere esclusi dall'analisi prima che un genotipo possa essere associato a qualsiasi fenotipo osservato negli arti aploidi mutanti.

Recenti innovazioni, come l'assemblaggio del genoma axolotl e i recenti metodi di inserimento basati su CRISPR/Cas15,16,32, hanno notevolmente ampliato la malleabilità genetica dell'axolotl. I metodi per limitare le manipolazioni genetiche in modo temporale e spaziale sono molto promettenti, ma le loro attuali applicazioni sono limitate dalle risorse necessarie per generare, casare e distribuire linee animali. Il protocollo qui descritto accelera il processo attraverso il quale le conseguenze delle perturbazioni genetiche dei geni possono essere studiate nello sviluppo e nella rigenerazione degli arti. C'è stata poca caratterizzazione di molti dei geni che si è trovato ad essere upregulated negli arti rigeneranti, e questi geni possono essere coinvolti in una varietà di processi di sviluppo e cellulari essenziali. Mentre prevediamo che molti geni necessari per la rigenerazione degli arti saranno necessari anche per lo sviluppo degli arti, questo metodo potrebbe scoprire se i geni implicati nella rigenerazione hanno fenotipi di perdita di funzione specifici per la rigenerazione. La mutagenesi CRISPR/Cas negli axolotl produce tipicamente mosaicismo allelico che include alleli wildtype conservati, e questo mosaicismo stesso può essere considerato come un fenotipo quantificabile20. Utilizzando il sequenziamento di nuova generazione degli arti originali e rigenerati amputati, i ricercatori possono quantificare se le cellule aploidi con mutazioni in un gene di interesse sono preferibilmente perse dopo la rigenerazione. Questo approccio può consentire l'analisi dei fenotipi di rigenerazione prodotti dalla perturbazione di geni dello sviluppo altrimenti essenziali.

Gli screening genetici della perdita di funzione aploidi facilitano lo studio delle origini genetiche di molti processi biologici senza la necessità di stabilire linee cellulari mutanti bialleali. Combinando l'aplogenesi, la mutagenesi CRISPR/Cas9 e l'innesto di gemme degli arti, forniamo una nuova piattaforma per uno schermo genetico aploide che esplora lo sviluppo e la rigenerazione degli arti in un animale vivente.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Katherine Roberts per la sua cura della colonia axolotl. I finanziamenti per questo lavoro sono stati erogati dal Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Fellowship F32HD086942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

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References

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Genetica Numero 155 axolotl aploide innesto di tessuto trapianto rigenerazione arto gemma degli arti chimera CRISPR Cas9 mutagenesi multiplex
Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale
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Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

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