Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Generasjon av kimeriske axolotler med mutant haploid lemmer gjennom embryonisk pode

Published: January 29, 2020 doi: 10.3791/60156
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

Summary

Dette målet med denne protokollen er å produsere kimeriske axolotls med haploid forben avledet fra Cas9-mutagenized donor vev ved hjelp av embryonale vev pode teknikker.

Abstract

Et voksende sett med genetiske teknikker og ressurser gjør det mulig for forskere å undersøke den molekylære opprinnelsen til evnen til noen arter av salamander, for eksempel axolotls, å regenerere hele lemmer som voksne. Her skisserer vi teknikker som brukes til å generere kimeriske axolotls med Cas9-mutagenized haploid forben som kan brukes til å utforske genfunksjon og troskap av lem regenerering. Vi kombinerer flere embryologiske og genetiske teknikker, inkludert haploid generasjon via in vitro aktivering, CRISPR / Cas9 mutagenesis, og vev pode i en protokoll for å produsere et unikt system for haploid genetisk screening i en modell organisme av regenerering. Denne strategien reduserer antall dyr, rom og tid som kreves for funksjonell analyse av gener i lemregenerering. Dette tillater også undersøkelse av regenereringsspesifikke funksjoner av gener som kan være nødvendig for andre viktige prosesser, som organogenese, vevmorfose og andre essensielle embryonale prosesser. Metoden som er beskrevet her er en unik plattform for å gjennomføre haploid genetisk screening i et virveldyr modellsystem.

Introduction

Historisk har embryonale vevpode i amfibier vært en viktig teknikk for å utforske grunnleggende mekanismer for utviklingsbiologi og regenerering. Axolotl, en art av salamander, har en imponerende evne til å regenerere vev og komplekse strukturer som lemmer og organer etter skade eller amputasjon. Tilsvarende imponerende, de kan motta, uten avvisning, vev grafts fra andre personer på embryonale, juvenile, og voksne stadier1,2,3. Regioner av embryoer som produserer hele strukturer som lemmer, haler, øyne og hoder, og mer spesifikke vev, som neuroectoderm og somitter, kan podes mellom embryoer for å produsere kimeriske dyr1,2,4,5,6. I nesten et århundre har studier av slike kimeriske dyr gitt avgjørende innsikt i regenerering, vevdifferensiering, størrelseskontroll og mønster1,7,8.

I det siste tiåret, mange transkripsjonelle studier av regenererende vev har produsert innsikt i de genetiske programmene underliggende salamander regenerering9,10,11,12,13. Disse studiene har lagt til en voksende liste over kandidatgener som hittil i stor grad er ukarakterisert i sammenheng med regenerering. Målrettede mutagenesis teknikker, som CRISPR / Cas, nå tillate undersøkelse av slike gener, og slike genetiske tilnærminger er sterkt tilrettelagt av den siste sekvensering og montering av den store axolotl genom14,15,16.

Vi forsøkte å utvikle teknikker som kombinerte klassisk utviklingsbiologi med ny genetisk teknologi med det formål å dissekere mekanismene for regenerering. Metoder for å generere haploidembryoer av axolotler og andre salamander har blitt etablert i flere tiår17. Mens disse teknikkene lenge har vært kjent for å være fordeler med salamander som genetiske modell organismer18, få påfølgende genetiske studier har innlemmet haploid dyr. Vi bruker in vitro aktivering i axolotl å produsere haploid embryoer som tjener som vev donorer for pode19. Ved hjelp av embryoer som bærer fluorescerende genetiske markører, har vi utviklet pålitelige metoder for å generere lemmer avledet nesten utelukkende fra donorvev (Figur 1A). Ved å kombinere disse to teknikkene, har vi omgått den sene embryonale dødeligheten forbundet med haploidy, slik at for produksjon av fullt utviklede, transplanterte haploidlemmer (Figur 1B, Figur 1B'og Figur 2).

Ved å gjennomføre CRISPR/Cas-mediert mutagenesis hos haploidembryoer før pode for å skape kimeriske axolotler med muterte haploidlemmer, kan vi undersøke genfunksjon spesielt innenfor rammen av lemutvikling og regenerering. Dette gjør det mulig å redde lemmer fra potensielt embryonale-dødelige muterte fenotyper. Mens CRISPR / Cas mikroinjeksjon kan generere dyr som er svært mutant, slike dyr er vanligvis svært mosaikk, med en viss grad av oppbevaring av wildtype alleles og en rekke forskjellige mutasjoner på målrettede steder14,20. CRISPR-basert mutagenesis i haploidceller øker penetansen til enkelt allele tap av funksjon mutasjoner, da de ikke kan maskeres av beholdt villtype alleler. Av denne grunn brukes CRISPR-basert screening i haploidcellelinjer i økende grad til å undersøke det genetiske grunnlaget for mange cellulære prosesser21,22,23. Ved å kombinere CRISPR-basert avstamning sporing med våre haploid lem knopp pode protokoller, tilnærmingen beskrevet her kan tjene som en plattform for haploid genetiske skjermer i levende dyr20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle prosedyrer som brukes i denne protokollen ble godkjent av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017-10557) og var i samsvar med alle føderale retningslinjer og retningslinjer som regulerer bruk av virveldyr dyr. Alle dyreforsøk ble utført på Ambystoma mexicanum (axolotls) i anlegg ved Yale University.

1. Diploid Embryo Generasjon

  1. Få GFP+ diploid embryoer for å tjene som graft verter gjennom naturlig parring ved hjelp av en eller to gfp foreldre24.
  2. Samle nylagte diploid egg og legg dem i en metallsil.
  3. Skyll eggene grundig med 40% Holtfreters løsning (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3,0,2 mM CaCl2,4 mM MgSO4, pH til 7,4).
  4. Legg eggene i friske 40% Holtfreters løsning og oppbevar ved 12 °C.
    MERK: Diploid embryoer bør alltid oppnås før du går videre til haploid embryogenerasjon.

2. Haploid embryo generasjon

  1. Kvinnelig gamete donor forberedelse
    1. 48 timer før du utfører in vitro aktivering, bedøve en seksuelt moden hvit eller hvit / RFP kvinnelig axolotl ved nedsenking i 1 g / L HEPES-bufret MS-222 i 40% Holtfreter løsning25.
    2. Sørg for at dyret er fullt bedøvet etter ca 30 min av nedsenking ved å klemme halen mellom tommelen og pekefingeren. Fullt bedøvede dyr vil ikke fysisk reagere på noen klype.
    3. Forbered en løsning av humant choriongonadotropin (HCG) som inneholder 10 000 U/ml i steril saltvann.
    4. Bruk en 30 G insulinsprøyte, injiser 0,15 CC av HCG (1500 enheter) i muskulaturen til baklemmen til den bedøvede kvinnen ved 45° vinkel til midtlinjen for å unngå kontakt med ryggmargen.
    5. Returner kvinnen til frisk 40% Holtfreters løsning og plasser i et 8-12 °C kjøleskap.
    6. Etter 48 timer, returner kvinnen til romtemperatur. Legg noen steiner eller plastplanter i beholderen som overflater for egglegging.
      MERK: Kvinner injisert med HCG vil ofte sette tomme gelétilfeller i flere timer før de legger egg.
    7. Fjern steinene eller plastplantene etter at kvinnen har begynt konsekvent å legge egg.
    8. La kvinnen sitte i den tomme tanken i 30 min til 1 time.
      MERK: Kildeskatt for at dyret skal legge egg på, vil gi strengere kontroll over oocyte-samlingen.
  2. Mannlig gamete samling
    1. Mens kvinnens egglegging er stoppet, bedøve en seksuelt moden GFP + mannlig axolotl å tjene som en sæddonor, som i trinn 2.1.1.
    2. Plasser den fullt bedøvede hannen på ryggen på fuktige papirhåndklær under et disseksjonsmikroskop.
    3. Hvis eksperimentereren er høyrehendt, plasser spissen av en P1000 pipette ved foten av cloaca med høyre hånd.
    4. Plasser venstre pekefinger og tommel på venstre hånd 2-3 cm rostral til bekkenet. Klem forsiktig dyret mens du beveger fingrene mot bakbena for å skylle ut spermiske urinprøver.
    5. Samle hver som skylles ut av cloaca i en individuell microcentrifuge rør. Gjenta denne prosessen for å samle inn 6 til 10 prøver.
    6. Pipette 5,0 μL fra hver prøve på en petriskål for å inspisere kvaliteten på sæden ved hjelp av et omvendt mikroskop.
      MERK: Konsentrerte sædprøver er en melkehvit farge, vanligvis varierer fra 5 til 20 μL, og hentes vanligvis etter flere, høyere volum spermiske urinprøver ekstraheres. Sperm vil samle på bunnen av rørene i høyere volum prøver når venstre uforstyrret. Konsentrerte prøver av sunn sæd er svært motile og mister aktivitet som konsentrasjonen reduseres. Friske menn kan produsere opptil 50 μL konsentrert sædceller.
  3. Kolleksjon for kvinnelige gamete
    1. Etter å ha skaffet og bekreftet en sunn sædprøve, bedøvhcg-injisert kvinnelig axolotl som i trinn 2.1.1.
    2. Plasser den fullt bedøvede kvinnen på fuktige papirhåndklær på ryggen.
    3. Trekk ut ubefruktede egg fra kvinnen ved hjelp av en håndbevegelse som ligner på det i trinn 2.2.4.
    4. Samle eggene ved hjelp av våte tang og overfør dem til en 10 cm petriskål. Behandle egg med bestrålt sæd innen 15 min av samlingen.
  4. Mannlig gamete forberedelse og in vitro aktivering
    1. Bruk en P10 eller P20 pipette til å pipette sæden opp og ned, bryte fra hverandre klumper for å danne en homogen suspensjon.
    2. Omtrent prosentandelen av motile sperm ved å plassere en 0,5 μL dråpe ufortynnet sperm suspensjon på en petriskål lokk eller glass lysbilde og undersøke med et omvendt mikroskop.
    3. Tilsett 9,5 μL 0,1 x Marcs modifiserte Ringer-løsning (MMR; Tabell over materialer) til denne prøven for å lage en 20x sperm fortynning. Pipette forsiktig opp og ned for å blande.
    4. Med et invertert mikroskop, telle sperm i tre 1,0 μL dråper av 20x fortynnet aliquot på en petriskål deksel eller hemocytometer for å estimere sperm konsentrasjonen av ufortynnet suspensjon.
    5. Forbered sperm for bestråling ved å fortynne en aliquot av den opprinnelige sperm prøven til ca 80.000 motile celler / ml i sterile 0.1x MMR.
    6. Tell antall egg oppnådd i løpet av de siste 15 min. Tilsett 0,5 μL av den nyfortynnede sæden fra trinn 2,4,5 per egg til en petriskål. Bruk pipettespissen til å spre denne fjæringen til et 1 mm tykt lag.
    7. Bruk en plastheis, plasser prøven 4 cm fra pærene på en 254 nm crosslinker. Genetisk inaktivere sperm ved å bestråle prøven med 800.000 uJ/mm2.
    8. Bruk en P10 pipette, pipette suspensjonen på de ubefruktede eggene, belegg hvert egg med 0,25−0,5 μL av bestrålt sædceller. La eggene sitte ved romtemperatur i 30 min.
    9. Etter 30 min, oversvømme eggene med 0,1 x MMR. Plasser eggene umiddelbart i en 8-10 °C inkubator til injeksjonsvæsker neste dag eller ved 18 °C til injeksjonsvæsker innen 7 timer etter aktivering (hpa).
    10. Dejelly haploider ved hjelp av skarpe tang 30 min etter hydrering. Plasser eggene umiddelbart i en 8-10 °C inkubator til injeksjonsvæsker neste dag eller ved 18 °C til injeksjonsvæsker samme dag.

3. Haploid mutagenesis og vedlikehold

  1. CRISPR/Cas9 mikroinjeksjoner
    1. Design sgRNAs ved hjelp av CRISPRscan og syntetisere26,27.
    2. For multipleksmutagenesis, lag en beholdning av 5 sgRNAer (10 ng /μL for hvert sgRNA) og Cas9-protein (1 μg/μL). Forbered en 100 ganger fortynning av denne beholdningen (0,1 ng/μL per sgRNA, 10 ng/μL Cas9) til injeksjon. For enkeltgenet følger du protokollen som er skissert tidligere28.
    3. Injiser haploidembryoer på encellestadiet 7 hpa hvis de lagres ved 18 °C eller injiser embryoer neste dag ved cellestadiet 2–8 hvis de lagres ved 8–10 °C.
    4. Overfør embryoene til 1,0 x MMR med 20 % polysukrose 400.
    5. Hvis enkeltcelle, injiser hvert embryo med en 5 nL dråpe injeksjonsoppløsning (ca. 1/4 radius av egget) som inneholder en total masse på 0,5 pg/sgRNA og 50 pg Cas9 protein. Hvis flercellet, distribuere denne massen ved å injisere mindre volumer i flere celler.
    6. La embryoene helbrede i polysukrose 400 i minst 4 timer og maksimalt 18 timer ved 18 °C.
  2. Haploid embryo hus
    1. Overfør embryoene til 0,1 x MMR med antibiotika-antimykotisk.
    2. Hus hvert embryo i en individuell brønn av en 24-brønns plate, da noen vil dø eller utvikle seg unormalt. Vedlikehold ved 16-18 °C. Lavere temperaturer kan brukes til å forlenge utviklingen, om nødvendig.
    3. Erstatt mediene med fersk 0,1 x MMR med antibiotika-antimykotisk annenhver dag.

4. Diploid Host Embryo Forberedelse

  1. Oppretthold embryoer i gelébelegget ved 12 til 16 °C til de når trinn 22 til 26.
  2. Samle embryoer som er klare for pode, plasser dem innenfor en sil (4 mm mesh størrelse), og skyll dem forsiktig med 40% Holtfreters løsning.
  3. Overfør embryoene til filtersterilisert 0,1 x MMR som inneholder 1,5% blekemiddel i opptil 2 min. Dypp embryoene helt i blekemiddeloppløsningen og virvle dem forsiktig for å sikre at gelébelegget gir full kontakt med blekemiddelløsningen for å drepe mikrobene tilstede på embryoene.
  4. Etter 2 min, fortynn blekemiddeloppløsningen som inneholder embryoene med et likt volum av filtersterilisert 0,1 x MMR.
  5. Hell embryoene forsiktig i en blekemiddelsanitisert sil (4 mm mesh-størrelse) og skyll embryoene fem ganger med filtersterilisert 0,1 x MMR.
  6. Plasser embryoene i sterile 10 cm petriskåler med 0,1 x MMR med antibiotika for dejellying (penicillin 100 enheter/ml, streptomycin 100 μg/μL, 0,25 μg/ml, gentamicin 25 μg/ml).
  7. Fjern geléjakkene og vitellinmembranene fra GFP+-embryoer under et fluorescerendestereomikroskop.
  8. Overfør GFP+-embryoene til en ny petriskål. Minimer mengden væske som overføres fra petriskålen der de ble dejellied.
  9. Skyll GFP+ vertsembryoer med sterile 0,1 x MMR med antibiotika fire til seks ganger for å fjerne forurensninger.
  10. Plasser de rene embryoene ved 4 °C over natten før pode.
    MERK: Kjøling av embryoene gjør dem mer stive og rene separasjon av mesodermen fra endodermen mulig.

5. Haploid-diploid Chimera Generasjon

  1. Kirurgisk parabolen og media forberedelse
    1. Forbered sterile kirurgiske driftsretter ved å helle autoclaved 2% agarose i 0,1 x MMR i sterile 35 mm lettgrep petriskåler. Fyll petriskålene halvveis med agarose.
    2. Etter at agarose kjøler, bruk en steril skalpell til å kutte en 25 mm lang, skråt trau i agarose for å holde embryoene på plass.
    3. Fyll parabolen med sterile kirurgiske medier (0,1 x MMR med anti-mykoplasma 2,5 μg/ml, amfotericin B 0,25 μg/ml og ciprofloxacin 10,0 μg/ml) og kjøleskap ved 4 °C.
  2. Prosedyre for embryotransplantat
    1. Plasser en sunn haploid donor med en eller to trinns matchet GFP + diploid vert embryoer inne i trau av prechilled driftsfat som inneholder kirurgiske medier (Figur 3).
      MERK: Utfør prosedyren på et kjøletrinn (10 °C eller lavere) hvis mulig.
    2. Bruk to ultra-fine, autoklvede tang (rett spiss, tips dimensjoner 0,05 x 0,02 mm2)for å fjerne ektoderm og mesoderm lag fra verten med lem knopp nær midten (Figur 4).
      MERK: Den rektangulære vevstransplantatregionen omfatter lemproppen og strekker seg fra niende somitt til den bakre halvdelen av gjellebulen, ca 2 mm, langs den fremre bakre aksen. Langs dorsoventralaksen strekker den transplanterte regionen seg ca. 1,5 mm, inkludert somittene til like utenfor den ventrale kanten av gjellebulen. Den transplanterte regionen inkluderer all lateral plate mesoderm og lateral halvdeler av somittene, uten å forstyrre underliggende endoderm. Se figur 4 og den medfølgende videoen for mer informasjon.
    3. Sett til side vertsvevet og fjern et tilsvarende størrelsevevark fra haploiddonoren ved hjelp av de samme metodene.
    4. Plasser det haploiddonorvevarket på det tilsvarende området av donorembryoet.
    5. Fest vevet ved å dekke det med en autoklaved, rektangulær glassskår fra et knust mikroskopdekselglass og trykk forsiktig det inn i vertsembryokroppen.
    6. Vend det haploiddonorembryoet på den andre siden for å høste lemproppen for det andre vertsembryoet. Gjenta trinn 5.2.2 til og med 5.2.5.
    7. Fjern forsiktig de gjenværende overflødige vertsvevet og donorembryoet fra parabolen.
    8. La transplantatene stå med glassshardankerne på plass i 60-75 min, og kontroller hver 20 min for å sikre at glasset ikke har glidd av.
    9. Etter at vevstransplantatene fester seg helt, bruk tangene til å sakte skrelle av glasssharde ankere.
  3. Vedlikehold av Chimera
    1. Overfør de engrafted embryoer til friske kirurgiske medier og vedlikehold dem på 8−12 °C over natten for å helbrede. Individuelt husengrafted embryoer i 12 eller 24-brønnplater.
    2. Etter 36-48 timer overfører du de engrafted embryoene til sterile 0,1 x MMR antibiotika-antimykotisk. De sterke antibiotika i kirurgiske medier forårsaker toksisitet i engrafted embryoer etter 3 dager.
    3. Bytt ut mediet med fersk 0,1 x MMR og antibiotika hver 2.-3.
    4. Vedlikehold de engrafted embryoene ved 18 °C til de er i stand til å mate28.
    5. Etter 1 til 2 måneders utvikling og omsorg kan haploidlemmer scores for renhet av transplantatet ved hjelp av et fluorescerende disseksjonsmikroskop.
      MERK: Tilstedeværelsen av ikke-nevrale eller ikke-blodvert-avledede GFP-vev i lemmer er en indikator på uren pode og er ofte forbundet med unormal lemutvikling. Disse dyrene bør utelukkes fra videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utvikling av haploidembryoer kan skilles fra difterloid embryoer ved deres 'haploid syndrom' fenotype29. Ved graft-stadium viser haploidembryoer redusert krumning langs den fremre bakre aksen og ufullstendig kabinett av eggeplommepluggen (figur 3A). Et fluorescerende mikroskop kan brukes til å sikre at haploidembryoer er fri for paternalt avledet GFP-uttrykk (figur 3B).

Når grafts er rene, bør GFP-uttrykket begrenses hovedsakelig til brachial plexus, det nevrale nettverket avledet fra vertens ryggmarg, som sett i figur 2. Punctate GFP uttrykk vil også være til stede i enkeltceller som synes å være sensoriske nevroner og blod-avledede vertsceller, som migrerer inn i utviklingslemmen. Når RFP+ donorer brukes, vil haploid graft lemmer vise universell uttrykk for RFP (Figur 1B'). Gjennom utviklingen er ikke-mutageniserte haploidlemmer betydelig kortere enn de motstridende diploid forbenene i størrelsestilpassede kimeriske dyr (Figur 1B, Figur 1B'og Figur 5, n = 16 lempar, haploid gjennomsnitt = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploid gjennomsnitt = 0,667 cm, SD = ± 0,069 m, parret T-test p-verdi < 0,0001, gjennomsnittlig ratio = 0,784, SD = ± 0,113). Ikke-mutageniserte haploidlemmer genererer også fullstendig regenerert (4/4 haploid og 4/4 diftifid fullstendig regenerering, Figur 6), selv om de viser en liten forsinkelse i å nå den digitale utvekstfasen sammenlignet med diploider (n = 4 haploid, n = 4 diploid; 23 dager etter amputasjon: haploider = 3 palett og 1 digital utvekst stadium lemmer; diploids = 4 digital utvekst stadium lemmer).

Vellykket pode krever praksis, og konsistens vil variere avhengig av teknikerens mikromanipuleringsferdigheter og steril teknikk. Mislykkede og urene grafts produserer en rekke fenotyper, sett i figur 7 og figur 8. I våre hender, ca 38,7% (SD = ± 8,78%) av oocytter utvikles til normalt utviklede helooidembryoer og 11,1 % (SD = ± 5,46 %) av alle haploid-diploid grafts produsere levedyktige dyr med normalt utviklet, rent podet haploid lemmer (Figur 9).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over protokoll og et eksempel på en kimerisk axolotl. (A) Skjematisk skisserer den relative tidspunktet for skritt tatt for å oppnå diploid vert embryoer, sperm, og egg for å generere haploider og kimeriske embryoer. (B) Sammensatt sterkt bilde av en juvenil axolotl produsert av embryonale lemknopppode fra et RFP+ haploidembryo til en GFP+ diploid vert (B') Overlegg av grønne og røde fluorescerende bilder av samme 8 cm juvenil axolotl. Den haploid lem er grovt normalt, men kortere enn motstridende diploid lem. Skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende bilde av et normalt utviklet og rent podet haploidlem. GFP- haploid lem podet til en GFP + diploid vert viser GFP uttrykk mønster som synes å være begrenset til spinal nerver innervating lem (gul pil) og individuelle sensoriske nevroner og blod-avledede celler (hvite piler). Lemmen avbildet tilhørte en 4 cm juvenile. Skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av diploid og haploidembryoer. (A) Lys bilde av diploider (venstre) og haploider (høyre). Legg merke til den reduserte AP-aksen krumning og utstående endoderm av haploidembryoene (hvite piler). (B) Grønt fluorescerende bilde av de samme embryoene. GFP- haploider ble generert ved hjelp av egg fra en GFP-kvinnelig og bestrålt sæd fra en GFP +. Diploids er GFP+. Embryoer avbildet er ca stadium 2530. Staging serien. Skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk skisserer omfanget av en haploid lem knopp graft. (A) Sideveis visning av et stadium 25 haploid embryo. De stiplede linjene viser det omtrentlige området som skal transplanteres, i forhold til gjellebulen og lemknoppen. (B) Tverrgående skjematisk av trinn 25. De stiplede linjene viser omtrentligområde og vevstyper som skal fjernes fra verten og erstattes med tilsvarende haploid donorvev. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning av haploid og difippid lem lengder. (A)Scatter plot av lengdene på haploid lemmer (rosa) og motstridende diploid lemmer (grønn) av 16 tilsvarende størrelse kimeriske dyr (haploid gjennomsnitt = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploid gjennomsnitt = 0,667 cm, SD = ± 0,069 cm). Lemmer ble målt fra bunnen av zeugopod til krysset av sifre 2 og 3. (B)Scatter plot av haploid lem lengde til diploid lem lengde forholdstall av de 16 dyrene (gjennomsnittlig forhold = 0,784, SD = ± 0,113 cm). (C) Scatter plot av kroppen lengder (cm) av de 16 målte chimeras (gjennomsnittlig dyr lengde = 8,72 cm ± 0,456 cm). Dyr ble målt fra spissen av snuten til halespissen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning av regenerering i haploid og difide lemmer. (A) Haploid lem preamputasjon. (B) Den samme haploid lem etter regenerering. (C) Diploid lem preamputasjon. (D) Den samme diploid lem etter regenerering. 4/4 haploidlemmer og 4/4 diftifide lemmer regenerert med normal morfologi. Svarte stiplede linjer indikerer amputasjonsplanet. Skalastenger = 1 mm. Amputasjoner ble utført på størrelsestilpassede unge dyr (8,5 cm). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Eksempler på normal og unormal utvikling av haploidlemmer. (A) En haploid lem med grovt normal morfologi. - Jeg har ikke noe åsi. Eksempler på grafts som ikke klarte å støtte fullstendig utvikling av haploid. -Oligodactyly. (C) Mer alvorlig oligodactyly. (D) Ingen distinkte digitale strukturer er til stede. -Ingen lem. Lemmer avbildet tilhører tilsvarende størrelse juveniles (8,0 til 10 cm). Skaler stolper = 1 mm. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Eksempler på GFP+-celler i urene haploidlemtransplantater. - Jeg har ikke noeåsi. Morfologisk normal haploid graft lem med GFP + diploid celler i huden og dermis (hvit stiplet disposisjon) avslørt av fluorescerende mikroskopi. - Jeg har ikke noeå si. En podet unormal haploid lem med GFP + difloidceller som bidrar mye til dermis og hud (hvit omris). - Jeg har ikke noeåsi. En podet unormal haploid lem der epidermis har blitt erstattet med GFP + diploid celler (hvit omriss). Lemmer avbildet tilhører tilsvarende størrelse juveniles (8,0 til 10,0 cm). Skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Suksessrater for haploid embryo og haploid lem generasjon. (A) Prosent av levedyktige haploidembryoer generert ved hjelp av in vitro aktivering. Data ble samlet inn fra fem uavhengige in vitro aktiveringseksperimenter. Grønn indikerer fraksjonen av egg som produserte stadium 25 haploid embryoer som kan brukes til pode (gjennomsnitt = 38,7%, SD = ± 8,78%). Grå indikerer fraksjonen av egg som ikke viste tegn på spalting, var ikke levedyktige, eller var normale i utvikling. (B) Prosent av normalt utviklede, rent transplanterte haploidlemmer. Lilla indikerer fraksjonen av grafts som ga rene, normalt utviklet haploid lemmer (gjennomsnitt = 11,1%, SD = ± 5,46%). Grønn indikerer lemmer som utviklet seg normalt, men hadde forurensende GFP + vertsvev (gjennomsnitt = 11,3%, SD = ± 8,64%). Rød indikerer graft lemmer som ikke utviklet seg normalt (gjennomsnitt = 27,1%, SD = ± 30,3%). Blå indikerer alle podeembryoer og dyr som ikke overlevde for å fullføre lemutvikling (gjennomsnitt = 50,5%, SD = ± 31,2%). Tap av transplanterte dyr ble distribuert over sene embryonale og larvestadier. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er noen kritiske skritt i vår protokoll for å generere haploid-diploid chimeras som driftsteknikeren bør vurdere for konsistente poderesultater.

Den mest sannsynlige årsaken til haploid generasjon å mislykkes skyldes dårlig in vitro aktiveringsforhold. De riktige mengdene av motile sperm må brukes til å aktivere egg. For å forlenge motilitet, bør sædprøver alltid opprettholdes ved 4 °C. Før du påfører noen sædprøve på egg, kontroller levedyktigheten til sæden ved hjelp av et omvendt mikroskop. Helt ikke-motile sperm bør aldri brukes, og konsentrasjonen bør justeres til 80.000 motile celler / ml. For mye sperm i aktiveringstrinnet kan også forhindre normal eggutvikling. Spermgroper, som vises som små, mørke innrykk på overflaten av egget, er en fysisk indikasjon på at en sædcelle har penetrert egget og vanligvis vises 20 til 60 min etter påføring av sædceller. Egg med ti eller flere sædgroper kan ikke aktiveres riktig.

Ubefruktede egg kan aktiveres hvis de samles inn innen 15 minutter etter å ha blitt lagt under vann, plassert i en tørr petriskål og tørket grundig med papirhåndklær før spermpåføring. Alternativt, som vist i videoen, egg kan klemmes fra en hormon-injisert kvinne. Vi opplever at disse "tørre" eggene gir mer konsistente resultater, selv om vi regelmessig bruker begge metodene.

Vellykket pode krever riktig kobling av diploid embryoer med riktig iscenesatt haploid lem knoppvev. Denne protokollen inneholder en rekke tiltak for å sikre scenetilpasning. Som naturlig parring ikke alltid resultere i egg legging, HCG injeksjon for å oppnå haploid oocytes bør ikke utføres før naturlig parret kvinne begynner å legge diploid egg. Etter denne injeksjonen skal den induserte kvinnen plasseres ved redusert temperatur (8 til 12 °C), noe som vil redusere eggleggingen. Bolig hormonstimulert kvinne ved normale temperaturer kan føre til at de fleste eggene blir lagt på kort tid. Utbruddet av egglegging i en kjølt kvinne indikerer at kvinnen er klar for anestesi og oocytterekstraksjon. Oocyte aktivering må forekomme innen 15 min av oocyte ekstraksjon. Fordi aktiverte haploidembryoer vil være flere dager bak de naturlig produserte diploid embryoer i utvikling, anbefaler vi inkubering av difider embryoer ved 12 °C samtidig som den relative utviklingshastigheten av haploidene økes ved å inkubere dem ved 18 °C. Fordi det vil være noen variasjon i intervallet mellom HCG-injeksjon og egglegging av induserte kvinner, kan det være nødvendig med små justeringer i inkubasjonstemperaturene til enten haploider eller diploider slik at iscenesettelsen av verts- og donorembryoer pares på tidspunktet for pode. Embryoer bør avkjøles til 4 ° C i flere timer før pode, og dette nesten arresterer utvikling. Forskjellig tidspunktet for utbruddet av chilling haploid og diploid embryoer før pode kan aktivere scene-matching. Mens haploidembryoer skiller seg fra diploider, når både haploider og diploider trinn 21 etter nevrale folder lukkes og embryoene ligger på sidene. Som diploider, trinn 25 haploid embryoer har fremtredende gjelle og pronephric buler. Det store hodet stikker ut i en vinkel i forhold til kroppen i haploider, selv om dette er sterkt redusert i forhold til stadium 25 diploid embryoer, hvis hoder stikker ut fra kroppen i nesten en rett vinkel30.

Steril teknikk er helt avgjørende for vellykket vevpode. Sterile forhold bør opprettholdes gjennom hele eksperimentet fra haploid generasjon gjennom chimeras embryonale utvikling. Vi anbefaler at alle foreldredyr holdes i rene vannforhold uten system under eggleggingsperioden for å minimere mengden forurensende organisk materiale ved starten av prosedyren. Konsekvent, daglig fjerning av avdøde eller døende embryoer gjennom hele prosessen er viktig for å opprettholde helsen til de andre embryoene. Vi anbefaler individuelt å huse alle haploid- og chimeraembryoer for å minimere krysskontaminering.

Embryonale mikrodisseksjon og vevpode ferdigheter er ervervet gjennom praksis. Under podeprosessen er det viktig å ikke punktere eller rive selve lemproppen. Vev som fjernes fra verten og donorembryoer bør strekke seg utover lemproppen, som avbildet, for å gi en bufringsone. Hvis for lite av et område av vev er podet, vil haploidlemmer bli infiltrert av GFP + difidhud og andre vev.

En av begrensningene i denne podeteknikken er at nevrale vev og blod i lemmer er avledet fra vertskroppen. I noen sjeldne tilfeller har vi vært i stand til å generere transplanterte haploidlemmer som helt mangler alle tegn på GFP + som uttrykker nerver. I disse tilfellene var vi i stand til å erstatte nok av nevrale vev i vertsdyret med donorens. Imidlertid er slik omfattende pode vanskelig, upålitelig, og produserer ofte utviklingsavvik utenfor lemmen.

Haploidy er embryonisk dødelig i axolotl. Tilsvarende er mutasjoner i mange gener som potensielt er avgjørende for lemutvikling og regenerering, også tidlig embryonisk dødelig. Vår protokoll omgår den embryonale dødeligheten av haploidifor produksjon av eksperimentelle lemmer og kan også brukes i tilfeller der mutasjon av et kandidatregenereringsgen produserer en embryonisk dødelig fenotype. Vår lem knopp pode teknikk gir en fordel for å oppnå dette versus tidligere beskrevne metoder for lem knopp og bidrande vev pode, som det utføres under tidlig embryonal utvikling og innebærer transplantasjon av fullstendig ektoderm og mesoderm lag1,2.

Haploid lem knopp pode har tidligere blitt beskrevet; Men i denne tidligere studien ble haploide lemknopper podet ektonisk31. Mikroskopisk kjernefysisk analyse av ektopisk lemmer avledet fra disse grafts avslørte omfattende bidrag av difloid vev. Mens disse lemmer utviklet seg unormalt, de var i stand til å regenerere31. I stedet for å pode ektopisk lemknopper, erstatter vi hele endogene lemknoppen med tilsvarende haploidvev. Gjennom bruk av fluorescerende markører, er vi i stand til å visuelt identifisere haploidlemmer som er fri for diploid bidrag, med unntak av nerve og blodceller, uten å ofre haploid lem selv. Vi finner at haploid lemmer utvikler seg og regenererer normalt. Imidlertid viser lemmer der GFP + verter bidrar til andre vev enn nevrale og blodavledede celler ofte viser abnormiteter. Dermed, når du undersøker genfunksjon i haploidlemmer, må de med overdreven vertsbidrag utelukkes fra analyse før en genotype kan være forbundet med hvilken som helst fenotype observert i muterte haploidlemmer.

Nyere innovasjoner, som montering av axolotl genomet og nyere CRISPR / Cas-baserte innsettingsmetoder15,16,32, har dramatisk utvidet den genetiske formbarheten til axolotl. Metoder for å begrense genetiske manipulasjoner tempolig og romlig holde stort løfte, men deres nåværende applikasjoner er begrenset av ressursene som trengs for å generere, huse og distribuere dyrelinjer. Protokollen som er beskrevet her akselererer prosessen der konsekvensene av genetiske perturbasjoner av gener kan undersøkes i lemutvikling og regenerering. Det har vært liten karakterisering av mange av genene som er funnet å være upregulated i regenererende lemmer, og disse genene kan være involvert i en rekke viktige utviklings- og cellulære prosesser. Mens vi forventer at mange gener som kreves for lem regenerering vil også være nødvendig for lem utvikling, denne metoden kan avdekke om noen gener innblandet i regenerering har tap-av-funksjon fenotyper som er regenerering-spesifikke. CRISPR/Cas mutagenesis i axolotls produserer vanligvis allelic mosaikkisme som inkluderer beholdt villtype alleler, og denne mosaikkismen i seg selv kan betraktes som en kvantifiserbar fenotype20. Ved hjelp av neste generasjons sekvensering av amputerte originale og regenererte lemmer, kan forskere kvantifisere om haploidceller med mutasjoner i et gen av interesse fortrinnsrett tapt etter regenerering. Denne tilnærmingen kan tillate undersøkelse av regenerering fenotyper produsert ved perturbation av ellers essensielle utviklingsgener.

Haploid tap-av-funksjon genetiske skjermer lette undersøkelsen av den genetiske opprinnelsen til mange biologiske prosesser uten å måtte etablere biallelic mutant cellelinjer. Ved å kombinere haplogenesis, CRISPR/Cas9 mutagenesis og lemknopppode, gir vi en ny plattform for en haploid genetisk skjerm som utforsker lemutvikling og regenerering i et levende dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil takke Katherine Roberts for hennes omsorg for axolotlkolonien. Støtte til dette arbeidet ble gitt av Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 og 15-RMB-YALE-01) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Stipendiat F32HD086942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

Tags

Genetikk Utgave 155 axolotl haploid vev pode transplantasjon regenerering lem lem knopp chimera CRISPR Cas9 multipleks mutagenesis
Generasjon av kimeriske axolotler med mutant haploid lemmer gjennom embryonisk pode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, … More

Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter