Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Generation af chimeric Axolotls med Mutant Haploid Lemmer gennem embryonale podning

Published: January 29, 2020 doi: 10.3791/60156
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

Summary

Dette mål med denne protokol er at producere kimære axolotls med haploid forelimbs stammer fra Cas9-muttageniseret donorvæv ved hjælp af embryonale væv podning teknikker.

Abstract

Et voksende sæt af genetiske teknikker og ressourcer gør det muligt for forskere at sonde den molekylære oprindelse af evnen af nogle arter af salamandere, såsom axolotls, at regenerere hele lemmer som voksne. Her skitserer vi teknikker, der anvendes til at generere kimære axolotls med Cas9-muttagenized haploid forlemmer, der kan bruges til at udforske genfunktion og troskab lemmer regenerering. Vi kombinerer flere embryologiske og genetiske teknikker, herunder haploid generation via in vitro aktivering, CRISPR/Cas9 mutagenese, og væv podning i en protokol til at producere et unikt system til haploid genetisk screening i en model organisme af regenerering. Denne strategi reducerer antallet af dyr, rum og tid, der kræves til funktionel analyse af gener i lemmer regenerering. Dette gør det også muligt at undersøge regenereringsspecifikke funktioner af gener, der kan være nødvendige for andre væsentlige processer, såsom organogenese, vævmorfosese, og andre væsentlige embryonale processer. Den metode, der er beskrevet her, er en unik platform til at gennemføre haploid genetisk screening i et hvirveldyr modelsystem.

Introduction

Historisk set har embryonale vævspodning i padder været en vigtig teknik til at udforske grundlæggende mekanismer for udviklingsbiologi og regenerering. Den axolotl, en art af salamander, besidder en imponerende evne til at regenerere væv og komplekse strukturer såsom lemmer og organer efter skade eller amputation. Tilsvarende imponerende, de kan modtage, uden afvisning, vævgrafts fra andre personer på embryonale, unge, og voksne stadier1,2,3. Regioner af embryoner, der producerer hele strukturer såsom lemmer, haler, øjne og hoveder, og mere specifikke væv, såsom neuroektoderm og somiter, kan podes mellem embryoner til at producere kimære dyr1,2,4,5,6. I næsten et århundrede har undersøgelser af sådanne kimære dyr givet afgørende indsigt i regenerering, vævsdifferentiering, størrelseskontrol ogmønstre1,7,8.

I det sidste årti har talrige transskriptionelle undersøgelser af regenererende væv givet indsigt i de genetiske programmer, der ligger til grund for salamanderregenerering9,10,11,12,13. Disse undersøgelser har føjet til en voksende liste over kandidat gener, der til dato er stort set ukarakteriseret i forbindelse med regenerering. Målrettede mutagenese teknikker, såsom CRISPR / Cas, nu tillader undersøgelse af sådanne gener, og sådanne genetiske tilgange er stærkt lettet af den seneste sekventering og samling af den store axolotl genom14,15,16.

Vi forsøgte at udvikle teknikker, der koblede klassisk udviklingsbiologi sammen med ny genetisk teknologi med henblik på at dissekere regenereringsmekanismerne. Der er i årtier17etableret metoder til fremstilling af haploidembryoner af axolotls og andre salamandere . Mens disse teknikker længe har været bemærket at være fordele ved salamandere som genetiske model organismer18, få efterfølgende genetiske undersøgelser har indarbejdet haploid dyr. Vi bruger in vitro aktivering i axolotl til at producere haploid embryoner, der tjener som væv donorer til podning19. Ved hjælp af embryoner med fluorescerende genetiske markører har vi udviklet pålidelige metoder til at generere lemmer, der næsten udelukkende stammer fra donorvæv (figur 1A). Ved at kombinere disse to teknikker har vi omgået den sene embryonale dødelighed, der er forbundet med haploidy, hvilket giver mulighed for produktion af fuldt udviklede, podede haploidlemmer(figur 1B, figur 1B«og figur 2).

Ved at gennemføre CRISPR/Cas-medieret mutagenesis i haploid embryoner før podning for at skabe kimære axolotls med mutant haploid lemmer, kan vi undersøge genfunktion specifikt i forbindelse med lemmer udvikling og regenerering. Dette gør det muligt at redde lemmer fra potentielt embryonale-dødelige mutant fænotyper. Mens CRISPR / Cas mikroinjektion kan generere dyr, der er meget mutant, sådanne dyr er typisk meget mosaik, med en vis grad af fastholdelse af vilde arter alleler og en række forskellige mutationer på målrettede steder14,20. CRISPR-baserede mutagenese i haploidceller øger penetrance af enkelt allel tab af funktion mutationer, da de ikke kan maskeres af bevarede vilde type alleler. Derfor anvendes CRISPR-baseret screening i haploidcellelinjer i stigende grad til at undersøge det genetiske grundlag for mange cellulære processer21,22,23. Ved at kombinere CRISPR-baserede afstamning sporing med vores haploid lemmer knop podning protokoller, den tilgang, der er beskrevet her kan tjene som en platform for haploid genetiske skærme i levende dyr20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle procedurer, der anvendes i denne protokol, blev godkendt af Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017-10557) og var i overensstemmelse med alle føderale politikker og retningslinjer for anvendelse af hvirveldyr. Alle dyreforsøg blev udført på Ambystoma mexicanum (axolotls) i faciliteter på Yale University.

1. Generering af diploid embryo

  1. Anskaffe GFP + diploid embryoner til at tjene som graft værter gennem naturlig parring ved hjælp af en eller to gfp forældre24.
  2. Saml frisklagte diploid æg og læg dem i en metal sigte.
  3. Skyl æggene grundigt med 40% Holtfreteropløsning (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH til 7,4).
  4. Æggene anbringes i frisk opløsning på 40 % holtfreter, og opbevares ved 12 °C.
    BEMÆRK: Der bør altid opnås diploidembryoner, før de går videre til haploid embryogenerering.

2. Haploid embryo generation

  1. Forberedelse af kvindelige gametedonorer
    1. 48 h før udførelse in vitro aktivering, bedøve en seksuelt moden hvid eller hvid / RFP kvindelige axolotl ved nedsænkning i 1 g / L HEPES-buffered MS-222 i 40% Holtfreter opløsning25.
    2. Sørg for, at dyret er fuldt bestøvet efter ca. 30 min nedsænkning ved fast at klemme halen mellem tommel- og pegefingeren. Fuldt besigtiserede dyr vil ikke fysisk reagere på nogen knivspids.
    3. Forbered en opløsning af human tonisk gonadotropin (HCG), der indeholder 10.000 U/ml i steril saltvand.
    4. Ved hjælp af en 30 G insulin sprøjte, injicere 0,15 CC af HCG (1.500 enheder) i muskulaturen dorsale til bagdelen af den bedøvet kvinde i 45 ° vinkel til midterlinjen for at undgå kontakt med rygmarven.
    5. Rengør hunnen til frisk 40% Holtfreters opløsning og anbringes i et køleskab på 8−12 °C.
    6. Efter 48 timer skal hunnen returneres til stuetemperatur. Placer et par sten eller plastplanter i hendes beholder som overflader til æglægning.
      BEMÆRK: Hunner injiceres med HCG vil ofte deponere tomme gelé tilfælde i flere timer, før æglæggende æg.
    7. Fjern sten eller plast planter efter hunnen er begyndt konsekvent æglæggende æg.
    8. Lad hunnen sidde i den tomme tank i 30 minutter til 1 time.
      BEMÆRK: Tilbageholdelse af materialer til dyret at lægge æg på vil give mulighed for en strammere kontrol af oocyt indsamling.
  2. Indsamling af mandlige gameter
    1. Mens hunnens æglæggende er gået i stå, bedøve en seksuelt moden GFP + mandligaxolotl at tjene som en sæddonor, som i trin 2.1.1.
    2. Placer den fuldt bestøvede mand på ryggen på fugtige papirhåndklæder under et dissecting mikroskop.
    3. Hvis eksperimentatoren er højrehåndet, skal spidsen af en P1000 pipette placeres i bunden af cloaca med højre hånd.
    4. Placer venstre pegefinger og tommelfinger på venstre hånd 2−3 cm rostral til bækkenet. Klem forsigtigt dyret, mens du flytter fingrene mod bagbenene for at skylle sædurinprøver ud.
    5. Saml hver, der skylles ud af cloaca i en individuel mikrocentrifuge rør. Gentag denne proces for at indsamle 6 til 10 prøver.
    6. Pipette 5,0 μL fra hver prøve på en petriskål for at inspicere sædcellernes kvalitet ved hjælp af et omvendt mikroskop.
      BEMÆRK: Koncentrerede sædprøver er en mælkehvid farve, typisk spænder fra 5 til 20 μL, og er normalt hentes efter flere, højere volumen sædbrug urinprøver er udvundet. Sædceller vil indsamle i bunden af rørene i højere volumen prøver, når venstre uforstyrret. Koncentrerede prøver af sunde sædceller er meget motile og mister aktivitet som deres koncentration falder. Raske hanner kan producere op til 50 μL koncentreret sædceller.
  3. Kvindelig gamete samling
    1. Efter at have opnået og bekræftet en sund sædprøve, bedøve HCG-injiceret kvindelige axolotl som i trin 2.1.1.
    2. Placer den fuldt bestøvede kvinde på fugtige papirhåndklæder på ryggen.
    3. Uddrag ubefrugtede æg fra hunnen ved hjælp af en håndbevægelse svarende til den i trin 2.2.4.
    4. Saml æggene ved hjælp af våde pincet og overføre dem til en 10 cm petriskål. Behandle æg med bestrålet sæd inden for 15 min samling.
  4. Forberedelse af mandlige gameter og in vitro-aktivering
    1. Brug en P10- eller P20-pipette til at pipettere sæden op og ned, og bortset fra klumperne for at danne en homogen suspension.
    2. Tilnærme procentdelen af motile sædceller ved at placere en 0,5 μL dråbe ufortyndet sædaffjedring på et petriskållåg eller glasslid og undersøge med et omvendt mikroskop.
    3. Der tilsættes 9,5 μL 0,1 x Marcs modificerede Ringers opløsning (MMR; Tabel over materialer) til denne prøve for at lave en 20x sperm fortynding. Forsigtigt pipette op og ned for at blande.
    4. Med et omvendt mikroskop, tælle sædceller i tre 1,0 μL dråber af 20x fortyndet aliquot på en petriskål dække eller hæmocytometer at vurdere sædkoncentrationen af den ufortyndede suspension.
    5. Sædcellerne til bestråling forberedes ved at fortynde en aliquot af den oprindelige sædprøve til ca. 80.000 motileceller/ml i steril0,1 x MMR.
    6. Tæl antallet af æg, der er fremstillet inden for de seneste 15 min. Tilsæt 0,5 μL af den friskfortyndede sæd fra trin 2,4,5 pr. æg til en petriskål. Brug pipettespidsen til at sprede denne affjedring til et 1 mm tykt lag.
    7. Ved hjælp af en plastlift skal prøven placeres 4 cm fra pærerne på en 254 nm crosslinker. Gensplejse sæden genaktiveres ved at bestråle prøven med 800.000 uJ/mm2.
    8. Ved hjælp af en P10-pipette pipetterer affjedringen på de ubefrugtede æg og belægninger hvert æg med 0,25−0,5 μL bestrålet sæd. Lad æggene sidde ved stuetemperatur i 30 min.
    9. Efter 30 min, oversvømme æggene med 0,1x MMR. Placer straks æggene i en 8−10 °C-inkubator til injektioner den næste dag eller ved 18 °C for injektioner inden for 7 timer efter aktivering (hpa).
    10. Dejelly haploider ved hjælp af skarpe pincet 30 min efter hydrering. Anbring straks æggene i en 8−10 °C-inkubator til injektioner den næste dag eller ved 18 °C for injektioner samme dag.

3. Haploid Mutagenesis og vedligeholdelse

  1. CRISPR/Cas9 mikroinjektioner
    1. Design sgRNAs ved hjælp af CRISPRscan og syntetisere26,27.
    2. For multiplex mutagenese skal der udarbejdes en bestand på 5 sgRNA'er (10 ng/μL for hvert sgRNA) og Cas9-protein (1 μg/μL). Der fremstilles en 100 gange fortynding af denne bestand (0,1 ng/μL pr. sgRNA, 10 ng/μL Cas9) til injektion. For enkelt gen, høj mutation frekvens mutagenese, følg protokollen skitseret tidligere28.
    3. Tilindr et pargeembryoner i encellefase 7 hka, hvis de opbevares ved 18 °C eller injicer embryoner den næste dag i 2−8-cellestadiet, hvis de opbevares ved 8−10 °C.
    4. Fostrene overføres til 1,0 x MMR med 20% polysaccharose 400.
    5. Hvis en enkelt celle, injicerehvert embryon med en 5 nL dråbe af injektionopløsningen (ca. 1/4 radius af ægget) indeholder en samlet masse på 0,5 pg/ sgRNA og 50 pg Cas9 protein. Hvis multicellulære, distribuere denne masse ved at injicere mindre mængder i flere celler.
    6. Embryonerne må heles i polysaccharose 400 i mindst 4 timer og højst 18 timer ved 18 °C.
  2. Haploid embryo hus
    1. Overfør embryonerne til 0,1 x MMR med antimycotic antimycotic.
    2. Hus hvert embryon i en individuel brønd af en 24-brønd plade, som nogle vil dø eller udvikle unormalt. Opbevares ved 16−18 °C. Lavere temperaturer kan bruges til at forlænge udviklingen, hvis det er nødvendigt.
    3. Udskift mediet med frisk 0,1 x MMR med antimycotic antibiotika-antimycotic hver anden dag.

4. Diploid Host Embryo Forberedelse

  1. Der opvarmes embryoner i gelébelægningen ved 12 til 16 °C, indtil de når trin 22 til 26.
  2. Opsaml de embryoner, der er klar til podning, placer dem i en sigte (4 mm maskestørrelse), og skyl dem forsigtigt med 40 % Holtfreters opløsning.
  3. Overfør embryonerne i filtersteriliseret 0,1 x MMR indeholdende 1,5% blegemiddel i op til 2 min. Helt nedsænke embryonerne i blegemiddelopløsningen og hvirvle dem forsigtigt for at sikre, at gelébelægningen kommer i fuld kontakt med blegemiddelopløsningen for at dræbe mikroberne til stede på embryonerne.
  4. Efter 2 min fortyndes blegemiddelopløsningen, der indeholder embryonerne, med en lige stor mængde filtersteriliseret 0,1 x MMR.
  5. Hæld forsigtigt embryonerne i en blegemiddel-desinficeret sigte (4 mm maskestørrelse) og skyl embryonerne fem gange med filtersteriliseret 0,1 x MMR.
  6. Embryonerne anbringes i sterile 10 cm petriskåle med 0,1 x MMR med antibiotika til dejellying (penicillin 100 enheder/ml, streptomycin 100 μg/μL, 0,25 μg/ml, gentamicin 25 μg/mlL).
  7. Under et fluorescerende stereomikroskop fjernes geléfrakker og vitellinmembraner fra GFP+ embryoner ved hjælp af skarpe pincet (spidsmål 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Overfør GFP+ embryonerne til en ny petriskål. Minimer mængden af væske overført fra petriskålen, hvor de blev dejellied.
  9. Skyl GFP+ værtsembryonerne med sterile 0,1 x MMR med antibiotika fire til seks gange for at fjerne forurenende stoffer.
  10. Anbring de rene embryoner ved 4 °C natten over, før de transplanteres.
    BEMÆRK: Køling af embryonerne gør dem mere stive og rene adskillelse af mesoderm fra endoderm muligt.

5. Haploid-diploid Chimera Generation

  1. Kirurgisk fad og medieforberedelse
    1. Forbered sterile kirurgiske operationsretter ved at hælde autoclaved 2% agarose i 0,1 x MMR i sterile 35 mm easy-grip petri skåle. Fyld petriskåle halvvejs med agarose.
    2. Når agarosekølerne er kølet, skal du bruge en steril skalpel til at skære et 25 mm langt, skråt trug i agarose til at holde embryonerne på plads.
    3. Skålen fyldes med sterile kirurgiske medier (0,1 x MMR med anti-mycoplasma 2,5 μg/ml, amphotericin B 0,25 μg/ml og ciprofloxacin 10,0 μg/ml) og opbevares i køleskab ved 4 °C.
  2. Embryopodning procedure
    1. Placer en sund haploid donor med en eller to fase-matchede GFP + diploid vært embryoner inde i lavpunktet af den forkullede operationsskål, der indeholder kirurgiske medier (Figur 3).
      BEMÆRK: Udfør proceduren på en kølefase (10 °C eller lavere), hvis det er muligt.
    2. Brug to ultrafine, autoclaved pincet (lige spids, spids dimensioner 0,05 x 0,02 mm2)for at fjerne ektoderm og mesoderm lag fra værten med lemmer knop nær midten (Figur 4).
      BEMÆRK: Den rektangulære vævstransplantat region omfatter lemmer knop og strækker sig fra den niende somittil den bageste halvdel af gællen bule, omkring 2 mm, langs den anterior bageste akse. Langs dorsoventralaksen strækker det podede område sig ca. 1,5 mm, herunder somitterne, til lige uden for gællens udluftningskant. Den podede region omfatter alle lateralplade mesoderm og de laterale halvdele af somitterne, uden at forstyrre underliggende endoderm. Se figur 4 og den medfølgende video for at få flere oplysninger.
    3. Sæt værtsvævet til side og fjern et vævsark af tilsvarende størrelse fra haploiddonoren ved hjælp af de samme metoder.
    4. Anbring haploiddonorvævsarket på donorembryoets tilsvarende region.
    5. Fastgør vævet ved at dække det med et autoclaved, rektangulært glasskår fra et knust mikroskopdækkeglas og forsigtigt trykke det ind i værtsfosterets krop.
    6. Vend haploid donor embryo på sin anden side for at høste lemmer opløbet for den anden vært embryo. Gentag trin 5.2.2 til 5.2.5.
    7. Fjern forsigtigt de resterende overskydende værtsvæv og donorembryonet fra fadet.
    8. Lad transplantaterne med glasskårene ankre være på plads i 60−75 min. kontrol hver 20 min.
    9. Når vævstransplantaterne er fuldt klæbet, skal du bruge pincet til langsomt at skrælle glasskårene ankre af.
  3. Vedligeholdelse af Kimærer
    1. De podede embryoner overføres til friske kirurgiske medier, og de opbevares ved 8−12 °C natten over for at hele. Individuelt hus podet embryoner i 12 eller 24-brøndplader.
    2. Efter 36−48 h overføres de podede embryoner til sterile 0,1 x MMR antimycotic. De stærke antibiotika i de kirurgiske medier forårsager toksicitet hos podede embryoner efter 3 dage.
    3. Udskift mediet med frisk 0,1 x MMR og antibiotika hver 2-3.
    4. De podede embryoner opvarmes ved 18 °C, indtil de er i stand til at fodre28.
    5. Efter 1 til 2 måneders udvikling og pleje, haploid lemmer kan scores for renhed af transplantatet ved hjælp af en fluorescerende dissektion mikroskop.
      BEMÆRK: Tilstedeværelsen af ikke-neurale eller ikke-blod host-afledt GFP-væv i lemmer er en indikator for uren podning og er ofte forbundet med unormal lemmer udvikling. Disse dyr bør udelukkes fra yderligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udvikling af haploid embryoner kan skelnes fra diploid embryoner ved deres 'haploid syndrom' fænotype29. På graft-stage udviser haploidembryoner reduceret krumning langs den bageste efteranterakse og ufuldstændige indhegning af blommeproppen (figur 3A). Et fluorescerende mikroskop kan anvendes til at sikre, at haploidembryoner er fri for faderligt afledt GFP-udtryk (figur 3B).

Når grafts er rene, GFP udtryk bør begrænses primært til brachial plexus, neurale netværk stammer fra værtens rygmarv, som det ses i figur 2. Punctate GFP udtryk vil også være til stede i enkelte celler, der synes at være sensoriske neuroner og blod-afledte værtsceller, som migrerer ind i udviklingslandene lemmer. Når RFP+ donorer anvendes, vil haploidgraftlemmervise universelt udtryk for RFP (figur 1B«). Under hele udviklingen er ikke-mutaiserede haploide lemmer betydeligt kortere end de modsatrettede diploid forelimbs i størrelsesmatchede kimære dyr(figur 1B, figur 1B«og figur 5, n = 16 lemmer par, haploid middelværdi = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploid middelværdi = 0,667 cm, SD = ± 0,069 m, parret T-test p-værdi < 0,0001, gennemsnitligt forhold = 0,784, SD = ± 0,113). Ikke-mutaiserede haploid lemmer også fuldt regenerere (4/4 haploid og 4/4 diploid fuldstændig regenerering, Figur 6), selv om de viser en lille forsinkelse i at nå den digitale udvækst fase i forhold til diploids (n = 4 haploid, n = 4 diploid; 23 dage efter amputation: haploider = 3 palet og 1 digital udvækst fase lemmer; diploids = 4 digitale udvækst fase lemmer).

Vellykket podning kræver praksis, og konsistensvil variere afhængigt af teknikerens mikromanipulation færdigheder og steril teknik. Fejlslagne og urene transplantater giver en række fænotyper, som det fremgår af figur 7 og figur 8. I vores hænder, ca 38,7% (SD = ± 8,78%) af oocytter udvikler sig til normalt udviklede haploidembryoner og 11,1 % (SD = ± 5,46 %) af alle haploid-diploidgrafter producerer levedygtige dyr med normalt udviklede, rent podede haploidlemmer (figur 9).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over protokollen og et eksempel på en kimær axolotl. (A) Schematic skitserer den relative timing af de skridt, der træffes for at opnå diploid vært embryoner, sæd og æg med henblik på at generere haploider og kimære embryoner. (B) Sammensat lysbillede af en ung axolotl fremstillet af embryonale lemmer knop podning fra en RFP + haploid embryo til en GFP + diploid vært (B ') Overlay af grønne og røde fluorescerende billeder af samme 8 cm unge axolotl. Den haploid lemmer er groft normalt, men kortere end den modsatte diploid lemmer. Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende billede af et normalt udviklet og rent podet haploidben. GFP-haploid lemmer podet til en GFP + diploid vært viser GFP udtryk mønster, der synes at være begrænset til spinal nerver innervating lemmer (gul pil) og individuelle sensoriske neuroner og blod-afledte celler (hvide pile). Den afbildede lemmer tilhørte en 4 cm ung. Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af diploid- og haploidembryoner. (A) Lys billede af diploider (venstre) og haploider (højre). Bemærk den reducerede AP-akse krumning og den fremspringende endoderm af haploid embryoner (hvide pile). B) Grønt fluorescerende billede af de samme embryoner. GFP- haploider blev genereret ved hjælp af æg fra en GFP- hun- og bestrålet sæd fra en GFP +. Diploids er GFP+. De afbildede embryoner er ca. fase 2530. Iscenesættelse sserie. Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Skematisk skitserer omfanget af en haploid lemmer knop graft. (A) Sidebillede af et fase 25 haploid embryo. De stiplede linjer viser det omtrentlige område, der skal transplanteres, i forhold til gællen bule og lemmer opløbet. B) Tværgående skematik af fase 25. De stiplede linjer viser de omtrentlige område- og vævstyper, der skal fjernes fra værten og erstattes med det tilsvarende haploiddonorvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning af haploid og diploid lemmer længder. A) Scatter plot af længder af haploid lemmer (pink) og modsatrettede diploid lemmer (grøn) af 16 tilsvarende mellemstore kimære dyr (haploid gennemsnit = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploid gennemsnit = 0,667 cm, SD = ± 0,069 cm). Lemmer blev målt fra bunden af zeugopod til krydset af cifrene 2 og 3. (B) Punktafhaploid lemmer længde til diploid lemmer længde forhold af de 16 dyr (gennemsnitlige forhold = 0,784, SD = ± 0,113 cm). C) Punktpunkt af kroppens længder (cm) af de 16 målte kimærer (gennemsnitlig dyrelængde = 8,72 cm ± 0,456 cm). Dyrene blev målt fra spidsen af snuden til halespidsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning af regenerering i haploid og diploid lemmer. (A) Haploid lemmer pre-amputation. (B) Den samme haploid lemmer efter regenerering. (C) Diploid lemmer pre-amputation. (D) Den samme diploid lemmer efter regenerering. 4/4 haploid lemmer og 4/4 diploid lemmer regenereret med normal morfologi. Sorte stiplede linjer angiver amputationsplanet. Skalastænger = 1 mm. Amputationer blev udført på størrelsesmatchede unge dyr (8,5 cm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Eksempler på normal og unormal udvikling af haploid lemmer. (A) En haploid lemmer med groft normal morfologi. (B-E) Eksempler på grafts, der undlod at støtte fuldstændig udvikling af haploid. (B) Oligodactyly. (C) Mere alvorlige oligodactyly. (D) Der findes ingen særskilte digitale strukturer. (E) Ingen lemmer. Lemmerne afbilledet tilhører tilsvarende størrelse unge (8,0 til 10 cm). Skalastænger = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Eksempler på GFP+ celler i urene haploid lemmer grafts. A,A') Morfologisk normal haploid graft lemmer med GFP + diploid celler i huden og dermis (hvid stiplede skitse) afsløret af fluorescerende mikroskopi. B,B') En podet unormal haploid lemmer med GFP + diploid celler bidrager i udstrakt grad til dermis og hud (hvid kontur). (C,C«) En podet unormal haploid lemmer, hvor epidermis er blevet erstattet med GFP + diploid celler (hvid skitse). Lemmerne afbilledet tilhører tilsvarende størrelse unge (8,0 til 10,0 cm). Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Succesrater for haploid embryo og haploid lemmer generation. (A) Procent af levedygtige haploid embryoner genereret ved hjælp af in vitro aktivering. Data blev indsamlet fra fem uafhængige in vitro-aktiveringseksperimenter. Grøn angiver den brøkdel af æg, der producerede fase 25 haploid embryoner, der kan anvendes til podning (gennemsnit = 38,7%, SD = ± 8,78%). Grå angiver den brøkdel af æg, der ikke viste tegn på spaltning, var ikke-levedygtige, eller var normale under udvikling. (B) Procent af normalt udviklede, rent podet haploid lemmer. Lilla angiver den fraktion af grafts, der gav rene, normalt udviklede haploid lemmer (gennemsnit = 11,1%, SD = ± 5,46%). Grøn angiver lemmer, der udviklede sig normalt, men havde forurenende GFP+ værtsvæv (gennemsnit = 11,3%, SD = ± 8,64%). Rød angiver graft lemmer, der ikke udvikler sig normalt (gennemsnit = 27,1%, SD = ± 30,3%). Blå angiver alle podede embryoner og dyr, der ikke overlevede for at fuldføre udviklingen af lemmer (gennemsnit = 50,5%, SD = ± 31,2%). Tab af podede dyr blev fordelt over sene embryonale og larve stadier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er et par kritiske trin i vores protokol til generering haploid-diploid kimærer, at driftsteknikeren bør overveje for konsekvent podning resultater.

Den mest sandsynlige årsag til haploid generation til at mislykkes skyldes dårlig in vitro aktivering betingelser. De korrekte mængder motilesæd skal anvendes til at aktivere æg. For at forlænge motiliteten bør sædprøver altid opbevares ved 4 °C. Før du anvender en sædprøve på æg, skal du kontrollere sædcellernes levedygtighed ved hjælp af et omvendt mikroskop. Helt ikke-motile sædceller bør aldrig anvendes, og koncentrationen bør justeres til 80.000 motile celler/ml. For meget sæd celler i aktiveringstrinnet kan også forhindre normal ægudvikling. Sædgrube, der fremstår som små, mørke fordybninger på overfladen af ægget, er en fysisk indikation af, at en sædcelle er trængt ind i ægget og typisk vises 20 til 60 min efter påføring af sædceller. Æg med ti eller flere sædgruber kan ikke aktiverekorrekt.

Ubefrugtede æg kan aktiveres, hvis de opsamles inden for 15 minutter efter at være blevet lagt under vand, anbragt i en tør petriskål og tørres grundigt med papirhåndklæder før sædpåføring. Alternativt, som vist i videoen, æg kan presses fra en hormon-injiceret kvinde. Vi finder, at disse "tørre" æg giver mere ensartede resultater, selvom vi regelmæssigt anvender begge metoder.

Vellykket podning kræver korrekt kobling af diploid embryoner med passende iscenesat haploid lemmer opløbet væv. Denne protokol indeholder en række foranstaltninger for at sikre fasematchning. Da naturlig parring ikke altid resulterer i æglægning, HCG injektion for at opnå haploid oocytter bør ikke udføres, før den naturligt parrede hun begynder at lægge diploid æg. Efter denne injektion skal den inducerede hunner anbringes ved nedsat temperatur (8 til 12 °C), hvilket vil reducere æglægningshastigheden. Boliger hormon-stimuleret kvinde ved normale temperaturer kan resultere i de fleste af æggene bliver lagt i en kort periode. Starten af æglægning i en kølet hun indikerer, at hunnen er klar til anæstesi og oocytekstraktion. Oocyte aktivering skal ske inden for 15 min oocyt ekstraktion. Da aktiverede haploidembryoner vil være flere dage bag de naturligt producerede diploid embryoner under udvikling, anbefaler vi at inkubere diploid embryoner ved 12 °C og samtidig øge den relative udviklingshastighed for haploiderne ved at inkubere dem ved 18 °C. Da der vil være en vis variation i intervallet mellem HCG-injektion og æglægning af inducerede hunner, kan der være behov for mindre justeringer i inkubationstemperaturerne for enten haploider eller diploider, således at iscenesættelsen af værts- og donorembryoner parres på tidspunktet for podningen. Embryoner ne skal nedkøles til 4 °C i flere timer før podning, og denne næsten arresterer udvikling. Forskellige tidspunktet for debut af isnende haploid og diploid embryoner forud for podning kan muliggøre fase-matching. Mens haploid embryoner adskiller sig morfologisk fra diploider, både haploider og diploider nå fase 21 efter neurale folder tæt og embryoner ne ligger en deres sider. Ligesom diploider, fase 25 haploid embryoner har fremtrædende gælle og pronephric buler. Det store hoved stikker ud i en vinkel i forhold til kroppen i haploider, selv om dette er stærkt reduceret i forhold til fase 25 diploid embryoner, hvis hoveder stikker ud fra kroppen i næsten en ret vinkel30.

Steril teknik er helt afgørende for vellykket vævpodning. Sterile tilstande bør opretholdes gennem hele forsøget fra haploidgenerationen gennem kimærernes embryonale udvikling. Vi anbefaler, at alle forældredyr opbevares i rene, ikke-systemmæssige vandforhold i æglægningsperioden for at minimere mængden af kontaminerende organisk materiale ved procedurens begyndelse. Konsekvent, daglig fjernelse af afdøde eller døende embryoner gennem hele processen er vigtig for at opretholde sundheden for de andre embryoner. Vi anbefaler individuelt huser alle haploid- og kimærembryoner for at minimere krydskontaminering.

Embryonale mikrodædi og vævstransplantation færdigheder erhverves gennem praksis. Under podningsprocessen er det vigtigt ikke at punktere eller rive selve lemopløbet. Væv, der fjernes fra værten og donorembryoner, bør strække sig ud over lemopløbet, som det er afbilledet, for at tilvejebringe en stødpudezone. Hvis for lille af et område af væv er podet, haploid lemmer vil blive infiltreret af GFP + diploid hud og andre væv.

En af begrænsningerne i denne podning teknik er, at neurale væv og blod i lemmerne er afledt af værtskroppen. I nogle få sjældne tilfælde har vi været i stand til at generere podede haploid lemmer, som helt mangler alle tegn på GFP + udtrykke nerver. I disse tilfælde var vi i stand til at erstatte nok af det neurale væv i værtsdyret med donorens. Men, sådan omfattende podning er vanskeligt, upålidelige, og ofte producerer udviklingsmæssige abnormiteter uden for lemmer.

Haploidy er embryonal dødelig i axolotl. Tilsvarende mutationer i mange gener potentielt afgørende for lemmer udvikling og regenerering er også tidlige embryonale dødelige. Vores protokol omgår haploidys embryonale dødelighed til fremstilling af eksperimentelle lemmer og kan også anvendes i tilfælde, hvor mutation af et kandidatregenereringsgen producerer en embryonal dødelig fænotype. Vores lemmer knop podning teknik giver en fordel for at opnå dette versus tidligere beskrevet metoder til lemmer knop og bidrage væv podning, som det udføres i den tidlige embryonale udvikling og indebærer transplantation af komplet ektoderm og mesoderm lag1,2.

Haploid lemmer knop podning er tidligere blevet beskrevet; men i denne tidligere undersøgelse, haploid lemmer knopper blev podet ektopisk31. Mikroskopisk nuklear analyse af de ektopiske lemmer stammer fra disse grafts afslørede omfattende bidrag af diploid væv. Mens disse lemmer udviklet unormalt, de var i stand til at regenerere31. I stedet for podning ektopisk lemmer knopper, erstatter vi hele endogene lemmer opløbet med tilsvarende haploid væv. Ved hjælp af fluorescerende markører, er vi i stand til visuelt at identificere haploid lemmer, der er fri for diploid bidrag, med undtagelse af nerve og blodlegemer, uden at ofre haploid lemmer selv. Vi finder, at haploid lemmer udvikle og regenerere normalt. Men lemmer, hvor GFP + værter bidrage til andre væv end neurale og blod-afledte celler ofte vise abnormiteter. Når genfunktionen undersøges i haploidlemmer, skal personer med for store værtsbidrag således udelukkes fra analyse, før en genotype kan forbindes med enhver fænotype, der er observeret i mutanthaploid lemmer.

Nylige nyskabelser, ligesom samling af axolotl genom og de seneste CRISPR / Cas-baserede indsættelsesmetoder15,16,32, har dramatisk udvidet den genetiske formbarhed af axolotl. Metoder til at begrænse genetiske manipulationer tidsmæssigt og rumligt holde store løfter, men deres nuværende anvendelser er begrænset af de ressourcer, der er nødvendige for at generere, hus, og distribuere dyrelinjer. Den protokol, der er beskrevet her, fremskynder den proces, hvorved konsekvenserne af genetiske forstyrrelser af gener kan undersøges i lemmerudvikling og regenerering. Der har været lidt karakterisering af mange af de gener, der findes at være upregulated i regenererende lemmer, og disse gener kan være involveret i en række væsentlige udviklingsmæssige og cellulære processer. Mens vi forventer, at mange gener, der kræves for lemmer regenerering vil også være nødvendig for lemmer udvikling, denne metode kan afdække, om nogen gener impliceret i regenerering har tab-of-funktion fænotyper, der er regenerering-specifikke. CRISPR/Cas mutagenesis i axolotls producerer typisk allelic mosaicism, der omfatter bevarede vilde ler, og denne mosaikker selv kan betragtes som en kvantificerbar fænotype20. Ved hjælp af next generation sekventering af amputerede originale og regenererede lemmer, forskere kan kvantificere, om haploid celler med mutationer i et gen af interesse er fortrinsvis tabt efter regenerering. Denne fremgangsmåde kan gøre det muligt at undersøge regenerationfænotyper, der er fremstillet ved forstyrrelser af ellers væsentlige udviklingsgener.

Haploid tab-of-funktion genetiske skærme lette undersøgelsen af den genetiske oprindelse af mange biologiske processer uden at det er nødvendigt at etablere biallelic mutant cellelinjer. Ved at kombinere haplogenese, CRISPR/Cas9 mutagenesis, og lemmer knop podning, giver vi en ny platform for en haploid genetisk skærm udforske lemmer udvikling og regenerering i et levende dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Katherine Roberts for hendes pleje af axolotl kolonien. Finansieringen af dette arbejde blev ydet af Connecticut Innovations Regenerativ Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 og 15-RMB-YALE-01) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individuelle Postdoctoral Fællesskab F32HD086942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

Tags

Genetik axolotl haploid væv podning transplantation regenerering lemmer lemmer opløbet kimær CRISPR Cas9 multiplex mutagenesis
Generation af chimeric Axolotls med Mutant Haploid Lemmer gennem embryonale podning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, … More

Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter