Summary
Dit doel van dit protocol is het produceren van chimerische axolotls met haploïde voorpoten afgeleid van Cas9-mutagenized donorweefsel met behulp van embryonale weefsel enten technieken.
Abstract
Een groeiende reeks van genetische technieken en middelen stellen onderzoekers in staat om de moleculaire oorsprong van het vermogen van sommige soorten salamanders, zoals axolotls, te onderzoeken om hele ledematen als volwassenen te regenereren. Hier schetsen we technieken die worden gebruikt om chimerische axolotls te genereren met Cas9-mutagenized haploïde voorpoten die kunnen worden gebruikt voor het verkennen van de genfunctie en de getrouwheid van de regeneratie van ledematen. We combineren verschillende embryologische en genetische technieken, waaronder haploïde generatie via in vitro activatie, CRISPR/Cas9 mutagenese en weefseltransplantatie in één protocol om een uniek systeem voor haploïde genetische screening te produceren in een modelorganisme van regeneratie. Deze strategie vermindert het aantal dieren, ruimte en tijd die nodig is voor de functionele analyse van genen in de regeneratie van ledematen. Dit maakt het ook mogelijk om regeneratiespecifieke functies van genen te onderzoeken die nodig kunnen zijn voor andere essentiële processen, zoals organogenese, weefselmorfogenese en andere essentiële embryonale processen. De hier beschreven methode is een uniek platform voor het uitvoeren van haploïde genetische screening in een gewerveld modelsysteem.
Introduction
Historisch gezien is embryonale weefseltransplantatie bij amfibieën een belangrijke techniek geweest voor het verkennen van fundamentele mechanismen van ontwikkelingsbiologie en regeneratie. De axolotl, een soort salamander, beschikt over een indrukwekkend vermogen om weefsels en complexe structuren zoals ledematen en organen na letsel of amputatie te regenereren. Op dezelfde manier indrukwekkend, kunnen ze ontvangen, zonder afwijzing, weefselgrafts van andere individuen in embryonale, jeugdige, en volwassen stadia1,2,3. Gebieden van embryo's die hele structuren produceren, zoals ledematen, staarten, ogen en koppen, en meer specifieke weefsels, zoals neuroectoderm en somites, kunnen tussen embryo's worden geënt om chimerische dieren te produceren1,2,4,5,6. Al bijna een eeuw hebben studies van dergelijke chimerische dieren cruciale inzichten opgeleverd in regeneratie, weefseldifferentiatie, groottecontrole en patronen1,7,8.
In het laatste decennium hebben talrijke transcriptiestudies van regenererende weefsels inzichten opgeleverd in de genetische programma's die ten grondslag liggen aan salamanderregeneratie9,10,11,12,13. Deze studies hebben toegevoegd aan een groeiende lijst van kandidaat-genen die tot op heden grotendeels niet worden gekarakteriseerd in de context van regeneratie. Gerichte mutagenesetechnieken, zoals CRISPR/Cas, maken het nu mogelijk om dergelijke genen te onderzoeken, en dergelijke genetische benaderingen worden sterk vergemakkelijkt door de recente volgorde en assemblage van het grote axolotlgenoom14,15,16.
We zochten naar technieken die klassieke ontwikkelingsbiologie koppelen aan nieuwe genetische technologie met het oog op het ontleden van de mechanismen van regeneratie. Methoden voor het genereren van haploïde embryo's van axolotls en andere salamanders zijn vastgesteld voor decennia17. Hoewel deze technieken al lang worden opgemerkt als voordelen van salamanders als genetisch model organismen18, weinig latere genetische studies hebben opgenomen haploïde dieren. We gebruiken in vitro activatie in de axolotl om haploïde embryo's te produceren die dienen als weefseldonoren voor het entenvan 19. Met behulp van embryo's met fluorescerende genetische markers hebben we betrouwbare methoden ontwikkeld voor het genereren van ledematen die bijna volledig afkomstig zijn van donorweefsels(figuur 1A). Door deze twee technieken te combineren, hebben we de late embryonale letaliteit die gepaard gaat met haploidy omzeild, waardoor volledig ontwikkelde, geënte haploïde ledematen(figuur 1B, figuur 1B'en figuur 2) kunnen worden aangenomen.
Door CRISPR/Cas-gemedieerde mutagenese in haploïde embryo's uit te voeren voordat we worden geënt om chimerische axolotls met gemuteerde haploïde ledematen te maken, kunnen we de genfunctie specifiek onderzoeken in de context van de ontwikkeling en regeneratie van ledematen. Dit maakt het mogelijk om ledematen te redden van potentieel embryonaal-dodelijke mutanten. Hoewel CRISPR/Cas micro-injectie dieren kan genereren die zeer mutant zijn, zijn dergelijke dieren meestal zeer mozaïek, met een zekere mate van behoud van wildtype allelen en een verscheidenheid aan verschillende mutaties op gerichte locaties14,20. CRISPR-gebaseerde mutagenese in haploïde cellen verhoogt de penetrance van enkel allele verlies-van-functie mutaties, omdat ze niet kunnen worden gemaskeerd door behouden wildtype allelen. Om deze reden wordt crispr-gebaseerde screening in haploïde cellijnen steeds vaker gebruikt om de genetische basis van veel cellulaire processen te onderzoeken21,22,23. Door crispr-gebaseerde afstamming tracering te combineren met onze haploïde ledematen knop entandprotocollen, kan de hier beschreven aanpak dienen als een platform voor haploïde genetische schermen bij levende dieren20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentele procedures die in dit protocol werden gebruikt, werden goedgekeurd door het Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017-10557) en waren in overeenstemming met alle federale beleidslijnen en richtlijnen voor het gebruik van gewervelde dieren. Alle dierproeven werden uitgevoerd op Ambystoma mexicanum (axolotls) in faciliteiten aan de Yale University.
1. Diploïde Embryo Generatie
- Verkrijg GFP+ diploïde embryo's om te dienen als graft hosts door middel van natuurlijke paring met behulp van een of twee gfp ouders24.
- Verzamel vers gelegde diploïde eieren en leg ze in een metalen zeef.
- Spoel de eieren grondig af met 40% Holtfreter's oplossing (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH tot 7,4).
- Plaats de eieren in verse 40% Holtfreter's oplossing en bewaar op 12 °C.
OPMERKING: Diploïde embryo's moeten altijd worden verkregen voordat ze overgaan tot haploïde embryogeneratie.
2. Haploid Embryo Generatie
- Vrouwelijke gamete donorvoorbereiding
- 48 uur voordat u in vitro activatie uitvoert, een seksueel volwassen witte of witte/RFP vrouwelijke axolotl te verdoven door onderdompeling in 1 g/L HEPES-gebufferde MS-222 in 40% Holtfreter's oplossing25.
- Zorg ervoor dat het dier volledig is verdoofd na ongeveer 30 min onderdompeling door stevig knijpen zijn staart tussen de duim en wijsvinger. Volledig verdoofde dieren zullen niet fysiek reageren op een snuifje.
- Bereid een oplossing voor van menselijke chorionische gonadotropine (HCG) met 10.000 U/mL in steriele zoutoplossing.
- Injecteer met behulp van een 30 G insulinespuit 0,15 CC HCG (1.500 eenheden) in de spierrug van het spierstelsel aan de achterpoot van het verdoofde vrouwtje in een hoek van 45° tot de middellijn om contact met het ruggenmerg te voorkomen.
- Breng het vrouwtje terug naar verse 40% Holtfreter's oplossing en plaats in een 8−12 °C koelkast.
- Na 48 uur, terug te keren het vrouwtje op kamertemperatuur. Plaats een paar stenen of plastic planten in haar container als oppervlakken voor het leggen van eieren.
OPMERKING: Vrouwtjes geïnjecteerd met HCG zal vaak deponeren lege gelei gevallen voor enkele uren voor het leggen van eieren. - Verwijder de stenen of plastic planten nadat het vrouwtje is begonnen consequent eieren te leggen.
- Laat het vrouwtje 30 min tot 1 uur in de lege tank zitten.
OPMERKING: Het achterhouden van materialen waar het dier eieren op kan leggen, zorgt voor een strakkere controle van de eicelverzameling.
- Mannelijke gamete inzameling
- Terwijl het legen van het vrouwtje is vastgelopen, verdooft een seksueel volwassen GFP+ mannelijke axolotl om als spermadonor te dienen, zoals in stap 2.1.1.
- Leg het volledig verdoofde mannetje op zijn rug op vochtige papieren handdoeken onder een ontledende microscoop.
- Als de experimentator rechtshandig is, plaats dan de punt van een P1000 pipet aan de voet van de cloaca met de rechterhand.
- Plaats de linker wijsvinger en duim van de linkerhand 2−3 cm rostral op het bekken. Knijp het dier zachtjes terwijl u de vingers naar de achterpoten beweegt om spermaurinemonsters weg te spoelen.
- Verzamel elk dat uit de cloaca wordt gespoeld in een individuele microcentrifugebuis. Herhaal dit proces om 6 tot 10 monsters te verzamelen.
- Pipetteer 5,0 μL van elk monster op een petrischaaltje om de kwaliteit van het sperma te inspecteren met behulp van een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Geconcentreerde spermamonsters zijn een melkachtige witte kleur, variëren meestal van 5 tot 20 μL, en worden meestal opgehaald nadat verschillende spermaurinemonsters met een hoger volume worden geëxtraheerd. Sperma zal verzamelen aan de onderkant van de buizen in een hoger volume monsters wanneer ongestoord. Geconcentreerde monsters van gezonde sperma zijn zeer motile en verliezen activiteit als hun concentratie afneemt. Gezonde mannetjes kunnen tot 50 μL geconcentreerd sperma produceren.
- Vrouwelijke gamete collectie
- Na het verkrijgen en bevestigen van een gezond spermamonster, de HCG-geïnjecteerde vrouwelijke axolotl te verdoven als in stap 2.1.1.
- Leg het volledig verdoofde vrouwtje op vochtige papieren handdoeken op haar rug.
- Extract onbevruchte eieren van het vrouwtje met behulp van een hand beweging vergelijkbaar met die in stap 2.2.4.
- Verzamel de eieren met behulp van natte tangen en breng ze naar een 10 cm petrischaal. Behandel eieren met bestraald sperma binnen 15 min van de collectie.
- Mannelijke gamete voorbereiding en in vitro activering
- Gebruik een P10 of P20 pipet om het sperma op en neer te pipeten, het breken van de klonten om een homogene suspensie te vormen.
- Benaderen van het percentage motile sperma door het plaatsen van een 0,5 μL druppel onverdunde sperma suspensie op een petrischaaldeksel of glazen schuif en onderzoeken met een omgekeerde microscoop.
- Voeg 9,5 μL van de gewijzigde Ringer-oplossing van 0,1x Marc (MMR; Materiaaltabel) om dit monster om een 20x sperma verdunning te maken. Voorzichtig pipet op en neer te mengen.
- Met een omgekeerde microscoop, tel het sperma in drie 1,0 μL druppels van de 20x verdunde aliquot op een petrischaaldeksel of hemocytometer om de spermaconcentratie van de onverdunde suspensie te schatten.
- Bereid het sperma voor op bestraling door een aliquot van het originele spermamonster te verdunnen tot ongeveer 80.000 motile cellen/mL in steriele 0,1x MMR.
- Tel het aantal eieren verkregen in het verleden 15 min. Voeg 0,5 μL van het vers verdunde sperma van stap 2,4,5 per ei cel toe aan een petrischaaltje. Gebruik de pipettip om deze vering in een dikke laag van 1 mm te verspreiden.
- Plaats met behulp van een kunststof lift het monster op 4 cm van de bollen van een 254 nm crosslinker. Activeer het sperma genetisch door het monster te bestralen met 800.000 uJ/mm2.
- Met behulp van een P10 pipet, pipet de suspensie op de onbevruchte eieren, coating elk ei met 0,25−0,5 μL bestraald sperma. Laat de eieren 30 min op kamertemperatuur zitten.
- Na 30 min, overspoelde de eieren met 0.1x MMR. Plaats de eieren onmiddellijk in een couveuse van 8−10 °C voor injecties de volgende dag of bij 18 °C voor injecties binnen 7 uur na activering (hpa).
- Dejelly haploïden met behulp van scherpe tangen 30 min na hydratatie. Plaats de eieren onmiddellijk in een couveuse van 8−10 °C voor injecties de volgende dag of bij 18 °C voor injecties op dezelfde dag.
3. Haploid Mutagenese en Onderhoud
- CRISPR/Cas9 micro-injecties
- Ontwerp sgRNAs met crisprscan en synthetiseren26,27.
- Voor multiplexmutagenese bereidt u een bestand van 5 sgRNAs (10 ng/μL voor elke sgRNA) en Cas9-eiwit (1 μg/μL). Bereid een 100-voudige verdunning van deze voorraad (0,1 ng/μL per sgRNA, 10 ng/μL Cas9) voor injectie. Voor enkel gen, hoge mutatiefrequentie mutagenese, volg het protocol geschetst eerder28.
- Injecteer haploïde embryo's in het eencellige stadium van 7 pk bij 18 °C of injecteer de volgende dag in het 2−8-celstadium embryo's als ze bij 8−10 °C worden opgeslagen.
- Breng de embryo's over naar 1,0x MMR met 20% polysucrose 400.
- Als eencellige, injecteer elk embryo met een 5 nL druppel van de injectieoplossing (ongeveer 1/4 straal van het ei) met een totale massa van 0,5 pg/sgRNA en 50 pg Cas9 eiwit. Als meercellig, distribueer deze massa door het injecteren van kleinere volumes in meerdere cellen.
- Laat de embryo's genezen in de polysacharose 400 voor een minimum van 4 uur en een maximum van 18 uur bij 18 °C.
- Haploïde embryobehuizing
- Breng de embryo's over naar 0,1x MMR met antibiotica-antimycotisch.
- Huis elk embryo in een individuele put van een 24-put plaat, zoals sommige zullen sterven of abnormaal ontwikkelen. Handhaven bij 16−18 °C. Lagere temperaturen kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling te verlengen, indien nodig.
- Vervang de media door verse 0.1x MMR met antibiotica-antimycotic om de andere dag.
4. Diploïde gastheer embryovoorbereiding
- Houd embryo's in de geleicoating op 12 tot 16 °C tot stadium 22 tot en met 26.
- Verzamel de embryo's die klaar zijn om te worden geënt, plaats ze in een zeef (4 mm maaswijdte) en spoel ze voorzichtig af met de oplossing van 40% Holtfreter.
- Breng de embryo's over in een gesteriliseerd 0,1x MMR met 1,5% bleekmiddel tot 2 min. Dompel de embryo's volledig onder in de bleekoplossing en wervel ze zachtjes om ervoor te zorgen dat de geleicoating volledig in contact komt met de bleekoplossing om de microben te doden op de embryo's.
- Verdun na 2 min de bleekoplossing met de embryo's met een gelijk volume van filtergesteriliseerde 0,1x MMR.
- Giet de embryo's voorzichtig in een gebleekte zeef (4 mm maaswijdte) en spoel de embryo's vijf keer af met een gesteriliseerde 0,1x MMR.
- Plaats de embryo's in steriele 10 cm petrischaaltjes met 0,1x MMR met antibiotica voor dejellying (penicilline 100 eenheden/mL, streptomycine 100 μg/μL, 0,25 μg/mL, gentamicin 25 μg/mL).
- Verwijder onder een fluorescerende stereomicroscoop de geleilagen en vitellinemembranen uit GFP+-embryo's met behulp van scherpe tangen (tipafmetingen 0,05 x 0,01 mm2).
- Breng de GFP+ embryo's over naar een nieuw petrischaaltje. Minimaliseer de hoeveelheid vloeistof die wordt overgebracht van de petrischaal waar ze werden ontleed.
- Spoel de GFP+ gastheerembryo's met steriele 0,1x MMR met antibiotica vier tot zes keer af om verontreinigingen te verwijderen.
- Plaats de schone embryo's 's nachts op 4 °C voor het enten.
LET OP: Het koelen van de embryo's maakt ze stijver en schonescheiding van het mesoderm van het endoderm haalbaar.
5. Haploid-diploïde Chimera Generatie
- Chirurgische schotel en mediavoorbereiding
- Bereid steriele chirurgische chirurgische operatieschotels door autoclaved 2% agarose in 0,1x MMR in steriele 35 mm easy-grip petrischalen te gieten. Vul de petrischaaltjes halverwege met agarose.
- Nadat de agarose afkoelt, gebruik je een steriele scalpel om een 25 mm lange, schuine trog in de agarose te snijden om de embryo's op hun plaats te houden.
- Vul de schotel met steriele chirurgische media (0,1x MMR met anti-mycoplasma 2,5 μg/mL, amphotericine B 0,25 μg/mL en ciprofloxacine 10,0 μg/mL) en koel bij 4 °C.
- Embryo-entingsprocedure
- Plaats één gezonde haploïde donor met een of twee fase-matched GFP+ diploïde gastheerembryo's in de trog van het voorgekoelde operatiegerecht dat chirurgische media bevat (figuur 3).
OPMERKING: Voer de procedure uit op een koelstadium (10 °C of lager) indien mogelijk. - Gebruik twee ultrafijne, autoclaved forceps (rechte punt, tipafmetingen 0,05 x 0,02 mm2) om de ectoderm- en mesodermlagen van de gastheer te verwijderen met de ledemaatknop in de buurt van het midden(figuur 4).
OPMERKING: Het rechthoekige weefseltransplantatengebied omvat de ledemaatknop en strekt zich uit van het negende somite tot de achterste helft van de kieuwuitstulping, ongeveer 2 mm, langs de voorste achterste as. Langs de dorsoventral as, het geënte gebied overspant ongeveer 1,5 mm, met inbegrip van de somites tot net voorbij de ventrale rand van de kieuw uitstulping. Het geënte gebied omvat alle laterale plaatmesoderm en de laterale helften van de somites, zonder het onderliggende endoderm te verstoren. Zie figuur 4 en de bijbehorende video voor meer informatie. - Zet het gastheerweefsel opzij en verwijder een even groot weefselvel van de haploïdedonor met dezelfde methoden.
- Plaats het haploïde donorweefselblad op het overeenkomstige gebied van het donorembryo.
- Zet het weefsel vast door het te bedekken met een autoclaved, rechthoekige glasscherf van een geplette microscoop deksel glas en zachtjes te drukken in de gastheer embryo lichaam.
- Draai het haploïde donorembryo naar de andere kant om de ledematenknop voor het tweede gastheerembryo te oogsten. Herhaal stap 5.2.2 tot en met 5.2.5.
- Verwijder voorzichtig de resterende overtollige gastheerweefsels en het donorembryo uit de schotel.
- Laat de grafts met de glasscherven ankers op hun plaats voor 60-75 min, het controleren van elke 20 min om ervoor te zorgen dat het glas niet is uitgegleden.
- Nadat de weefseltransplantaat volledig hechten, gebruikt u de tangen om de glasscherven langzaam af te pellen.
- Plaats één gezonde haploïde donor met een of twee fase-matched GFP+ diploïde gastheerembryo's in de trog van het voorgekoelde operatiegerecht dat chirurgische media bevat (figuur 3).
- Chimera onderhoud
- Breng de geënte embryo's over naar verse chirurgische media en bewaar ze 's nachts op 8−12 °C om te genezen. Individueel huis geënte embryo's in 12 of 24-put platen.
- Breng na 36−48 uur de geënte embryo's over naar steriel 0,1x MMR antibioticum antimycotisch. De sterke antibiotica in de chirurgische media veroorzaken toxiciteit in geënte embryo's na 3 dagen.
- Vervang de media elke 2−3 dagen door verse 0,1x MMR en antibiotica.
- Houd de engrafted embryo's op 18 °C totdat ze28kunnen voeden .
- Na 1 tot 2 maanden van ontwikkeling en zorg, kunnen haploïde ledematen worden gescoord voor zuiverheid van het transplantaat met behulp van een fluorescerende dissectiemicroscoop.
OPMERKING: De aanwezigheid van niet-neurale of niet-bloed gastheer-afgeleide GFP-weefsel in ledematen is een indicator van onzuivere enten en tenen en wordt vaak geassocieerd met abnormale ontwikkeling van ledematen. Deze dieren moeten worden uitgesloten van verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ontwikkelen van haploïde embryo's kan worden onderscheiden van diploïde embryo's door hun 'haploïde syndroom' fenotype29. In het graft-stadium vertonen haploïde embryo's een verminderde kromming langs de voorste-achterste as en onvolledige behuizing van de dooierplug (figuur 3A). Een fluorescerende microscoop kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat haploïde embryo's vrij zijn van vaderlijk afgeleide GFP-expressie(figuur 3B).
Wanneer grafts schoon zijn, moet de GFP-expressie in de eerste plaats worden beperkt tot de brachial plexus, het neurale netwerk dat is afgeleid van het ruggenmerg van de gastheer, zoals te zien is in figuur 2. Punctate GFP expressie zal ook aanwezig zijn in enkele cellen die lijken te zijn sensorische neuronen en bloed afgeleide gastheercellen, die migreren naar de zich ontwikkelende ledemaat. Wanneer RFP+ donoren worden gebruikt, zullen haploïde graft ledematen universele expressie van RFP(figuur 1B'laten zien). Gedurende de ontwikkeling zijn niet-gemuteriseerde haploïde ledematen aanzienlijk korter dan de tegengestelde diploïde voorpoten in op maat afgestemde chimerische dieren(figuur 1B, figuur 1B'en figuur 5, n = 16 ledematen, haploïde gemiddelde = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, diploïde gemiddelde = 0,667 cm, SD = ± 0,069 m, gekoppelde T-test p-value < 0,0001, gemiddelde verhouding = 0,784, SD = ± ± 0,113). Niet-mutagene haploïde ledematen ook volledig regenereren (4/4 haploïde en 4/4 diploïde volledige regeneratie, Figuur 6), hoewel ze een lichte vertraging vertonen bij het bereiken van de digitale uitgroeifase in vergelijking met diploïden (n = 4 haploïde, n = 4 diploïde; 23 dagen na amputatie: haploïden = 3 palet en 1 digitale uitgroeifase ledematen; diploïden = 4 digitale uitgroeifase ledematen).
Succesvolle enting vereist oefening, en consistentie zal variëren afhankelijk van de technicus micromanipulatie vaardigheden en steriele techniek. Mislukte en onzuivere grafts produceren een verscheidenheid aan fenotypes, zoals te zien is in figuur 7 en figuur 8. In onze handen, ongeveer 38,7% (SD = ± 8,78%) van eicellen ontwikkelen zich tot normaal ontwikkelde haploïde embryo's en 11,1% (SD = ± 5,46%) van alle haploïde-diploïde grafts produceren levensvatbare dieren met normaal ontwikkelde, schoon geënte haploïde ledematen (figuur 9).
Figuur 1: Overzicht van het protocol en een voorbeeld van een chimeric axolotl. (A) Schematisch met een beschrijving van de relatieve timing van de stappen die zijn genomen om diploïde gastheer embryo's, sperma en eieren te verkrijgen om haploïden en chimaerische embryo's te genereren. (B) Samengesteld helder beeld van een jonge axolotl geproduceerd door embryonale ledemaat knop entting van een RFP + haploïde embryo naar een GFP + diploïde gastheer (B') Overlay van groene en rode fluorescerende beelden van dezelfde 8 cm jonge axolotl. De haploïde ledemaat is schromeloos normaal, maar korter dan de tegengestelde diploïde ledemaat. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Fluorescerend beeld van een normaal ontwikkelde en schoon geënte haploïde ledemaat. GFP- haploïde ledemaat geënt op een GFP + diploïde gastheer toont GFP expressie patroon dat lijkt te zijn beperkt tot spinale zenuwen innervating de ledemaat (gele pijl) en individuele sensorische neuronen en bloed afgeleide cellen (witte pijlen). De afgebeelde ledemaat behoorde tot een 4 cm jeugd. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van diploïde en haploïde embryo's. (A) Licht beeld van diploïden (links) en haploids (rechts). Let op de verminderde AP-as kromming en de uitstekende endoderm van de haploïde embryo's (witte pijlen). (B) Groen fluorescerend beeld van dezelfde embryo's. GFP-haploïden werden gegenereerd met eieren uit een GFP- vrouwelijk en bestraald sperma uit een GFP+. Diploids zijn GFP+. Embryo's afgebeeld zijn ongeveer fase 2530. Staging serie. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Schematisch waarin de omvang van een haploïde ledematenknoptransplantaat wordt beschreven. (A) Laterale weergave van een stadium 25 haploïde embryo. De stippellijnen tonen het geschatte gebied dat moet worden getransplanteerd, ten opzichte van de kieuw uitstulping en ledematen knop. b) Transversale schema van fase 25. De stippellijnen tonen het geschatte gebied en weefseltypen die uit de gastheer moeten worden verwijderd en moeten worden vervangen door het bijbehorende haploïde donorweefsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van haploïde en diploïde ledematen lengtes. (A) Spreiding plot van de lengtes van haploïde ledematen (roze) en tegengestelde diploïde ledematen (groen) van 16 even grote chimerische dieren (haploïde gemiddelde = 0,522 cm, SD = ± ± 0,087 cm, diploïde gemiddelde = 0,667 cm, SD = ± 0,069 cm). Ledematen werden gemeten vanaf de basis van de zeugopod tot de kruising van de cijfers 2 en 3. (B) Spreidingplot van de lengte van de haploïde ledematen tot diploïde ledematenlengteverhoudingen van de 16 dieren (gemiddelde verhouding = 0,784, SD = ± ± 0,113 cm). (C) Spreidingsplot van de lichaamslengtes (cm) van de 16 gemeten chimaera 's (gemiddelde dierlijke lengte = 8,72 cm ± 0,456 cm). De dieren werden gemeten vanaf het puntje van de snuit tot de staarttip. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Vergelijking van regeneratie in haploïde en diploïde ledematen. (A) Haploïde ledemaat pre-amputatie. (B) Dezelfde haploïde ledemaat na regeneratie. (C) Diploïde ledemaat pre-amputatie. (D) Dezelfde diploïde ledemaat na regeneratie. 4/4 haploïde ledematen en 4/4 diploïde ledematen geregenereerd met normale morfologie. Zwarte stippellijnen geven het amputatievlak aan. Schaalstaven = 1 mm. Amputaties werden uitgevoerd op maatgematchte jonge dieren (8,5 cm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Voorbeelden van normale en abnormale ontwikkeling van haploïde ledematen. (A) Een haploïde ledemaat met een grove normale morfologie. (B-E) Voorbeelden van grafts die de volledige ontwikkeling van haploïde niet ondersteunden. b) Oligodactyly. (C) Meer ernstige oligodactyly. (D) Er zijn geen verschillende digitale structuren aanwezig. (E) Geen ledemaat. De afgebeelde ledematen behoren tot jongeren van vergelijkbare grootte (8,0 tot 10 cm). Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Voorbeelden van GFP+ cellen in onzuivere haploïde ledemaatgrafts. (A,A') Morfologische normale haploïde graft ledemaat met GFP + diploïde cellen in de huid en dermis (wit gestippelde omtrek) onthuld door fluorescerende microscopie. (B,B") Een geënte abnormale haploïde ledemaat met GFP + diploïde cellen die op grote schaal bijdragen aan de dermis en huid (witte omtrek). c,c) Een geënte abnormale haploïde ledemaat waarin de opperhuid is vervangen door GFP + diploïde cellen (witte omtrek). De afgebeelde ledematen behoren tot jongeren van vergelijkbare grootte (8,0 tot 10,0 cm). Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Slagingspercentages van haploïde embryo en haploïde ledemaat generatie. (A) Percentage van levensvatbare haploïde embryo's gegenereerd met behulp van in vitro activatie. Gegevens werden verzameld uit vijf onafhankelijke in vitro activeringsexperimenten. Groen geeft de fractie van de eieren aan die stadium 25 haploïde embryo's produceerden die gebruikt konden worden voor enting (gemiddelde = 38,7%, SD = ± ± 8,78%). Grijs geeft de fractie van de eieren die geen tekenen van decolleté vertonen, niet levensvatbaar waren of normaal waren in ontwikkeling. (B) Procent van de normaal ontwikkelde, schoon geënte haploïde ledematen. Paars geeft de fractie van grafts aan die schone, normaal ontwikkelde haploïde ledematen opleverden (gemiddelde = 11,1%, SD = ± ± 5,46%). Groen geeft ledematen aan die zich normaal ontwikkelden maar vervuilende GFP+ gastheerweefsels hadden (gemiddelde = 11,3%, SD = ± 8,64%). Rood duidt op graft ledematen die zich niet normaal ontwikkelden (gemiddelde = 27,1%, SD = ± ± 30,3%). Blauw geeft alle geënte embryo's en dieren aan die niet overleefden om de ontwikkeling van ledematen te voltooien (gemiddelde = 50,5%, SD = ± ± 31,2%). Het verlies van geënte dieren werd verdeeld over late embryonale en larve stadia. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een paar kritische stappen in ons protocol voor het genereren van haploid-diploïde chimaera's die de operationele technicus moet overwegen voor consistente enting resultaten.
De meest waarschijnlijke reden voor haploïde generatie te mislukken is te wijten aan slechte in vitro activering voorwaarden. De juiste hoeveelheden motile sperma moeten worden gebruikt om eieren te activeren. Om de beweeglijkheid te verlengen, moeten spermamonsters altijd bij 4 °C worden gehouden. Controleer voordat u een spermamonster op eieren toepast, de levensvatbaarheid van het sperma met behulp van een omgekeerde microscoop. Volledig niet-motile sperma mag nooit worden gebruikt, en de concentratie moet worden aangepast aan 80.000 motile cellen / mL. Te veel sperma in de activeringstap kan ook de normale eiontwikkeling voorkomen. Zaadcellen, die verschijnen als kleine, donkere inkepingen op het oppervlak van het ei, zijn een fysieke indicatie dat een spermacel het ei is binnengedrongen en meestal 20 tot 60 min verschijnen na het aanbrengen van sperma. Eieren met tien of meer zaadkuilen kunnen niet goed worden geactiveerd.
Onbevruchte eieren kunnen worden geactiveerd indien verzameld binnen 15 minuten na te zijn gelegd onder water, geplaatst in een droge petrischaal, en grondig gedroogd met papieren handdoeken voorafgaand aan sperma aanvraag. Als alternatief, zoals getoond in de video, eieren kunnen worden geperst uit een hormoon geïnjecteerd evrouwtje. We vinden dat deze "droge" eieren meer consistente resultaten geven, hoewel we regelmatig beide methoden gebruiken.
Succesvolle enting vereist de juiste koppeling van diploïde embryo's met de juiste geënsceneerde haploïde ledemaat knopweefsel. Dit protocol bevat een aantal maatregelen om fase-matching te garanderen. Aangezien natuurlijke paring niet altijd leidt tot het leggen van eieren, mag hcg-injectie om haploïde eicellen te verkrijgen niet worden uitgevoerd totdat het natuurlijk gedekte vrouwtje diploïde eieren begint te leggen. Na deze injectie moet het geïnduceerde vrouwtje bij een lagere temperatuur worden gehuisvest (8 tot 12 °C), waardoor de legsnelheid van eieren wordt verminderd. Huisvesting van de hormoon-gestimuleerde vrouw bij normale temperaturen kan resulteren in de meeste van de eieren worden gelegd in een korte periode van tijd. Het begin van het leggen van eieren in een gekoeld vrouwtje geeft aan dat het vrouwtje klaar is voor anesthesie en eicelextractie. De activering van eicel moet plaatsvinden binnen 15 min van de eicelextractie. Omdat geactiveerde haploïde embryo's enkele dagen achter lopen op de natuurlijk geproduceerde diploïde embryo's in ontwikkeling, raden we aan diploïde embryo's bij 12 °C uit te broeden en tegelijkertijd de relatieve ontwikkelingssnelheid van de haploïden te verhogen door ze uit te broeden bij 18 °C. Omdat er enige variatie in het interval tussen HCG-injectie en eileggen van geïnduceerde vrouwtjes zal zijn, kunnen lichte aanpassingen in de incubatietemperaturen van haploïden of diploïden nodig zijn, zodat de enscenering van gastheer- en donorembryo's op het moment van enting wordt gekoppeld. Embryo's moeten gedurende enkele uren voorafgaand aan de enting tot 4 °C worden gekoeld, en dit arresteert de ontwikkeling bijna. Het verschil tussen het begin van het begin van haploïde en diploïde embryo's voorafgaand aan het enten kan fasematching mogelijk maken. Terwijl haploïde embryo's morflogisch verschillen van diploïden, bereiken zowel haploïden als diploïden fase 21 nadat de neurale plooien sluiten en de embryo's één hun kanten liggen. Net als diploïden, fase 25 haploïde embryo's hebben prominente kieuw en proneph uitstulpingen. De grote kop steekt uit in een hoek ten opzichte van het lichaam in haploïden, hoewel dit sterk is verminderd ten opzichte van stadium 25 diploïde embryo's, waarvan de hoofden uitsteken uit het lichaam op bijna een rechte hoek30.
Steriele techniek is absoluut cruciaal voor succesvolle weefseltransplantatie. Steriele omstandigheden moeten worden gehandhaafd door het geheel van het experiment van haploïde generatie door de embryonale ontwikkeling van de chimaerische ontwikkeling. Wij raden aan om alle moederdieren tijdens de legperiode in schone, niet-systeemwateromstandigheden te houden om de hoeveelheid vervuilend organisch materiaal aan het begin van de procedure te minimaliseren. Consistente, dagelijkse verwijdering van overleden of stervende embryo's door het hele proces is belangrijk voor het behoud van de gezondheid van de andere embryo's. Wij raden u aan alle haploïde en chimaeraembryo's individueel te huisvesten om kruisbesmetting te minimaliseren.
Embryonale microdissectie en weefseltransplantatie vaardigheden worden verworven door middel van de praktijk. Tijdens het entingsproces is het belangrijk om de ledemaatknop zelf niet te doorboren of te scheuren. Weefsels die uit de gastheer worden verwijderd en donorembryo's moeten verder reiken dan de kiemknop, zoals afgebeeld, om een bufferzone te bieden. Als te klein van een gebied van weefsel wordt geënt, zullen de haploïde ledematen worden geïnfiltreerd door GFP + diploïde huid en andere weefsels.
Een van de beperkingen van deze enting techniek is dat het neurale weefsel en bloed in de ledematen zijn afgeleid van het gastheerlichaam. In een paar zeldzame gevallen zijn we in staat geweest om geënte haploïde ledematen te genereren die volledig alle tekenen van GFP+ uitenzenuwen missen. In deze gevallen konden we genoeg van het zenuwweefsel in het gastdier vervangen door dat van de donor. Echter, dergelijke uitgebreide enten is moeilijk, onbetrouwbaar, en produceert vaak ontwikkelingsafwijkingen buiten de ledemaat.
Haploidy is embryonaal dodelijk in de axolotl. Op dezelfde manier zijn mutaties in veel genen die essentieel zijn voor de ontwikkeling en regeneratie van ledematen ook vroege embryonale dodelijk. Ons protocol omzeilt de embryonale letaliteit van haploidy voor de productie van experimentele ledematen en kan ook worden gebruikt in gevallen waarin mutatie van een kandidaat regeneratiegen een embryonaal dodelijk fenotype produceert. Onze limb bud enting techniek biedt een voordeel voor het bereiken van dit ten opzichte van eerder beschreven methoden van ledematen knop en bijdragenweefsel enten, zoals het wordt uitgevoerd tijdens de vroege embryonale ontwikkeling en omvat de transplantatie van volledige ectoderm en mesoderm lagen1,2.
Haploïde ledematen knop enting is eerder beschreven; echter, in deze eerdere studie, haploïde ledematen knoppen werden ectopically geënt31. Microscopische nucleaire analyse van de buitenbaarmoederlijke ledematen afgeleid van deze grafts bleek uitgebreide bijdragen van diploïde weefsel. Terwijl deze ledematen zich abnormaal ontwikkelden, waren ze in staat om31te regenereren. In plaats van het enten van buitenbaarmoederlijke ledematen knoppen, vervangen we de hele endogene ledemaat knop met gelijkwaardige haploïde weefsels. Door het gebruik van fluorescerende markers zijn we in staat om haploïde ledematen visueel te identificeren die vrij zijn van diploïde bijdragen, met uitzondering van zenuw- en bloedcellen, zonder de haploïde ledemaat zelf op te offeren. We vinden dat haploïde ledematen zich normaal ontwikkelen en regenereren. Echter, ledematen waarin GFP + gastheren bijdragen aan weefsels andere dan neurale en bloed afgeleide cellen vertonen vaak afwijkingen. Bij het onderzoeken van de genfunctie in haploïde ledematen moeten mensen met overmatige gastbijdragen dus van analyse worden uitgesloten voordat een genotype kan worden geassocieerd met een fenotype dat in gemuteerde haploïde ledematen wordt waargenomen.
Recente innovaties, zoals de assemblage van het axolotlgenoom en recente CRISPR/Cas-gebaseerde invoegmethoden15,16,32, hebben de genetische kneedbaarheid van de axolotl drastisch uitgebreid. Methoden om genetische manipulaties tijdelijk en ruimtelijk te beperken, houden grote belofte, maar hun huidige toepassingen worden beperkt door de middelen die nodig zijn om dierlijke lijnen te genereren, te huisvesten en te distribueren. Het hier beschreven protocol versnelt het proces waarbij de gevolgen van genetische verstoringen van genen kunnen worden onderzocht in de ontwikkeling en regeneratie van ledematen. Er is weinig karakterisering van veel van de genen gevonden te zijn upregulated in regenererende ledematen, en deze genen kunnen worden betrokken bij een verscheidenheid van essentiële ontwikkelings- en cellulaire processen. Hoewel we verwachten dat veel genen die nodig zijn voor de regeneratie van ledematen ook nodig zullen zijn voor de ontwikkeling van ledematen, kan deze methode ontdekken of genen die betrokken zijn bij regeneratie verlies-van-functie fenotypes hebben die regeneratie-specifiek zijn. CRISPR/Cas mutagenese in axolotls produceert meestal allelic mosaicisme dat behouden wildtype allelen omvat, en dit mosaicisme zelf kan worden beschouwd als een kwantificeerbaar fenotype20. Met behulp van Next Generation Sequencing van geamputeerde originele en geregenereerde ledematen, onderzoekers kunnen kwantificeren of haploïde cellen met mutaties in een gen van belang bij voorkeur verloren gaan na regeneratie. Deze aanpak kan het mogelijk maken het onderzoek van regeneratie fenotypes geproduceerd door verstoring van anders essentiële ontwikkelingsgenen.
Haploid verlies-van-functie genetische schermen vergemakkelijken het onderzoek van de genetische oorsprong van vele biologische processen zonder de noodzaak om biallelic mutant cellijnen vast te stellen. Door haplogenese, CRISPR/Cas9 mutagenese en limb bud enting te combineren, bieden we een nieuw platform voor een haploïde genetisch scherm dat de ontwikkeling en regeneratie van ledematen in een levend dier verkent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Katherine Roberts bedanken voor haar zorg voor de axolotl kolonie. Financiering voor dit werk werd verstrekt door de Connecticut Innovations Regeneratieve Geneeskunde Research Fund (15RMA-YALE-09 en 15-RMB-YALE-01) en de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individuele Postdoctorale Fellowship F32HD086942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J.
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J.
- Armstrong, B.
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
