Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج ثقافة الجهاز البطانية القرنية الخنازير باستخدام أزرار القرنية الانقسام

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/60171
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE), 2University Eye Hospital, Center For Ophthalmology, University Hospital Tübingen

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول خطوه بخطوه لاعداد وزراعه الخنازير الانقسام أزرار القرنية. كما يظهر هذا النموذج العضوي المزروع عاده معدلات وفيات الخلايا في غضون 15 يوما ، مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية ، فانه يمثل النموذج الأول الذي يسمح للزراعة طويلة الأجل من القرنيات غير البشرية دون أضافه السامة ديكسان.

Abstract

يرتبط البحث التجريبي علي الخلايا البطانية القرنية مع العديد من الصعوبات. القرنيات المتبرعة البشرية نادره ونادرا ما تكون متاحه للتحقيقات التجريبية لأنها عاده ما تكون ضرورية لزرع. الخلايا البطانية الثقافات في كثير من الأحيان لا تترجم بشكل جيد في الحالات المجرية. نظرا للخصائص الهيكلية الحيوية لقرنيات غير البشرية ، فان تورم الورم اللحمية اثناء الزراعة يؤدي إلى فقدان الخلايا البطانية القرنية الكبيرة ، مما يجعل من الصعب القيام بالزراعة لفتره طويلة من الزمن. وتستخدم عوامل أزاله الترسبات مثل دكديكان لمواجهه هذه الاستجابة. ومع ذلك ، فانها تسبب أيضا فقدان الخلايا البطانية كبيره. ولذلك ، تم إنشاء نموذج ثقافة الجهاز السابق الجسم الذي لا يتطلب وكلاء القاع. واستخدمت عيون الخنازير من مسلخ محلي لاعداد أزرار القرنية الانقسام. بعد التراص الجزئي القرنية ، تمت أزاله الطبقات الخارجية من القرنية (ظهاره ، طبقه بومان ، وأجزاء من سدي). هذا يقلل بشكل كبير من فقدان الخلايا البطانية القرنية الناجمة عن تورم الورم الدموي الضخم وطي غشاء Descemet في جميع انحاء فترات زراعه أطول ويحسن الحفاظ العام علي طبقه الخلايا البطانية. وتبع ذلك أزاله القرنية الكاملة اللاحقة من الجزء المتبقي من زر القرنية من لمبة العين والزراعة. وتم تقييم كثافة الخلايا البطانية في أوقات المتابعة التي تصل إلى 15 يوما بعد الاعداد (اي الأيام 1 و 8 و 15) باستخدام المجهر الضوئي. تقنيه التحضير المستخدمة تسمح بحفظ أفضل لطبقه الخلايا البطانية التي يتم تمكينها من خلال تورم الانسجه الأقل تضخما ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الانحدار البطيء والخطي في انقسام أزرار القرنية مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية. وبما ان هذا النموذج الموحد للبحوث الذي يزرع عاده للمرة الاولي يسمح بزراعه مستقره لمده أسبوعين علي الأقل ، فهو بديل قيم لقرنيات المتبرعين البشريين بالنسبة للتحقيقات المستقبلية للعوامل الخارجية المختلفة فيما يتعلق الآثار علي بطانة القرنية.

Introduction

إجراءات زراعه القرنية هي من بين المزارع الأكثر شيوعا في جميع انحاء العالم1. كما ان هناك نقص حاد في القرنيات المتبرعين البشرية ، والبحوث التجريبية التي تعالج الخلايا البطانية القرنية في القرنيات البشرية من الصعب أداء1. ومع ذلك ، فان إدخال حلول الري وغيرها من المواد المستخدمة داخل العين ، والاجهزه البصرية المطاطية ، فضلا عن الاداات والتقنيات الجراحية (علي سبيل المثال ، أدوات الاستحلاب والتقنيات ، والطاقة الموجات فوق الصوتية) يتطلب تحقيقات صحيحه ومستفيضة فيما يتعلق بآثارها علي بطانة القرنية قبل الاستخدام السريري.

توجد بدائل قليله لقرنيات المتبرعين البشريين للبحوث. نماذج البحوث الحيوانية هي قيمه جدا ولكن في نفس الوقت تستهلك الموارد جدا وبشكل متزايد شكك أخلاقيا. العيب الرئيسي في ثقافات الخلايا الانبوبيه هو ترجمتها المحدودة للعين البشرية. النتائج التي تم الحصول عليها من ثقافات الخلايا يمكن ان تكون غير لائقه في ظروف الجسم الحي ، لان الخلايا قد تمر بمرحله انتقاليه البطانة الغشائية (EMT) ، مما يؤدي إلى الليفية مثل المورفولوجية الناجمة عن فقدان قطبيه الخلية والتغيرات في شكل الخلية والجينات التعبير2.

في حين ذكرت السابقة نماذج الجسم القديم زراعه فترات تصل إلى 120 h فقط ، وهي تقنيه اعداد رواية لإنشاء نموذج ثقافة القرنية الغشاء الوركي الجهاز عن طريق ذبح القرنيات الخنازير الطازجة لمده 15 يوما علي الأقل وقد أدخلت مؤخرا3 ،4،5،6. إذا تمت أزاله ظهاره القرنية وأجزاء من ستروما (حوالي 300 μm في المجموع) من القرنية قبل الزراعة ، يتم تقليل تورم سدي في انقسام أزرار القرنية مما ادي إلى فقدان اقل الخلايا البطانية وبطانية الحفاظ عليها بشكل جيد طبقه الخلية بعد ما يصل إلى 15 يوما ، في حين ان أزرار القرنية غير المنقسمة تظهر خسارة كبيره في الخلايا البطانية بسبب تورم الورم المفتول وتشكيل طيات Descemet. عاده ما تستخدم بنوك العيون عوامل التشبع بالهواء الخافض للحرارة مثل ديكدكان لتقليل تورم القرنيات قبل الزرع. ومع ذلك, وأظهرت هذه العوامل للحث علي زيادة فقدان الخلايا البطانية7,8,9.

تهدف هذه المقالة إلى تصور هذا نموذج البحوث السابقة الفيفو الموحدة في بروتوكول مفصل خطوه بخطوه من أجل تمكين المحققين في المستقبل لاجراء البحوث علي بطانة القرنية باستخدام أزرار القرنية الانقسام. ويمثل هذا النموذج طريقه مباشره لاختبار المواد والتقنيات المستخدمة داخل العين ، مثل الاجهزه البصرية المطاطية ، وحلول الري ، وطاقة الموجات فوق الصوتية ، أو غيرها من الإجراءات التي يكون فيها بطانة القرنية من الفائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية الاخلاقيه لمؤسستنا. وفقا للنظام الأساسي للجنة المراجعة الاخلاقيه لمؤسستنا ، لم يكن يجب الحصول علي موافقه اخلاقيه قبل التجارب ، كما تم الحصول علي جميع القرنيات الخنازير من المسلخ المحلي.

1-ثقافة الجهاز

  1. اعداد عيون الخنازير.
    1. من المسلخ المحلي ، والحصول علي عيون الخنازير التي تم ازالتها بعد الوفاة بفترة وجيزة ولكن قبل المعالجة الحرارية. نقل العينين إلى المختبر ومعالجتها في غضون ساعات قليله. اثناء النقل ، والحفاظ علي العينين في درجه حرارة الغرفة (حوالي 21 درجه مئوية) قبل المعالجة.
    2. أزاله جميع الادازل المدارية (عضلات العين ، الملتحمة ، الانسجه الدهنية) قبل التطهير باستخدام مقص العين وملقط كوليبري. افصل وتخلص من جميع العينين مع الصدمات الواضحة ، والاضرار الخارجية (علي سبيل المثال ، قطع سكين) ، أو البصرية القرنية المدن.
    3. اعداد 5 ٪ اليود--تلفزيوني--الحل (1:20) في كوب معقمه عن طريق أضافه 3 مل من 7.5 ٪ البوفيدون اليود إلى 57 ml من الفوسفات مخزنه المحلول الملحي (تلفزيوني). أيضا اعداد كاس معقمه منفصلة تحتوي علي 60 mL نقيه التلفزيونية.
      ملاحظه: المبلغ الإجمالي لاستخدام اليود--تلفزيوني--الحل وحجم الكاس يعتمد علي عدد من القرنيات التي سيتم تشريحها. خمسه إلى سته عيون تتطلب ما يقرب من 60 مل من 5 ٪-اليود-تلفزيوني-الحل ليتم تطهيرها بشكل صحيح.
    4. وضع خمسه إلى سته عيون في الحل 5 ٪-اليود-بسته دولارات لما مجموعه 5 دقيقه لتطهير بشكل صحيح سطح العينين. يحرك بعناية كل دقيقه لضمان الغمر الكامل لسطح العينين وتطهيرها تماما في محلول اليود.
    5. بعد 5 دقائق ، نقل العينين تطهيرها إلى كوب أعدت مليئه بالخدمات التلفزيونية البحتة. مره أخرى ، وأثاره بعناية لضمان يغسل اليود--تلفزيوني--الحل بعيدا عن سطح العينين.
      ملاحظه: تنفيذ هذه الخطوة علي مقعد نظيفه لمنع تلوث العينين تطهيرها.
  2. اعداد لوحات ثقافة الخلية.
    ملاحظه: تنفيذ الخطوات التالية علي مقاعد البدلاء نظيفه مع تدفق الهواء الرقائقي ثابت.
    1. ذوبان 2 مل من مصل الساق الجنينية (FCS). ملء حقنه (5 مل) مع FCS باستخدام cannula حاده. إفراغ حقنه من خلال فلتر حقنه (0.22 μm) لمنع كونتاميناتيونوف البكتيرية المحتملة FCS إلى 80 مل من المتوسطة الثقافة الحرة ديكسسين (المتوسط الأساسي الحد الأدنى [م] مع أملاح Earle ، البنسلين/ستربتوميسين ، L-الجلوتامين [200 mM] ، امهوتيريسين ب [250 ميكروغرام/مل] ، العازلة Hepes [1 م] [50x] ، ناهكو3، والماء المقطر). اجتت الخليط لضمان توزيع الركيزة حتى.
    2. ملء كل بئر من 12 لوحه ثقافة الخلية جيدا مع 3 مل من خليط الركيزة.
  3. أداء التشريح والحضانة.
    ملاحظه: تنفيذ هذه الخطوة علي مقعد نظيف. لا تلمس بطانة القرنية مع اي أدوات.
    1. نقل لمبة العين من الكاس مع تلفزيوني في حامل لمبة العين مع القرنية التي تواجه صعودا ووضعه تحت المجهر الجراحية العيون. استخدام حقنه مليئه 0.9 ٪ NaCl لتطبيق بعض الشفط قليلا علي العين علي حامل لمبة العين لتثبيت العين في موقف لتشريح.
    2. استخدام منقب (ø 7.5 mm) التي تحتوي علي بطانة موحده ، والتي تضمن عمق المرتجف لن يتجاوز 300 μm ، لقطع سطحيه في القرنية المركزية (الشكل 1ا).
    3. استخدم ملقط كوليبري ومشرط أحادي الاستخدام مع شفره مثلثه الشكل لقطع وأزاله جزء القرنية الجزئي للنمرة أفقيا من خلال سدي. تجاهل جزء القرنية المفصولة تتكون من ظهاره القرنية ، وطبقه بومان ، وجزء من سدي.
      ملاحظه: الحفاظ بدقه علي اتجاه القطع الأفقي للحصول علي سمك حتى من سدي المتبقية.
    4. سطحيا مكان 10-0 خياطه (10-0 بولياميد 6) في سدي لتكون قادره علي التفريق بين بطانية من الجانب المفتول خلال التجارب (الشكل 1ب). منع تغلغل بطانة القرنية. تجاهل لمبة العين إذا تم اختراق بطانة.
      ملاحظه: اختراق بطانة القرنية مع ابره خياطه ستكون مرئية ، كما السائل من غرفه العين الاماميه سوف يتسرب من خلال قناه خياطه.
    5. استخدام منقب دون ترصيع لدفع قطع المبرومة إلى عمق كامل حتى يتم التوصل إلى غرفه العين الاماميه (الشكل 1ج). ويمكن النظر إلى انخفاض واضح في المقاومة وتسرب السوائل من غرفه العين الاماميه بعد اختراق كامل من القرنية.
      ملاحظه: استخدام سكين الهوكي إذا بقي زر القرنية الانقسام المرفقة علي جانب واحد من زر القرنية الانقسام بعد التراص.
    6. نقل زر القرنية الانقسام التي تم الحصول عليها ، والتي تتكون الآن من جزء من سدي (الشكل 2) ، وغشاء Descemet ، وبطانة القرنية ، في الثقافة المتوسطة (الثقافة المتوسطة انا + FCS ، انظر القسم 1.2) في 12 لوحه ثقافة الخلية جيدا مع الموسومة الجانب الذي يواجه أسفل, بحيث بطانة القرنية هو مواجهه.
      ملاحظه: إذا كان الجانب البطانية التي تواجه لأسفل ، قد تتلف البطانة.
    7. تعيين رقم فردي لكل زر القرنية الانقسام لتحديد الهوية اثناء المتابعة وتسميه الآبار علي لوحه ثقافة الخلية وفقا لذلك.
    8. احتضان لوحات ثقافة الخلايا المملوءة في حاضنه في ظل الظروف القياسية عند درجه حرارة 37 درجه مئوية ، و 5 ٪ CO2 ورطوبة الهواء النسبية من 95 ٪. تغيير الثقافة المتوسطة (الثقافة المتوسطة I + FCS) في اليوم 8 إذا تم تجاوز فتره حضانة من 7 أيام.
      ملاحظه: تم التحقق من صحة اجراء الحضانة باستخدام أزرار القرنية الانقسام لمده تصل إلى 15 يوما.

Figure 1
الشكل 1: تشريح القرنية الخنازير للحصول علي أزرار القرنية الانقسام. (ا) بعد التخلص من القرنية باستخدام التريفين مع بطانة لقطع إلى عمق 300 ميكرومتر وأزاله ظهاره وأجزاء من الانسجه اللحمية ، (ب) يتم وضع خياطه بشكل سطحي في ستروما دون تغلغل القرنية. بطانة لتحديد لاحق للجانب اللحمية. (ج) يتبع الفصل الكامل من القرنية المتبقية (د) أزاله زر القرنية الانقسام الذي تم الحصول عليه من لمبة العين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

2. المجهر وفحص البطانة

  1. اجراء فحص غير ملون.
    ملاحظه: يمكن اجراء الفحص غير الملون عده مرات (علي سبيل المثال ، في المتابعة الاسبوعيه في اليوم 1 و 8 و 15). ومع ذلك ، فان العد غير الملون يسمح فقط بتقييم كثافة الخلايا البطانية ، وليس المعلمات المورفولوجية.
    1. ملء 3 مل من محلول الملح متوازن الوتر (hBSS ، انظر التكوين في جدول المواد) في كل بئر من 12 لوحه ثقافة الخلية جيدا. وضع بعناية زر واحد القرنية الانقسام في hBSS للحث علي تورم في الخلايا البطانية القرنية وتحسين الرؤية للخلايا لعد الخلايا.
      ملاحظه: تاكد من ان الجانب البطانية يواجه اتجاه المجهر. إذا تم استخدام المجهر النقيض من المرحلة المقلوبة ، يجب ان يواجه الجانب البطانية للأسفل. اثناء وجوده ، لا ينبغي نقل لوحه الثقافة لمنع تلف الخلايا البطانية.
    2. السماح للخلايا تنتفخ لمده 1-2 دقيقه قبل التقاط صوره لبطانة مع الكاميرا المرفقة بالمجهر. خذ ما لا يقل عن ثلاث صور لثلاثه مناطق مختلفه علي الأقل من أجل الحصول علي انطباع ممثل عن الحالة الفعلية لبطانة القرنية. أضافه شريط مقياس مع الحقيقي لحجم طول 100 μm للتحليل في وقت لاحق من كثافة الخلايا البطانية القرنية والمعلمات المورفولوجية.
    3. لمنع الضرر الاسموزي ، قم بازاله زر القرنية المنقسم من hBSS بعد حد اقصي 5 دقائق ونقله مره أخرى إلى الوسط الثقافي3.
  2. أداء الفحص الملون.
    ملاحظه: تلطيخ ينهي التجارب ، كما المواد تلطيخ المستخدمة هي سامه للخلايا. ولذلك ، يمكن ان يتم تلطيخ فقط في نهاية فتره المراقبة لتقييم المعلمات المورفولوجية (الأرقام التقويم ، وتشكيلات الوردة ، الخلايا الملونة الحمراء الاليزارين).
    1. اعداد 0.25 ٪ التريان الحل الأزرق و 0.2 ٪ الاليزارين الأحمر S الحل لاجراء تلطيخ.
      1. بالنسبة للحل الأزرق 0.25 ٪ التريان ، تمييع 0.4 ٪ التريان الحل الأزرق مع محلول NaCl 0.9 ٪.
        ملاحظه: علي سبيل المثال ، للحصول علي 20 مل من 0.25 ٪ التريكان الحل الأزرق ، تمييع 12.5 mL من المحلول الأزرق 0.4 ٪ تريبان مع 7.5 mL من الحل 0.9 ٪ NaCl. يمكن تخزين محلول التريكان الأزرق في درجه حرارة الغرفة لعده أسابيع أو أشهر.
      2. للحصول علي 0.2 ٪ الاليزارين الأحمر s حل تذوب 100 ملغ من مسحوق s الاليزارين الأحمر في 50 mL من محلول كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تحت التحريك المستمر والتدفئة إلى 50 درجه مئوية علي مغناطيس تحريك لوحه مع وظيفة التدفئة. لأزاله الرواسب المحتملة ، قم بتصفية الحل الذي تم الحصول عليه. ضبط درجه الحموضة من الحل الأحمر الاليزارين S إلى 4.2 الأس الهيدروجيني عن طريق أضافه هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك وفقا لذلك.
        ملاحظه: قبل كل تطبيق من الحل الأحمر الاليزارين S تاكد من تصحيح الرقم الهيدروجيني إلى 4.2 وانه لا توجد رواسب في الحل. قد يتم تخزين الحل في درجه حرارة الغرفة. لا تخزن المحلول لمده أطول من 4 أسابيع.
    2. وضع أزرار القرنية الانقسام في اطباق بيتري مع الجانب البطانية التي تواجه صعودا من أجل وصمه عار الخلايا البطانية. استخدام ماصه لتنقيط ببطء 0.25 ٪ التريكان الحل الأزرق قطره عن طريق إسقاط علي بطانة القرنية ل 90 s.
      ملاحظه: الأزرق التريان يسمح بتحديد خلايا القرنية التالفة مع غشاء نفاذيه لأنه البقع نوى بهم.
    3. شطف بعناية زر القرنية الانقسام 3x في 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم في كوب زجاجي صغير. مره أخرى ، واستخدام ماصه لتنقيط ببطء 0.2 ٪ الاليزارين الأحمر S الحل قطره عن طريق إسقاط علي بطانة القرنية ل 90 s.
      ملاحظه: اللون الأحمر Alizarin S البقع غشاء Descemet ، مما يساعد علي تسليط الضوء علي حدود الخلية في الخلايا البطانية القرنية غير التالفة وتسليط الضوء علي الخلايا المدمرة عندما يصبح غشاء Descemet الكامنة مرئية. كما انه يتيح التعرف بسهوله علي المناطق المدمرة الأكبر حجما.
    4. لفحص بطانة القرنية الملطخة اتبع الخطوات الموضحة للعد غير الملون في القسم 2.1.

3. تحليل كثافة الخلايا البطانية القرنية والمعلمات المورفولوجية

  1. مشروع عد المربعات علي الصور باستخدام برنامج تحريرالرسومات (جدول المواد).
    1. فتح البرنامج وفتح صوره لبطانة القرنية عن طريق تحديد ملف | الفتح | حدد.
    2. مشروع مربع مع صحيح لقياس طول الجانب من 100 μm علي الصورة.
      ملاحظه: يمكن تجاهل الخطوات التالية من المقطع 3-1-2 إذا كان برنامج العرض يسمح لإسقاط مربعات العد علي الصورة. الطول الجانبي لمربع يعتمد علي دقه الصور الملتقطة بكاميرا المجهر ويمكن حسابه مع شريط المقياس.
      1. اقتصاص شريط المقياس من الصورة الملتقطة بالمجهر: حدد أداه السرادق المستطيلة علي شريط الاداات أو اضغط M، ثم قم بتحديد شريط المقياس ، ثم حدد تحرير | اقتصاص أو اضغط Ctrl + X.
      2. انقر فوق ملف | جديد (أو اضغط Ctrl + N). في الإطار القادم حدد الحافظة في القائمة المنسدلة نوع المستند . عدد البيكسلات المعروضة هو الطول الجانبي لمربع العد. لاحظ بكسل المطابق للصور الأخرى ثم انقر فوق موافق.
      3. حدد ملف | جديد (أو Ctrl + N). ادراج العرض والطول (بالبكسل) من مربع العد في النافذة القادمة وفقا لطول شريط المقياس. حدد لون الخلفية الأبيض، ثم اضغط OK.
      4. انقر علي تحديد | حدد الكل (أو Ctrl + A). حدد تحرير | نسخ (أو Ctrl + C).
      5. حدد صوره بطانة القرنية المفتوحة في الخطوة 3-1-1. حدد تحرير | ألصق (أو Ctrl + V) لادراج المربع علي صوره بطانة القرنية.
      6. حدد طبقه المربع واضبط الشفافية. اختر الطبقة | نمط الطبقة | خيارات المزج | تعيين التعتيم إلى 30 ٪ | حسنا، لا باس
      7. حفظ الصورة مع مربع المتوقعة مع الصحيح لقياس طول الجانب من 100 μm. كرر مع الصور الأخرى اللازمة للتحليل.
  2. تقييم كثافة الخلايا البطانية والمعلمات المورفولوجية.
    1. فتح الصور مع الساحات المتوقعة في ImageJ (الإصدار 1.50 i) واستخدام CellCounter المساعد لحساب الخلايا داخل المربع. افتح ImageJ ، حدد ملف | فتح (أو Ctrl + O) | حدد الصورة.
      ملاحظه: ImageJ والمساعد CellCounter هي مجانية متاحه للتحميل علي الإنترنت.
    2. اختر الإضافات | Cell_Counter | عداد الخلية | تهيئه. عد الخلايا البطانية وسجل النتيجة. علي جانبي الساحة ، عد الخلايا التي تقطعها حافه المربع. لا تحسب الخلايا المقطوعة علي الجانبين الآخرين.
    3. تحليل ما لا يقل عن سته مربعات لكل قرنيه من مناطق مختلفه (علي سبيل المثال ، ثلاث صور ، مربعين في الصورة) وتحديد متوسط كثافة الخلايا البطانية القرنية لكل مربع (100 μm2). استقراء كثافة الخلايا البطانية لكل 100 ميكرومتر2 إلى 1 مم2 بالضرب بواسطة 100.
  3. لتقييم التغيرات المورفولوجية ، عد الأرقام التقويم (اجتماع مشترك من ≥ 4 خلايا/حدود الخلية بدلا من ثلاثه) ، وتشكيلات الوردة (المظهر المميز علي شكل الوردة ، خمسه أو أكثر من الخلايا المشعة المحيطة بخليه مدمره ) ، أو المناطق الحمراء الاليزارين (الخلايا المدمرة) في المربعات المتوقعة.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، قد يكون من المفيد استخدام مربعات أكبر (علي سبيل المثال ، 200 x 200 μm2) للتحليل المورفولوجية في عينات محفوظه جيدا للحصول علي نتائج أكثر تمثيلا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقنيه التشريح المعروضة تعني الازاله الجزئية للانسجه اللحمية ، مما يؤدي إلى ارق عينه القرنية التالي التورم الأقل تضخما (الشكل 1 والشكل 2). اقل تورم الورم يدفع اقل القص وقرصه القوات التي لها تاثير سلبي علي بطانة القرنية ، مما تسبب في انخفاض معدلات فقدان الخلايا البطانية6. تظهر أزرار القرنية المنقسمة طبقه الخلايا البطانية التي تم الحفاظ عليها بشكل أفضل بعد 15 يوما من الزراعة مقارنه بأزرار القرنية غير المنقسمة والعينات القرنية الكاملة ، والتي تعكس اقل فقدان للخلايا البطانية وعدد اقل من الإصلاح الأرقام (≥ 4 خلايا/حدود الخلية الملتصقة بدلا من ثلاثه) ، وتشكيلات الوردة (خمسه أو أكثر من الخلايا المرتبة شعاعيا الاجتماع في بقعه واحده) ، و الاليزارين الأحمر (دمرت) الخلايا بعد 15 يوما6.

علي مدي فتره 15 يوما ، تظهر أزرار القرنية المنقسمة انخفاضا مطردا في كثافة الخلايا البطانية مع فقدان الخلايا البطانية توزيع المتوسطة الاسبوعيه 4.90 ٪ (ن = 40 ، الشكل 3). بدءا من يوم 1 مع كثافة الخلايا البطانية من 4,033 ± 146/163 الخلايا/مم2 (متوسط ± 25 ٪/75% الربع) ، انخفضت كثافة الخلايا إلى 3,850 ± 167/233 الخلايا/مم2 في اليوم 8 ، و 3,650 ± 200/233 الخلايا/مم2 في اليوم 15. وكانت خسائر الخلايا المحددة متشابهة في الأسبوعين الأول والثاني. في الأيام 1 − 8 ، 4.00 ± 2.17/1.93 ٪ (متوسط ± 25%/75 ٪ الأرباع) ؛ أيام 8 − 15 ، 4.88 ± 5.52/4.42 ٪ ؛ أيام 1 − 15 ، 8.64 ± 4.32/2.71 ٪). التالي ، فان معدل الانخفاض المعطي مماثل للمعدل المبلغ عنه في القرنيات المتبرعة البشرية اثناء الزراعة في الدراسات السابقة10و11و12.

تم تقييم المعلمات المورفولوجية بعد تلطيخ طبقه الخلايا البطانية في اليوم 15 (ن = 28 ، الشكل 4). التقويم الأرقام التي تتكون 7.18 ± 2.36/2.90 ٪ (المتوسط ± 25%/75 ٪ الأرباع) من الحدود خليه الدمج. وكان متوسط 1.11 ± 1.11/15.56 التشكيلات/مم2 (متوسط ± 25%/75 ٪ الأرباع) موجودة في عينات التحقيق ، في حين 13.33 ± 4.44/11.67 الاليزارين الأحمر الملون الخلايا/مم2 (متوسط ± 25 ٪/75% الربع) ملحوظا خسائر الخلايا الدقيقة.

الشكل 5 يوفر صورا تمثيليه لبطانة القرنية اثناء التقييم المجهري في hbss (الشكل 5ا) وبعد تلطيخ مع التريبان الأزرق و الاليزارين الأحمر S (الشكل 5ب). يمكن اجراء تقييم كثافة الخلايا البطانية في hbss عده مرات (علي سبيل المثال ، في الأيام 1 و 8 و 15) ، في حين يمكن استخدام العينات الملونة لتقييم المعلمات المورفولوجية (الأرقام التقويم ، وتشكيلات الوردة ، الاليزارين الأحمر الملون الخلايا) أو تحديد كثافة الخلايا البطانية في نهاية التجارب بسبب الخصائص السامة للخلايا من معظم المواد تلطيخ.

إذا تم وضع أزرار القرنية الانقسام والمزروعة مع الجانب البطانية التي تواجه أسفل عن طريق الصدفة ، والضرر واسعه الخلية البطانية هو ان يتوقع (الشكل 6ا). أزرار القرنية غير المنقسمة تعاني زيادة كبيره في فقدان الخلايا البطانية بسبب تورم الورم ، مما تسبب في طي غشاء Descemet لأكثر من 15 يوما من الزراعة (الشكل 6ب) ، بينما تظهر أزرار القرنية المنقسمة التي تم الحفاظ عليها إلى حد كبير بطانة القرنية بعد 15 يوما من زراعه ، المشار اليها من قبل المناطق المتناثرة الدقيقة الملونة الاليزارين تشير إلى خلايا دمرت واحده (الشكل 6ج).

Figure 2
الشكل 2: الرسم التخطيطي لأزرار القرنية غير المنقسمة وأزرار القرنية المنقسمة. بعد أزاله 300 μm من القرنية الخنازير ، بما في ذلك ظهاره وأجزاء رئيسيه من الانسجه اللحمية ، يتم تقليل سمك أزرار القرنية الانقسام لصالح الحفاظ علي أفضل من بطانة القرنية بسبب انخفاض تورم الورم في جميع انحاء زراعه تصل إلى 15 يوما. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: كثافة الخلايا البطانية (النماء) لأزرار القرنية المنقسمة علي مدي 15 يوما. أزرار القرنية الانقسام (ن = 40) وأظهرت انخفاضا مطردا. النماء في الطفولة الاولي في اليوم 1, 4,033 ± 146/163 خلايا/مم2 (متوسط ± 25%/75% الأرباع); اليوم 8 ، 3,850 ± 167/233 الخلايا/مم2؛ اليوم 15 ، 3,650 ± 200/233 الخلايا/مم2. ويصور البيانات علي انها متوسطه ± 25%/75% من الأرباع ، والشعيرات تمثل اما الحد الأدنى والحد الأقصى أو 1.5 من النطاق الربع (IQR). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: البارامترات المورفولوجية للتقييم الإضافي لتلف الخلايا وعمليات أعاده الترتيب. الصور المجهرية لبطانة القرنية في التكبير 400x بعد 15 يوما من زراعه وتلطيخ مع التريان الأزرق والأحمر الاليزارين S تبين (ا) الإصلاح الأرقام (الأسهم ، والاجتماع المشترك من أربعه أو أكثر من الخلايا/حدود الخلية بدلا من ثلاثه), (ب) التشكيلات ريده (دائره منقطه, الخلية المركزية تناقص مع تشكيلات الوردة المميزة من خمسه أو أكثر من الخلايا المجاورة) و (ج) الخلايا الملونة الحمراء الاليزارين (الدوائر متقطع, دمرت الخلايا). يتم تصوير البيانات (n = 28) كمتوسط ± 25%/75% ربع. شعيرات يمثلون اما الحد الأدنى والحد الأقصى أو 1.5 من المدى الربع (IQR). الدوائر تمثل القيم المتطرفة ليس ضمن IQR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: بطانة القرنية غير الملطخة والملطخة. طبقه الخلايا البطانية كما راينا خلال التقييم المجهري (400x التكبير) في (ا) محلول الملح متوازن الوتر (hbss) تسبب تورم الخلايا البطانية التالي أفضل رؤية الخلية و (ب) بعد تلطيخ مع التريبان الأزرق و الاليزارين الأحمر s. الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: صور عامه لبطانة القرنية من (ا) زر القرنية الانقسام المزروعة راسا علي عقب ، (ب) زر القرنية غير منقسمة ، و (C) زر القرنية الانقسام بعد تلطيخ. تظهر الصور الفوتوغرافية بطانة القرنية بعد تلطيخ مع الأزرق التريبين والأحمر الاليزارين S. (ا) ويلاحظتلف الخلايا بطانية القرنية واسعه النطاق (المنطقة الحمراء) بعد ان تزرع أزرار القرنية الانقسام مع الجانب البطانية التي تواجه أسفل بعد واحد أسبوع من الزراعة. (ب) زيادة كبيره في تلف الخلايا البطانية في أزرار القرنية غير المنقسمة بسبب الغشاء القابل للطي والتورم النسيجي في Descemet بعد 15 يوما من الزراعة (الشرائط الحمراء). (ج) تظهر أزرار القرنية المنقسمة طبقه الخلايا البطانية المحفوظة جيدا بعد 15 يوما من الزراعة فقط تظهر الخلايا المحطمة الدقيقة التي ينظر اليها في المناطق الملونة الحمراء الاليزارين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقه لاعداد الخنازير تقسيم أزرار القرنية ، والذي يمثل موحده ومنخفضه التكلفة السابقين الجسم الغشائي القرنية النموذج ثقافة الجهاز لأغراض البحث6. وأظهرت الخنازير انقسام القرنية أزرار انخفاض كثافة الخلايا البطانية مماثله لخسائر الخلايا البطانية التي لوحظت في القرنيات المتبرعين البشرية المزروعة في بنوك العين علي مدي أسبوعين6,10,11, 12-الآن

وأظهرت التفوق علي أزرار القرنية غير المنقسمة ، فضلا عن عينات القرنية الكاملة الخنازير سابقا6. وفي تلك الدراسة ، تمت مقارنه ثلاث مجموعات في الأيام الاولي والثامنة والخامسة عشره. وكان بطانة القرنية من جميع المجموعات (أزرار القرنيات ، وغير انقسام أزرار الشبكية ، وتقسيم أزرار القرنية) في حاله جيده في اليوم 1 ، ممثله بطبقه الخلايا البطانية المحفوظة جيدا6. ومع ذلك ، بسبب تورم اللحمية ، وطي غشاء Descemet لتدمير مساحات واسعه من بطانة العينات القرنية الكاملة ، بحيث لا يمكن اجراء تقييم تمثيلي لكثافة الخلايا البطانية القرنية في الأيام 8 و 15. علي الرغم من ان البطانة من أزرار القرنية غير المنقسمة تم الحفاظ عليها جيدا حتى اليوم 15 ، وكانت بعض طيات الغشاء Descemet موجودة أيضا. علي الرغم من انه بالمقارنة مع عينات القرنية الغشائية طبقه الخلايا البطانية من أزرار القرنية غير المنقسمة كان في حاله أفضل ، كانت طبقه الخلايا البطانية من أزرار القرنية الانقسام في حاله أفضل بكثير. ويمكن رؤية ذلك في المعايير الكمية والنوعية ، حيث ان فقدان الخلايا البطانية في غضون 15 يوما من الزراعة كان اعلي بكثير (p = 0.041) في أزرار القرنية غير المنقسمة (-575 ± 25/250 خليه/مم2) مقارنه بأزرار القرنية المنقسمة (-417 ± 138/179 خلايا/مم2) ، وهو مطابق للخصائص المورفولوجية المحددة الواضحة في نمط الخلية السداسية الأكثر انتظاما ، وعدد اقل من الإصلاحات وتشكيلات الوردة ، بالاضافه إلى عدد اقل من الخلايا المدمرة (مناطق alizarin الحمراء) في الانقسام أزرار القرنية6. توزيع خسائر الخلايا البطانية تؤكد هذه النتائج ، وفقدان الخلايا التوزيعة في غضون 15 يوما في غير انقسام وتقسيم أزرار القرنية هو 14.89 ٪ و 10.2 ٪ (ع = 0.032) علي التوالي6. وبما ان هذه الطريقة تم التحقق من صحتها لفتره تصل إلى 15 يوما ، فانها تسمح بفترات مراقبه أطول من الدراسات المنشورة حتى الآن (72 إلى 120 ح)3و4و5.

التحسينات في الحفاظ علي طبقه الخلايا البطانية ، وتطبيق بروتوكولات زراعه المشتركة المستخدمة أيضا في بنوك العين ، يمكن ان يعزي فقط إلى انخفاض تورم سدي القرنية ، منذ يتم أزاله جزء كبير (300 μm) من سدي قبل زراعه6,13. عاده ما تميل سدي إلى الانتفاخ خلال الزراعة بسبب خصائصها المائية وجزيئاتها المضمنة داخل الانسجه اللحمية14،15. التورم ، الذي يدفع بقوات القص والقرصة وطي غشاء descemet ، والذي يسبب أيضا الضغط الميكانيكي علي بطانة القرنية وفقدان الخلايا البطانية ، يتم تقليله بعد الازاله الجزئية لل سدي6،10. بدلا من البنوك العين ، والتي غالبا ما تستخدم وكلاء الاسموزي مثل ديكسكان إلى القرنيات المتبرع البشري deswell قبل الزرع ، وتقسيم أزرار القرنية لا تتطلب اوسموتيك القاع16،17. كما الثقافة المتوسطة تستكمل مع ديكسكان من المعروف ان تمتصه الخلايا البطانية القرنية وللحث علي زيادة فقدان الخلايا7,8,9,18,19 ،20، وزراعه أزرار القرنية الانقسام دون ديكسكان (أو وكلاء الاسموزي الأخرى) يلغي العديد من العوامل السامة السلبية قدر الإمكان6. بما ان ال [كلتثر مديوم] يكون لا يلحق مع اي إضافات في ال يقدم طريقه, ما من تاثيرات سامه يسبب ب اي يضيف ماده يكون توقعت, اي يجعل هذا نموذج قيمه لتحقيقات من توافق احيائيه اختبارات من مواد جديده.

علي الرغم من ان بطانة القرنية هي طبقه خليه حساسة جدا واعداد أزرار القرنية الانقسام يتطلب المهارات الجراحية المعتدلة والتعامل مع لطيف ، وهذه التقنية يمكن ان تكون طريقه موحده للعمل مع والحصول علي نتائج موثوق بها فيما يتعلق اثار العوامل المختلفة علي بطانة القرنية في اطار زمني معقول جدا. ومع ذلك ، هناك خطوات قليله في هذا البروتوكول حيث بطانة القرنية في خطر. من الواضح ان العينين التالفة أو المبهمة تحتاج إلى التعرف عليها بعناية والتخلص منها في البداية لمنع التحيزات المحتملة. أيضا ، يجب ان تترك دائما بطانة القرنية لم يمسها اثناء الانفصال ، تشريح ، استخراج ، والمناولة (علي سبيل المثال ، نقل من العين إلى لوحه الثقافة ، من لوحه الثقافة إلى لوحه الثقافة ، وما إلى ذلك) من أزرار القرنية الانقسام من أجل منع اي الاضرار الميكانيكية. عند وضع الخياطة بشكل سطحي في ستروما ، قد يكون من المحتمل ان تخترق البطانة إذا تم ادراج الابره بطريق الخطا بعيدا جدا في العمق. إذا كان الأمر كذلك ، فان السائل الملحوظ من غرفه العين الاماميه سيمر عبر قناه الخياطة ويجب التخلص من العين المقابلة. لمنع هذا ، يجب ان تبقي الابره سطحيه داخل سدي. وعلاوة علي ذلك ، يجب توخي الحذر لتقسيم بدقه زر القرنية أفقيا باستخدام مشرط. والقطع غير المتساوية يؤدي إلى تورم متفاوتة اثناء الزراعة ، وربما تسبب زيادة فقدان الخلايا البطانية.

يتم اجراء فحص الخلايا البطانية القرنية غير الملونة في hBSS عاده في القرنيات المتبرعة البشرية. لا يوجد اي دليل علي تلف الخلايا الكبيرة الناجمة عن تورم الاسموزي من الخلايا البطانية لوقت الامتحان المختار من أزرار القرنية الانقسام في hBSS3. علي الرغم من ان تلطيخ يعزز رؤية حدود الخلية ، لا ينتج العد غير الملون في نتائج مختلفه بشكل ملحوظ من كثافة الخلايا البطانية مقارنه مع العد الملون21. والفائدة الواضحة من العد غير الملون هي انه يسمح باجراء فحوصات متابعه متعددة خلال التجارب ، في حين ان المواد الملوثة تكون عاده سامه للخلايا وتنهي فتره المراقبة. العد الملون ، ومع ذلك ، لا يزال من المهم لتقييم الخصائص المورفولوجية لبطانة. ويسلط التريان الأزرق الضوء علي نوى الخلايا التالفة التي غالبا ما تبدو غير تالفة في العد غير الملطخ. ومن الواضح ان alizarin red S يعزز رؤية حدود الخلايا والخلايا التالفة عن طريق تلطيخ غشاء Descemet ، مما يسهل تقييم كثافة الخلايا البطانية ويسمح بتحليل الملامح المورفولوجية لبطانة القرنية ، مثل الأرقام التقويم ، وتشكيلات الوردة ، والخلايا الملونة الحمراء الاليزارين (الشكل 4).

ومن القيود الرئيسية علي تقسيم أزرار القرنية كنموذج الجسم السابق ان, تماما مثل النماذج في المختبر, فهي مناسبه فقط للتحقيق في التاثيرات الخارجية علي الخلايا البطانية القرنية. لذلك ، في النماذج المجرية لا يمكن الاستغناء عنها للبحث عن الامراض الجهازية والظروف مع تاثير علي العين والقرنية بطانة. بغض المهم, هذه التقنية اعداد يمكن ان تولد بيانات صالحه لاختبار اثار العوامل الخارجية المختلفة علي بطانة القرنية (علي سبيل المثال, في اختبار التوافق البيولوجي للمواد الجديدة)22. وبعد المبدا الثلاثي الابعاد (الاستبدال والتخفيض والصقل) لتقليل عدد التجارب الحيوانية الحية ، توفر هذه الطريقة نموذجا بحثيا كافيا لزيادة إغلاق الفجوة بين ثقافات الخلايا الانبوبيه ، حيث تكون النتائج غالبا غير ملائمة حاله [فيفو] في أناس, وبحث حيوانيه, اي يتطلب جهود جوهريه وبدرجه متزايدة يثير اهتمامات اخلاقيه23.

نظرا لخصائصها وتوافرها ، يبدو ان عيون الخنازير هي البديل المناسب الوحيد للعيون البشرية لأغراض البحث. القرنيات من الرئيسيات غير البشرية ليست بديلا جيدا نظرا لأسباب اخلاقيه وتوافر ، علي الرغم من ان هذه الكائنات هي أقرب الأنواع إلى البشر. ومن ناحية أخرى ، فان أعين الصغار هي ببساطه صغيره جدا للسماح بازاله القرنية بكفاءة. عيون الخنازير هي مماثله للعيون البشرية في الحجم وتظهر خصائص مماثله من الخلايا البطانية القرنية ، والذي ينعكس أيضا في البحوث التي تتعامل مع المستقبل المحتمل xenoازدراع القرنيات الخنازير المعدلة وراثيا24، 25و26. أيضا ، كونها نتاجا ثانويا من المسالخ ، فمن السهل الحصول عليها.

وفي الختام ، فان الطريقة المعروضة باستخدام القرنيات الخنازير تقدم نموذجا للبحوث التي يتم زراعتها بشكل نموذجي والتي يمكن ان تكون فعاله من حيث التكلفة في الخلايا البطانية القرنية. قد يستخدم المحققون المستقبليون أزرار القرنية المنقسمة لتحليل اثار العوامل المختلفة مثل المواد الجديدة ، والتقنيات الجراحية ، والمعدات ، والتاثيرات الخارجية المحتملة الأخرى حيث تكون بطانة القرنية ذات اهميه كبيره.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ودعم إنشاء نموذج البحث المقدم من قبل KMU-ايفنتيف (FKZ: 13GW0037F) من وزاره التعليم والبحوث الاتحادية في ألمانيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Subject
Pig eyes local abbatoir
Substances
Alizarin red S Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016 Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x) Gibco, USA
Fetal calf serum Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution own production
Hypotonic balanced salt solution own production per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9% B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution own production
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well) Corning Inc., USA
Colibri forceps Geuder AG, Germany
Corneal scissors Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder L. Klein, Germany
Eye scissors Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm Whatman, USA
Hockey knife Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL Schott AG, Germany
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm) Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder Geuder AG, Germany
Petri dishes VWR International, USA
Pipette tips Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL) Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm own production
Tying forceps Geuder AG, Germany
Weighing paper neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope Olympus, Japan
CellSens Entry (software) Olympus, Japan
Cold-light source Schott AG, Germany
Incubator Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal VWR International, USA
Photoshop CS2 Adobe Systems, USA
Precision scale Ohaus Europe GmbH, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).

Tags

الطب إصدار 152 نموذج ثقافة الجهاز نموذج البحث القرنية بطانة بطانة القرنية الخلايا البطانية القرنية الخلايا البطانية زر القرنية الانقسام عيون الخنازير الخنازير
نموذج ثقافة الجهاز البطانية القرنية الخنازير باستخدام أزرار القرنية الانقسام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C.,… More

Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Steinhorst, N. A., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J. Vis. Exp. (152), e60171, doi:10.3791/60171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter