Her præsenteres en trin-for-trin-protokol til tilberedning og dyrkning af Porcin split cornea-knapper. Da denne organo-typisk dyrkede organ kulturmodel viser celledødelighed inden for 15 dage, sammenlignelige med human donor hornhinder, det repræsenterer den første model, der tillader langvarig dyrkning af ikke-humane hornhinder uden at tilføje giftige dextran.
Eksperimentel forskning i cornea endotheliale celler er forbundet med flere vanskeligheder. Human donor hornhinder er knappe og sjældent til rådighed for eksperimentelle undersøgelser, da de normalt er nødvendige for transplantation. Endotelcelle kulturer oversætter ofte ikke godt til in vivo-situationer. På grund af de biostrukturelle egenskaber af ikke-humane corneas, stromale hævelse under dyrkning inducerer betydelige cornea endotel celle tab, hvilket gør det vanskeligt at udføre dyrkning i en længere periode. Deswelling-agenter som dextran anvendes til at modvirke dette respons. Men, de også forårsage signifikant endotel celle tab. Der blev derfor fastlagt en ex vivo-organ dyrknings model, som ikke krævede deswelling-midler. Grise øjne fra et lokalt slagteri blev brugt til at forberede split cornea-knapper. Efter delvis cornea-trephination blev de yderste lag af hornhinden (epithelium, Bowman lag, dele af stroma) fjernet. Dette reducerer markant cornea endotel celletab induceret af massive stromale hævelse og Descemets membran folde hele længere dyrkningsperioder og forbedrer generel bevarelse af endotelcellelag. Efterfølgende fuldstændig cornea-udmejsling blev efterfulgt af fjernelsen af Split cornea-knappen fra den resterende øjen pære og dyrkning. Endotel celletæthed blev vurderet ved opfølgnings tider på op til 15 dage efter klargøring (dvs. dag 1, 8, 15) ved hjælp af let mikroskopi. Den anvendte forberedelses teknik giver mulighed for en bedre bevaring af endotelcellelag, der er aktiveret ved mindre stromale vævshævelse, hvilket resulterer i langsom og lineær tilbagegang i Split cornea-knapper svarende til human donor corneas. Da denne standardiserede organo-typisk dyrkede forskningsmodel for første gang giver mulighed for en stabil dyrkning i mindst to uger, er det et værdifuldt alternativ til human donor hornhinder til fremtidige undersøgelser af forskellige eksterne faktorer med hensyn til deres virkninger på hornhinde endothelium.
Cornea-transplantationer procedurer er blandt de hyppigst udførte transplantationer over hele verden1. Da der er en alvorlig mangel på menneskelige donor hornhinder, eksperimentel forskning adressering cornea endotheliale celler i humane hornhinder er vanskeligt at udføre1. Men indførelsen af vandings løsninger og andre stoffer, der anvendes i øjet, oftalmisk viskoelastisk udstyr, samt kirurgiske instrumenter og teknikker (f. eks, phacoemulgering instrumenter og teknikker, ultralyd energi) kræver og omfattende undersøgelser vedrørende deres virkninger på cornea-endotelet før klinisk brug.
Der findes få alternativer til human donor hornhinder til forskning. Dyre forskningsmodeller er meget værdifulde, men på samme tid meget ressourceforbrugende og i stigende grad spørgsmålstegn etisk. En stor ulempe ved in vitro-cellekulturer er deres begrænsede oversættelse til det menneskelige øje. Resultater opnået fra cellekulturer kan være inkongruous til in vivo betingelser, fordi cellerne kan gennemgå endotel mesenchymal Transition (EMT), hvilket resulterer i fibroblast-lignende morfologi forårsaget af tab af celle polaritet og ændringer i celle form og gen udtryk2.
Der henviser til, at tidligere ex vivo-modeller rapporterede dyrkningsperioder på op til kun 120 h, en ny forberedelses teknik til at etablere en endotel organ kulturmodel af svine horn ved dyrkning af fersk gris hornhinder i mindst 15 dage, blev for nylig introduceret3 ,4,5,6. Hvis cornea epitel og dele af stroma fjernes (ca. 300 μm i alt) fra hornhinden før dyrkning, er hævelse af stroma reduceret i Split cornea-knapper, hvilket resulterer i mindre endotel celle tab og en velholdt endotel cellelaget efter op til 15 dage, hvorimod ikke-opdelte cornea-knapper viser signifikant endotelcelletab på grund af ujævn strin ende hævelse og dannelse af afkalktes folder. Øjen banker bruger normalt osmotiske deswelling agenter såsom dextran at reducere hævelse af hornhinder før transplantation. Men, disse agenter viste sig at inducere øget endotelcelletab7,8,9.
Denne artikel har til formål at visualisere denne standardiserede ex vivo forskningsmodel i en detaljeret trin-for-trin protokol for at gøre det muligt for fremtidige efterforskere til at udføre forskning på cornea endotelet ved hjælp af Split cornea knapper. Denne model repræsenterer en enkel metode til at teste stoffer og teknikker, der anvendes i øjet, såsom oftalmisk viskoelastisk udstyr, vandings løsninger, og ultralyd energi, eller andre procedurer, hvor hornhinden endotelet er af interesse.
Denne protokol giver en metode til fremstilling af svin split cornea-knapper, som repræsenterer en standardiseret og billig ex vivo cornea endotel organ kulturmodel til forskningsformål6. Porcin split cornea-knapper viste et fald i endotel celletætheden, der kan sammenlignes med endotelcelletab observeret i human donor hornhinder dyrket i øjen banker over en to-ugers periode6,10,11, <sup c…
The authors have nothing to disclose.
Etableringen af den præsenterede forskningsmodel blev støttet af KMU-Inno (FKZ: 13GW0037F) fra Forbundsministeriet for undervisning og forskning Tyskland.
Subject | |||
Pig eyes | local abbatoir | ||
Substances | |||
Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
Materials & Instruments | |||
Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
Petri dishes | VWR International, USA | ||
Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
trephine ø 7.5 mm | own production | ||
Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
Equipment & Software | |||
Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |