Summary

En Ornesen Endothelial organ kultur model ved hjælp af Split cornea-knapper

Published: October 06, 2019
doi:

Summary

Her præsenteres en trin-for-trin-protokol til tilberedning og dyrkning af Porcin split cornea-knapper. Da denne organo-typisk dyrkede organ kulturmodel viser celledødelighed inden for 15 dage, sammenlignelige med human donor hornhinder, det repræsenterer den første model, der tillader langvarig dyrkning af ikke-humane hornhinder uden at tilføje giftige dextran.

Abstract

Eksperimentel forskning i cornea endotheliale celler er forbundet med flere vanskeligheder. Human donor hornhinder er knappe og sjældent til rådighed for eksperimentelle undersøgelser, da de normalt er nødvendige for transplantation. Endotelcelle kulturer oversætter ofte ikke godt til in vivo-situationer. På grund af de biostrukturelle egenskaber af ikke-humane corneas, stromale hævelse under dyrkning inducerer betydelige cornea endotel celle tab, hvilket gør det vanskeligt at udføre dyrkning i en længere periode. Deswelling-agenter som dextran anvendes til at modvirke dette respons. Men, de også forårsage signifikant endotel celle tab. Der blev derfor fastlagt en ex vivo-organ dyrknings model, som ikke krævede deswelling-midler. Grise øjne fra et lokalt slagteri blev brugt til at forberede split cornea-knapper. Efter delvis cornea-trephination blev de yderste lag af hornhinden (epithelium, Bowman lag, dele af stroma) fjernet. Dette reducerer markant cornea endotel celletab induceret af massive stromale hævelse og Descemets membran folde hele længere dyrkningsperioder og forbedrer generel bevarelse af endotelcellelag. Efterfølgende fuldstændig cornea-udmejsling blev efterfulgt af fjernelsen af Split cornea-knappen fra den resterende øjen pære og dyrkning. Endotel celletæthed blev vurderet ved opfølgnings tider på op til 15 dage efter klargøring (dvs. dag 1, 8, 15) ved hjælp af let mikroskopi. Den anvendte forberedelses teknik giver mulighed for en bedre bevaring af endotelcellelag, der er aktiveret ved mindre stromale vævshævelse, hvilket resulterer i langsom og lineær tilbagegang i Split cornea-knapper svarende til human donor corneas. Da denne standardiserede organo-typisk dyrkede forskningsmodel for første gang giver mulighed for en stabil dyrkning i mindst to uger, er det et værdifuldt alternativ til human donor hornhinder til fremtidige undersøgelser af forskellige eksterne faktorer med hensyn til deres virkninger på hornhinde endothelium.

Introduction

Cornea-transplantationer procedurer er blandt de hyppigst udførte transplantationer over hele verden1. Da der er en alvorlig mangel på menneskelige donor hornhinder, eksperimentel forskning adressering cornea endotheliale celler i humane hornhinder er vanskeligt at udføre1. Men indførelsen af vandings løsninger og andre stoffer, der anvendes i øjet, oftalmisk viskoelastisk udstyr, samt kirurgiske instrumenter og teknikker (f. eks, phacoemulgering instrumenter og teknikker, ultralyd energi) kræver og omfattende undersøgelser vedrørende deres virkninger på cornea-endotelet før klinisk brug.

Der findes få alternativer til human donor hornhinder til forskning. Dyre forskningsmodeller er meget værdifulde, men på samme tid meget ressourceforbrugende og i stigende grad spørgsmålstegn etisk. En stor ulempe ved in vitro-cellekulturer er deres begrænsede oversættelse til det menneskelige øje. Resultater opnået fra cellekulturer kan være inkongruous til in vivo betingelser, fordi cellerne kan gennemgå endotel mesenchymal Transition (EMT), hvilket resulterer i fibroblast-lignende morfologi forårsaget af tab af celle polaritet og ændringer i celle form og gen udtryk2.

Der henviser til, at tidligere ex vivo-modeller rapporterede dyrkningsperioder på op til kun 120 h, en ny forberedelses teknik til at etablere en endotel organ kulturmodel af svine horn ved dyrkning af fersk gris hornhinder i mindst 15 dage, blev for nylig introduceret3 ,4,5,6. Hvis cornea epitel og dele af stroma fjernes (ca. 300 μm i alt) fra hornhinden før dyrkning, er hævelse af stroma reduceret i Split cornea-knapper, hvilket resulterer i mindre endotel celle tab og en velholdt endotel cellelaget efter op til 15 dage, hvorimod ikke-opdelte cornea-knapper viser signifikant endotelcelletab på grund af ujævn strin ende hævelse og dannelse af afkalktes folder. Øjen banker bruger normalt osmotiske deswelling agenter såsom dextran at reducere hævelse af hornhinder før transplantation. Men, disse agenter viste sig at inducere øget endotelcelletab7,8,9.

Denne artikel har til formål at visualisere denne standardiserede ex vivo forskningsmodel i en detaljeret trin-for-trin protokol for at gøre det muligt for fremtidige efterforskere til at udføre forskning på cornea endotelet ved hjælp af Split cornea knapper. Denne model repræsenterer en enkel metode til at teste stoffer og teknikker, der anvendes i øjet, såsom oftalmisk viskoelastisk udstyr, vandings løsninger, og ultralyd energi, eller andre procedurer, hvor hornhinden endotelet er af interesse.

Protocol

Denne protokol følger vores institutions etiske retningslinjer. I overensstemmelse med vedtægterne for vores institutions etiske undersøgelsesudvalg skulle der ikke indhentes etisk godkendelse forud for forsøgene, da alle svine horn blev indhentet fra det lokale slagteri. 1. organ kultur Forbered grise øjne. Fra det lokale slagteri, få grise øjne, der blev fjernet kort efter slagtning, men før termisk behandling. Transportere øjnene til laboratoriet og behandle dem i…

Representative Results

Den præsenterede dissektions teknik indebærer delvis fjernelse af stromale væv, hvilket resulterer i en tyndere cornea prøve og dermed mindre stromale hævelse (figur 1 og figur 2). Mindre stromale hævelse inducerer mindre forskydning og knibe kræfter, der har en negativ indvirkning på cornea endothelium, dermed forårsager lavere endoteliale celle tab satser6. Split cornea-knapper viser et signifik…

Discussion

Denne protokol giver en metode til fremstilling af svin split cornea-knapper, som repræsenterer en standardiseret og billig ex vivo cornea endotel organ kulturmodel til forskningsformål6. Porcin split cornea-knapper viste et fald i endotel celletætheden, der kan sammenlignes med endotelcelletab observeret i human donor hornhinder dyrket i øjen banker over en to-ugers periode6,10,11, <sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Etableringen af den præsenterede forskningsmodel blev støttet af KMU-Inno (FKZ: 13GW0037F) fra Forbundsministeriet for undervisning og forskning Tyskland.

Materials

Subject
Pig eyes local abbatoir
Substances
Alizarin red S Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016 Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x) Gibco, USA
Fetal calf serum Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution own production
Hypotonic balanced salt solution own production per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9% B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution own production
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well) Corning Inc., USA
Colibri forceps Geuder AG, Germany
Corneal scissors Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder L. Klein, Germany
Eye scissors Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm Whatman, USA
Hockey knife Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL Schott AG, Germany
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm) Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder Geuder AG, Germany
Petri dishes VWR International, USA
Pipette tips Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL) Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm own production
Tying forceps Geuder AG, Germany
Weighing paper neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope Olympus, Japan
CellSens Entry (software) Olympus, Japan
Cold-light source Schott AG, Germany
Incubator Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal VWR International, USA
Photoshop CS2 Adobe Systems, USA
Precision scale Ohaus Europe GmbH, Switzerland

References

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien – Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture – The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle – mind the ethical gap!. ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).

Play Video

Cite This Article
Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Steinhorst, N. A., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J. Vis. Exp. (152), e60171, doi:10.3791/60171 (2019).

View Video