Summary
Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von Schweinespaltenhornknöpfen vorgestellt. Da dieses organotypisch kultivierte Organkulturmodell innerhalb von 15 Tagen Zellsterblichkeitsraten zeigt, vergleichbar mit menschlichen Spenderhornhäuten, stellt es das erste Modell dar, das eine langfristige Kultivierung nichtmenschlicher Hornhäuten ohne Zugabe von giftigem Dextran ermöglicht.
Abstract
Experimentelle Forschung an hornhauten Endothelzellen ist mit mehreren Schwierigkeiten verbunden. Menschliche Spenderhornhäuten sind knapp und selten für experimentelle Untersuchungen verfügbar, da sie normalerweise für eine Transplantation benötigt werden. Endothelzellkulturen übersetzen sich oft nicht gut in In-vivo-Situationen. Aufgrund der biostrukturellen Eigenschaften nichtmenschlicher Hornhäuten führt eine stromale Schwellung während der Kultivierung zu einem erheblichen Korneal-Endothelzellverlust, der die Kultivierung über einen längeren Zeitraum erschwert. Entschwellende Mittel wie Dextran werden verwendet, um dieser Reaktion entgegenzuwirken. Jedoch, Sie verursachen auch signifikanteen Endothelzellverlust. Daher wurde ein Ex-vivo-Organkulturmodell ohne Entschwellende Mittel etabliert. Schweineaugen aus einem örtlichen Schlachthof wurden verwendet, um gespaltene Hornhautknöpfe zuzubereiten. Nach partieller Hornhauttrephination wurden die äußeren Schichten der Hornhaut (Epithel, Bogenmannschicht, Teile der Stroma) entfernt. Dies reduziert signifikant den verlustfreien Hornhautzellverlust, der durch massive stromale Schwellungen und Descemets Membranfaltung über längere Kultivierungsperioden verursacht wird, und verbessert die allgemeine Erhaltung der Endothelzellschicht. Auf die anschließende vollständige Hornhauttrephination folgte die Entfernung des gespaltenen Hornhautknopfes aus der verbleibenden Augenzwiebel und der Kultivierung. Die Endothelzelldichte wurde in Folgezeiten von bis zu 15 Tagen nach der Zubereitung (d. h. tage 1, 8, 15) mittels Lichtmikroskopie bewertet. Die verwendete Zubereitungstechnik ermöglicht eine bessere Konservierung der Endothelzellschicht, die durch eine geringere stromale Gewebeschwellung ermöglicht wird, was zu langsamen und linearen Abnahmeraten in gespaltenen Hornhautknöpfen führt, die mit menschlichen Spenderhornhäuten vergleichbar sind. Da dieses standardisierte organotypisch kultivierte Forschungsmodell erstmals einen stabilen Anbau für mindestens zwei Wochen ermöglicht, ist es eine wertvolle Alternative zu menschlichen Spenderhornhäuten für zukünftige Untersuchungen verschiedener externer Faktoren in Bezug auf ihre Wirkungen auf das Hornhautendothel.
Introduction
Hornhauttransplantationsverfahren gehören zu den am häufigsten durchgeführten Transplantationen weltweit1. Da es einen schweren Mangel an menschlichen Spender Hornhäuten gibt, ist experimentelle Forschung zur Bekämpfung von Hornhautendothelzellen in menschlichen Hornhäuten schwierig,1durchzuführen. Die Einführung von Bewässerungslösungen und anderen im Auge verwendeten Substanzen, ophthalmologischen viskoelastischen Geräten sowie chirurgischen Instrumenten und Techniken (z. B. Phakoemulsifikationsinstrumente und -techniken, Ultraschallenergie) valide und umfangreiche Untersuchungen über ihre Auswirkungen auf das Hornhautendothel vor der klinischen Anwendung.
Für die Forschung gibt es nur wenige Alternativen zu menschlichen Spenderhornhäuten. Tierforschungsmodelle sind sehr wertvoll, aber gleichzeitig sehr ressourcenverbrauchend und zunehmend ethisch hinterfragt. Ein großer Nachteil der In-vitro-Zellkulturen ist ihre begrenzte Übersetzung in das menschliche Auge. Die Ergebnisse aus Zellkulturen können unpassend zu In-vivo-Bedingungen sein, da Zellen einen endotheliaalen mesenchymalen Übergang (EMT) durchlaufen können, was zu einer fibroblastenähnlichen Morphologie führt, die durch den Verlust der Zellpolarität und Veränderungen der Zellform und des Gens verursacht wird. Ausdruck2.
Während frühere Ex-vivo-Modelle Anbauzeiten von bis zu 120 h meldeten, wurde vor kurzem eine neuartige Zubereitungstechnik eingeführt, um ein Porenhorn-Endothel-Organkulturmodell zu etablieren, indem frische Schweinehornhäasen für mindestens 15 Tage kultiviert wurden3 ,4,5,6. Wenn das Hornhautepithel und Teile des Stroma vor der Kultivierung aus der Hornhaut entfernt werden (insgesamt ca. 300 m), wird die Schwellung des Stroma in gespaltenen Hornhautknöpfen reduziert, was zu einem geringeren Endothelzellverlust und einem gepflegten Endothel Zellschicht nach bis zu 15 Tagen, während nicht-gespaltene Hornhautknöpfe einen signifikanten Endothelzellverlust aufgrund ungleichmäßiger stromaler Schwellungen und der Bildung von Descemets Falten aufweisen. Augenbänke verwenden in der Regel osmotische Entschwellende Mittel wie Dextran, um die Schwellung von Hornhäuten vor der Transplantation zu reduzieren. Jedoch, Diese Agenten wurden gezeigt, dass erhöhte Endothelzellverlust7,8,9induzieren.
Dieser Artikel zielt darauf ab, dieses standardisierte Ex-vivo-Forschungsmodell in einem detaillierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zu visualisieren, um zukünftigen Forschern die Durchführung von Forschungen am Hornhautendothel mit gespaltenen Hornhautknöpfen zu ermöglichen. Dieses Modell stellt eine einfache Methode dar, um Substanzen und Techniken zu testen, die im Auge verwendet werden, wie ophthalmologische viskoelastische Geräte, Bewässerungslösungen und Ultraschallenergie oder andere Verfahren, bei denen das Hornhautendothel von Interesse ist.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den ethischen Richtlinien unserer Institution. Gemäß den Statuten des Ethikprüfungsausschusses unserer Institution musste vor den Experimenten keine ethische Genehmigung eingeholt werden, da alle Schweinehornhäuschen vom örtlichen Schlachthof bezogen wurden.
1. Orgelkultur
- Bereiten Sie Schweineaugen vor.
- Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie Schweineaugen, die kurz nach dem Mortem, aber vor der thermischen Behandlung entfernt wurden. Transportieren Sie die Augen zum Labor und verarbeiten Sie sie innerhalb weniger Stunden. Während des Transports die Augen vor der Verarbeitung bei Raumtemperatur (ca. 21 °C) halten.
- Entfernen Sie alle orbitalen Adnexe (Augenmuskeln, Bindehaut, Fettgewebe) vor der Desinfektion mit Augenschere und colibrien Zangen. Alle Augen mit offensichtlichen Traumata, äußeren Schäden (z. B. Messerschnitt) oder sichtbaren Hornhauttrübungen trennen und entsorgen.
- Bereiten Sie eine 5% Jod-PBS-Lösung (1:20) in einer sterilen Tasse vor, indem Sie 3 ml 7,5% Povidonjod zu 57 ml einer Phosphatgepufferten Salinelösung (PBS) hinzufügen. Bereiten Sie auch eine separate sterile Tasse mit 60 ml reinen PBS vor.
HINWEIS: Die Gesamtmenge der verwendeten Jod-PBS-Lösung und die Größe der Tasse hängt von der Anzahl der zu sezierenden Hornhäuten ab. Fünf bis sechs Augen benötigen etwa 60 ml der 5%-Jod-PBS-Lösung, um richtig desinfiziert zu werden. - Legen Sie fünf bis sechs Augen in die 5%-Jod-PBS-Lösung für insgesamt 5 min, um die Augenoberfläche richtig zu desinfizieren. Jede Minute vorsichtig umrühren, um sicherzustellen, dass die Augenoberfläche vollständig untergetaucht und vollständig in der Jodlösung desinfiziert wird.
- Nach 5 min die desinfizierten Augen auf den vorbereiteten Becher mit reinem PBS gefüllt übertragen. Erneut vorsichtig rühren, um sicherzustellen, dass die Jod-PBS-Lösung von der Augenoberfläche weggespült wird.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Bank aus, um eine Kontamination der desinfizierten Augen zu verhindern.
- Bereiten Sie Zellkulturplatten vor.
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte auf einer sauberen Bank mit konstantem laminaren Luftstrom aus.- Tau2 ml fetales Wadenserum (FCS). Füllen Sie eine Spritze (5 ml) mit dem FCS mit einer stumpfen Kanüle. Entleeren Sie die Spritze durch einen Spritzenfilter (0,22 m), um eine mögliche bakterielle Kontamination des FCS in 80 ml dextranfreies Kulturmedium I (mindestens wesentliches Medium [MEM] mit Earle-Salzen, Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin [200 mM], zu verhindern, Amphotericin B [250 g/ml], Hepespuffer [1 M] [50x], NaHCO3und destilliertes Wasser). Rühren Sie die Mischung, um eine gleichmäßige Substratverteilung zu gewährleisten.
- Füllen Sie jeden Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte mit 3 ml der Substratmischung.
- Durchführen von Sezierungen und Inkubationen.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Bank aus. Berühren Sie das Hornhautendothel nicht mit irgendwelchen Instrumenten.- Übertragen Sie eine Glühbirne aus der Tasse mit PBS in den Augenzwiebelhalter mit der Hornhaut nach oben und legen Sie sie unter ein ophthalmologisches Operationsmikroskop. Verwenden Sie eine Spritze gefüllt mit 0,9% NaCl, um leicht etwas Absaugung auf das Auge über die Augenzwiebelhalter, um das Auge in Position für die Zerlegung zu fixieren.
- Verwenden Sie ein Trephin (ca. 7,5 mm), das ein standardisiertes Inlay enthält, das sicherstellt, dass die Trephintiefe 300 m nicht überschreitet, um oberflächlich in die zentrale Hornhaut zu schneiden (Abbildung 1A).
- Verwenden Sie colibrifarbene Zangen und ein Einwegsskalpell mit einer dreieckigen Klinge, um den teilweise gebäusbten Teil der Hornhaut horizontal durch die Stroma zu schneiden und zu entfernen. Entsorgen Sie den abgetrennten Hornhautteil, der aus dem Hornhautepithel, der Bogenmannschicht und einem Teil des Stroma besteht.
HINWEIS: Halten Sie die horizontale Schnittrichtung strikt aufrecht, um eine gleichmäßige Dicke des verbleibenden Stroma zu erhalten. - Oberflächlich eine 10-0 Naht (10-0 Polyamid 6) in den Stroma legen, um das Endothel während der Experimente von der stromalen Seite unterscheiden zu können (Abbildung 1B). Verhindern Sie das Eindringen des Hornhautendothel. Entsorgen Sie die Glühbirne, wenn das Endothel durchdrungen ist.
HINWEIS: Das Eindringen des Hornhautendotheles mit der Nahtnadel wird sichtbar sein, da Flüssigkeit aus der vorderen Augenkammer durch den Nahtkanal austritt. - Verwenden Sie das Trephin ohne Inlay, um den trephinierten Schnitt bis zur erliegenden vorderen Augenkammer in die volle Tiefe zu bringen (Abbildung 1C). Ein deutlicher Rückgang des Widerstands und flüssigkeitsaustritt aus der vorderen Augenkammer kann nach vollständiger Penetration der Hornhaut wahrgenommen werden.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Hockeymesser, wenn der gespaltene Hornhautknopf nach der Trephination auf einer Seite des geteilten Hornhautknopfes befestigt bleibt. - Übertragen Sie den erhaltenen geteilten Hornhautknopf, der nun aus einem Teil der Stroma (Abbildung 2), der Descemet-Membran und dem Hornhautendothel besteht, in das Kulturmedium (Kulturmedium I + FCS, siehe Abschnitt 1.2) in die 12 Brunnenzellkulturplatte mit dem getaggte Seite nach unten, so dass das Hornhautendothel nach oben gerichtet ist.
HINWEIS: Wenn die Endothelseite nach unten gerichtet ist, kann das Endothel beschädigt werden. - Weisen Sie jedem geteilten Hornhautknopf eine individuelle Zahl zur Identifizierung während der Follow-ups zu und beschriften Sie die Brunnen auf der Zellkulturplatte entsprechend.
- Inkubieren Sie die gefüllten Zellkulturplatten in einem Inkubator unter Standardbedingungen bei einer Temperatur von 37 °C, 5%CO2 und einer relativen Luftfeuchte von 95%. Ändern Sie das Kulturmedium (Kulturmedium I + FCS) an Tag 8, wenn eine Inkubationszeit von 7 Tagen überschritten wird.
HINWEIS: Das Inkubationsverfahren mit geteilten Hornhautknöpfen wurde für bis zu 15 Tage validiert.
Abbildung 1: Zerlegung der Schweinehornhaut, um gespaltene Hornhautknöpfe zu erhalten. (A) Nach der Trephination der Hornhaut mit einem Trephin mit einer Inlay, um in eine Tiefe von 300 m zu schneiden und das Epithel und Teile des Stromalgewebes zu entfernen, (B) wird eine Naht oberflächlich in die Stroma gelegt, ohne dass die Hornhaut Endothel zur späteren Identifizierung der stromalen Seite. (C) Auf die vollständige Trephination der verbleibenden Hornhaut folgt (D) die Entfernung des erhaltenen gespaltenen Hornhautknopfes aus der Augenzwiebel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Mikroskopie und Untersuchung des Endothel
- Führen Sie eine ungefärbte Untersuchung durch.
HINWEIS: Die unbefleckte Untersuchung kann mehrmals durchgeführt werden (z. B. bei wöchentlichen Follow-ups an Tag 1, 8 und 15). Die unbefleckte Zählung erlaubt jedoch nur die Beurteilung der Endothelzelldichte, nicht morphologische Parameter.- Füllen Sie 3 ml hypotonische ausgewogene Salzlösung (hBSS, siehe Zusammensetzung in Tabelle der Materialien) in jedem Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte. Legen Sie vorsichtig einen einzelnen gespaltenen Hornhautknopf in hBSS, um schwellungen der hornhauten Endothelzellen zu induzieren und die Sichtbarkeit der Zellen für die Zellzählung zu verbessern.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Endothelseite in Richtung des Mikroskops ausgerichtet ist. Wenn ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop verwendet wird, muss die endotheliale Seite nach unten gerichtet sein. Während an Ort und Stelle, die Kulturplatte sollte nicht bewegt werden, um Endothelzellschäden zu verhindern. - Lassen Sie die Zellen für 1-2 min anschwellen, bevor Sie ein Bild des Endothels mit der Kamera am Mikroskop befestigt. Nehmen Sie mindestens drei Fotos von mindestens drei verschiedenen Bereichen auf, um einen repräsentativen Eindruck vom tatsächlichen Zustand des Hornhautendothel zu erhalten. Fügen Sie einen Maßstabsbalken mit einer Maßstabslänge von 100 m für eine spätere Analyse der kornealen Endothelzelldichte und morphologischen Parameter hinzu.
- Um osmotische Schäden zu vermeiden, entfernen Sie den geteilten Hornhautknopf nach maximal 5 min aus dem hBSS und übertragen Sie ihn wieder in das Kulturmedium3.
- Füllen Sie 3 ml hypotonische ausgewogene Salzlösung (hBSS, siehe Zusammensetzung in Tabelle der Materialien) in jedem Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte. Legen Sie vorsichtig einen einzelnen gespaltenen Hornhautknopf in hBSS, um schwellungen der hornhauten Endothelzellen zu induzieren und die Sichtbarkeit der Zellen für die Zellzählung zu verbessern.
- Führen Sie eine gefärbte Untersuchung durch.
HINWEIS: Die Färbung beendet die Experimente, da die verwendeten Färbesubstanzen zytotoxisch sind. Daher darf die Färbung nur am Ende des Beobachtungszeitraums zur Beurteilung morphologischer Parameter (Reformationsfiguren, Rosettenbildungen, Alizarinrot-Gefärbte Zellen) durchgeführt werden.- Bereiten Sie eine 0,25% Trypan-Blau-Lösung und 0,2% Alizarin rote S-Lösung für das Färbeverfahren vor.
- Für die 0,25% Trypan-Blaulösung die 0,4% Trypan-Blaulösung mit einer 0,9% NaCl-Lösung verdünnen.
HINWEIS: Um beispielsweise 20 ml einer 0,25% Trypan-Blaulösung zu erhalten, verdünnen Sie 12,5 ml der 0,4% Trypan-Blaulösung mit 7,5 ml der 0,9%-NaCl-Lösung. Die Trypanblaulösung kann mehrere Wochen oder Monate bei Raumtemperatur gelagert werden. - Um eine 0,2% Alizarin rote S-Lösung zu erhalten, lösen Sie 100 mg des Alizarin-Roten S-Pulvers in 50 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung unter ständigem Rühren und Erhitzen auf 50 °C auf einer Magnetrührplatte mit Heizfunktion auf. Um mögliche Ausscheidungen zu entfernen, filtern Sie die erhaltene Lösung. Stellen Sie den pH-Wert der Alizarin-Rot-S-Lösung auf pH 4.2 ein, indem Sie Natriumhydroxid oder Salzsäure entsprechend zusetzen.
HINWEIS: Stellen Sie vor jeder Anwendung der Alizarin-Rot-S-Lösung sicher, dass der pH-Wert auf 4.2 korrigiert wird und dass sich keine Ausfällungen in der Lösung befinden. Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Bewahren Sie die Lösung nicht länger als 4 Wochen auf.
- Für die 0,25% Trypan-Blaulösung die 0,4% Trypan-Blaulösung mit einer 0,9% NaCl-Lösung verdünnen.
- Legen Sie die geteilten Hornhautknöpfe in Petrischalen mit der endotheliaalen Seite nach oben, um die Endothelzellen zu färben. Verwenden Sie eine Pipette, um die 0,25% Trypan-Blaulösung Tropfen für Tropfen auf das Hornhautendothel für 90 s langsam zu tropfen.
HINWEIS: Trypan blue ermöglicht die Identifizierung beschädigter Hornhautzellen mit einer durchlässigen Membran, da sie ihre Kerne färbt. - Spülen Sie den gespaltenen Hornhautknopf 3x in 0,9% NaCl vorsichtig in einem kleinen Glasbecher ab. Verwenden Sie erneut eine Pipette, um die 0,2% Alizarin rote S-Lösung Tropfen für Tropfen auf das Hornhautendothel für 90 s langsam zu tropfen.
HINWEIS: Alizarin rot S färbt die Membran des Descemet, die hilft, Zellränder in unbeschädigten hornhauten Endothelzellen hervorzuheben und zerstörte Zellen hervorzuheben, wenn die zugrunde liegende Descemet-Membran sichtbar wird. Außerdem ermöglicht es die einfache Identifizierung größerer zerstörter Gebiete. - Zur Untersuchung des gefärbten Hornhautendothel folgen Sie den Schritten, die für die unbefleckte Zählung in Abschnitt 2.1 erklärt werden.
- Bereiten Sie eine 0,25% Trypan-Blau-Lösung und 0,2% Alizarin rote S-Lösung für das Färbeverfahren vor.
3. Analyse der kornealen Endothelzelldichte und morphologischer Parameter
- Projektzählquadrate auf den Bildern mit einer Grafikbearbeitungssoftware (Tabelle der Materialien).
- Öffnen Sie die Software und öffnen Sie ein Bild des Hornhautendothel, indem Sie Datei | Öffnen | Wählen Sie.
- Projizieren Sie ein Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 m auf das Bild.
HINWEIS: Die folgenden Schritte von Abschnitt 3.1.2 können ignoriert werden, wenn die Anzeigesoftware das Projizieren von Quadraten auf das Bild ermöglicht. Die Seitenlänge des Quadrats hängt von der Auflösung der mit der Kamera des Mikroskops aufgenommenen Bilder ab und kann mit dem Skalenbalken berechnet werden.- Schneiden Sie die Skalenleiste aus dem mit dem Mikroskop aufgenommenen Foto zu: Wählen Sie das rechteckige Marquee-Werkzeug auf der Werkzeugleiste aus oder drücken Sie M, um dann die Maßstabsleiste einzugrenzen, und wählen Sie dann Bearbeiten | Zuschneiden oder drücken Sie Strg + X.
- Klicken Sie auf Datei | Neu (oder drücken Sie Strg + N). Wählen Sie im kommenden Fenster die Zwischenablage in der Dropdown-Liste Dokumenttyp aus. Die Anzahl der angezeigten Pixel ist die Seitenlänge des Zählquadrats. Beachten Sie die entsprechenden Pixel für die anderen Bilder und klicken Sie auf OK.
- Datei auswählen | Neu (oder Strg + N). Fügen Sie breite und lange (in Pixel) des Zählquadrats im kommenden Fenster entsprechend der Länge der Maßstabsleiste ein. Wählen Sie die Hintergrundfarbe Weiß, und drücken Sie dann OK.
- Klicken Sie auf Auswählen | Wählen Sie alle (oder Strg + A). Bearbeiten auswählen | Kopieren (oder Strg + C).
- Wählen Sie das Bild des Hornhautendothel, das in Schritt 3.1.1 geöffnet wurde. Bearbeiten auswählen | Fügen Sie (oder Strg + V) ein, um das Quadrat auf dem Foto des Hornhautendothels einzufügen.
- Wählen Sie die Ebene des Quadrats aus, und passen Sie die Transparenz an. Layer auswählen | Layer-Stil | Mischoptionen | Opazität auf 30 % einstellen | OK.
- Speichern Sie das Bild mit dem projizierten Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 m. Wiederholen Sie dies mit den anderen Bildern, die für die Analyse benötigt werden.
- Bewerten Sie die Endothelzelldichte und die morphologischen Parameter.
- Öffnen Sie die Bilder mit den projizierten Quadraten in ImageJ (Version 1.50i) und verwenden Sie das CellCounter PlugIn, um die Zellen innerhalb des Quadrats zu zählen. Öffnen Sie ImageJ, wählen Sie Datei | Öffnen (oder Strg + O) | Wählen Sie Bild.
HINWEIS: ImageJ und das CellCounter PlugIn stehen freeware zum Online-Download zur Verfügung. - Plugins auswählen | Cell_Counter | Zelle Zähler | Initialisierenvon . Zählen Sie die Endothelzellen und zeichnen Sie das Ergebnis auf. Zählen Sie auf zwei Seiten des Quadrats die Zellen, die durch den Rand des Quadrats geschnitten werden. Zählen Sie die geschnittenen Zellen nicht auf den beiden anderen Seiten.
- Analysieren Sie mindestens sechs Quadrate pro Hornhaut aus verschiedenen Bereichen (z. B. drei Bilder, zwei Quadrate pro Bild) und bestimmen Sie die durchschnittliche korneale Endothelzelldichte pro Quadrat (100 m2). Extrapolieren Sie die Endothelzelldichte pro 100 m2 bis 1 mm2 durch Multiplikation mit 100.
- Öffnen Sie die Bilder mit den projizierten Quadraten in ImageJ (Version 1.50i) und verwenden Sie das CellCounter PlugIn, um die Zellen innerhalb des Quadrats zu zählen. Öffnen Sie ImageJ, wählen Sie Datei | Öffnen (oder Strg + O) | Wählen Sie Bild.
- Für die Beurteilung morphologischer Veränderungen zählen Reformationszahlen (gemeinsames Treffen von 4 Zellen/Zellrändern statt drei), Rosettenformationen (charakteristisches rosetteförmiges Aussehen, fünf oder mehr radial angeordnete Zellen, die eine zerstörte Zelle umgeben ) oder alizarin rote Bereiche (zerstörte Zellen) in den projizierten Quadraten.
HINWEIS: Alternativ kann es sinnvoll sein, größere Quadrate (z. B. 200 x 200 m2) für die morphologische Analyse in gut erhaltenen Proben zu verwenden, um repräsentativere Ergebnisse zu erzielen.
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Representative Results
Die vorgestellte Seziertechnik impliziert eine teilweise Entfernung von Stromgewebe, was zu einer dünneren Hornhautprobe und damit zu einer geringeren stromalen Schwellung führt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Weniger stromale Schwellungen induziert weniger Scher- und Prisenkräfte, die einen negativen Einfluss auf das Hornhautendothel haben, wodurch niedrigere Endothelzellverlustraten6verursacht werden. Gespaltene Hornhautknöpfe zeigen eine deutlich besser erhaltene Endothelzellschicht nach 15 Tagen Kultivierung im Vergleich zu nicht gespaltenen Hornhautknöpfen und ganzen korneoskleralen Proben, die weniger endothelialer Zellverlust und eine geringere Anzahl von Reformationen widerspiegeln Figuren (4 Zellen/Zellränder, die nicht miteinander verbunden sind), Rosettenformationen (fünf oder mehr radial angeordnete Zellen, die sich an einem einzigen Punkt treffen) und Alizarin-rote (zerstörte) Zellen nach 15 Tagen6.
Über einen Zeitraum von 15 Tagen zeigen gespaltene Hornhautknöpfe einen stetigen Rückgang der endotheliale Zelldichte mit einem durchschnittlichen wöchentlichen prozentualen endotheliaden Zellverlust von 4,90% (n = 40, Abbildung 3). Ab Dem ersten Tag mit einer Endothelzelldichte von 4.033 x 146/163 Zellen/mm2 (Median bei 25%/75% Quartilen) verringerte sich die Zelldichte an Tag 8 auf 3.850 x 167/233 Zellen/mm2 und am 15. Tag auf 3.650 x 200/233 Zellen/mm2. Die ermittelten Zellverluste waren in der ersten und zweiten Woche ähnlich. An den Tagen 1 bis 8, 4,00 bis 2,17/1,93 % (Median bei 25 %/75 % Quartilen); Tage 8 bis 15, 4,88 bis 5,52/4,42 %; Tage 1 bis 15, 8,64 bis 4,32/2,71 %). Somit ist die angegebene Abnahmerate ähnlich der Rate, die bei menschlichen Spenderhornhäuten während des Anbaus in früheren Studien berichtet wurde10,11,12.
Morphologische Parameter wurden nach der Färbung der Endothelzellschicht am 15. Tag bewertet (n = 28, Abbildung 4). Die Reformationszahlen machten 7,18 bis 2,36/2,90 % (Median bei 25 %/75 % Quartil) der sich verschmelzenden Zellgrenzen aus. In den untersuchten Proben war ein Median von 1,11 x 1,11/15,56 Rosettenformationen/mm2 (Median n 25%/75% Quartil) vorhanden, während 13,33 x 4,44/11,67 Alizarin-Rot-Gefärbte Zellen/mm2 (Median bei 25%/75% Quartil) punktuelle Zellverluste markierten.
Abbildung 5 zeigt repräsentative Bilder des Hornhautendotheles während der mikroskopischen Auswertung in hBSS (Abbildung 5A) und nach der Färbung mit Trypanblau und Alizarinrot S (Abbildung 5B). Die Beurteilung der endothelialer Zelldichte in hBSS kann mehrfach durchgeführt werden (z. B. an den Tagen 1, 8 und 15), während gebeizte Proben zur Beurteilung morphologischer Parameter (Reformationszahlen, Rosettenbildungen, Alizarin rot gefärbt) verwendet werden können. Zellen) oder Bestimmung der Endothelzelldichte am Ende der Experimente aufgrund der zytotoxischen Eigenschaften der meisten Färbesubstanzen.
Wenn die geteilten Hornhautknöpfe versehentlich mit der endotheliale Seite nach unten gelegt und kultiviert werden, ist mit umfangreichen Endothelzellschäden zu rechnen (Abbildung 6A). Nicht gespaltene Hornhautknöpfe erleiden einen signifikant erhöhten Endothelzellverlust aufgrund von stromaler Schwellung, wodurch Descemets Membran über 15 Tage der Kultivierung faltet wird (Abbildung 6B), während geteilte Hornhautknöpfe eine weitgehend erhaltene Hornhautendothel nach 15 Tagen Kultivierung, angezeigt durch verstreute punktuelle Alizarin-Rot-Gefärbte Bereiche, die auf einzelne zerstörte Zellen hinweisen (Abbildung 6C).
Abbildung 2: Schematische Darstellung von nicht geteilten Hornhautknöpfen und geteilten Hornhautknöpfen. Nach der Entfernung von 300 m der Schweinehornhaut, einschließlich Epithel und großer Teile des Stromalgewebes, wird die Dicke der gespaltenen Hornhautknöpfe zugunsten einer besseren Konservierung des Hornhautendothels aufgrund einer verminderten Stromalschwellung im gesamten Anbau von bis zu 15 Tagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Endothelzelldichte (ECD) von geteilten Hornhautknöpfen über 15 Tage. Gespaltene Hornhautknöpfe (n = 40) zeigten einen stetigen Rückgang. ECD am Tag 1, 4.033 x 146/163 Zellen/mm2 (Median bei 25%/75% Quartil); Tag 8, 3.850 x 167/233 Zellen/mm2; Tag 15, 3.650 x 200/233 Zellen/mm2. Die Daten werden als Median von 25%/75% Quartilen dargestellt, Schnurrhaare stellen entweder Minimum und Maximum oder 1,5 des Interquartilbereichs (IQR) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Morphologische Parameter zur zusätzlichen Bewertung von Zellschäden und Umlagerungsprozessen. Mikroskopische Fotografien des Hornhautendothel in 400-facher Vergrößerung nach 15 Tagen Kultivierung und Färbung mit Trypanblau und Alizarin rot S zeigen (A) Reformationsfiguren (Pfeile, gemeinsames Treffen von vier oder mehr Zellen/Zellrändern statt drei), (B) Rosettenformationen (gepunkteter Kreis, zentrale abnehmende Zelle mit charakteristischen Rosettenformationen von fünf oder mehr benachbarten Zellen) und (C) alizarin rot gefärbte Zellen (gestrichelte Kreise, zerstörte Zellen). Die Daten (n = 28) werden als Median von 25%/75% Quartilen dargestellt. Whiskerstellen stellen entweder Minimal- und Maximal- oder 1,5 des Interquartilbereichs (IQR) dar. Kreise stellen Ausreißer dar, die nicht innerhalb des IQR liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ungefärbtes und gefärbtes Hornhautendothel. Die endotheliale Zellschicht, wie sie bei der mikroskopischen Auswertung (400x Vergrößerung) in (A) hypotonischen ausgewogenen Salzlösung (hBSS) gesehen wird, verursacht eine Endothelzellschwellung und damit eine bessere Zellsichtbarkeit und (B) nach Färbung mit Trypanblau und alizarin rot S. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Übersichtsfotos des Hornhautendothel von (A) einem auf dem Kopf kultivierten geteilten Hornhautknopf, (B) einem nicht gespaltenen Hornhautknopf und (C) einem gespaltenen Hornhautknopf nach der Färbung. Fotos zeigen das Hornhautendothel nach der Färbung mit Trypanblau und Alizarin rot S. (A) Umfangreiche Hornhaut-Endothelzellschäden (roter Bereich) werden beobachtet, nachdem gespaltene Hornhautknöpfe mit der endotheliaalen Seite nach unten nach unten kultiviert werden Kultivierungswoche. (B) Deutlich erhöhte Endothelzellschäden in nicht gespaltenen Hornhautknöpfen durch Descemets Membranfaltung und stromale Schwellung nach 15 Tagen Kultivierung (rote Streifen). (C) Gespaltene Hornhautknöpfe zeigen nach 15 Tagen Kultivierung eine gut erhaltene Endothelzellschicht, die nur pünktlich zerstörte Zellen zeigt, die in alizarinrot gefärbten Bereichen zu sehen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Schweinesplit-Hornhautknöpfen, die ein standardisiertes und kostengünstiges ex vivo korneales endotheliales Organkulturmodell für Forschungszwecke darstellt6. Porcin Split Hornhautknöpfe zeigten eine Abnahme der Endothelzelldichte vergleichbar mit Endothelzellverlusten, die in menschlichen Spenderhornhäuten beobachtet wurden, die in Augenbänken über einen Zeitraum von zwei Wochen kultiviert wurden6,10,11, 12.
Die Überlegenheit gegenüber nicht gespaltenen Hornhautknöpfen sowie ganzen porcine korneoskleralen Proben wurde zuvor6gezeigt. In dieser Studie wurden drei Gruppen an den Tagen 1, 8 und 15 verglichen. Das Hornhautendothel aller Gruppen (korneosklerale Knöpfe, nicht gespaltene Hornhautknöpfe, geteilte Hornhautknöpfe) war am ersten Tag in gutem Zustand, dargestellt durch eine gut erhaltene Endothelzellschicht6. Aufgrund einer stromalen Schwellung zerstörte die Faltung der Descemet-Membran jedoch große Teile des Endothels ganzer korneoskleraler Proben, so dass eine repräsentative Beurteilung der kornealen Endothelzelldichte an den Tagen 8 und 15 nicht durchgeführt werden konnte. Obwohl das Endothel der nicht gespaltenen Hornhautknöpfe bis zum 15. Tag gut erhalten war, waren auch einige Descemet-Membranfalten vorhanden. Obwohl im Vergleich zu den korneoskleralen Proben die Endothelzellschicht von nicht gespaltenen Hornhautknöpfen in einem besseren Zustand war, war die Endothelzellschicht der geteilten Hornhautknöpfe in einem viel besseren Zustand. Dies lässt sich in quantitativen und qualitativen Parametern absehen, da der Endothelzellverlust innerhalb von 15 Tagen nach der Kultivierung signifikant höher war (p = 0,041) in nicht geteilten Hornhautknöpfen (-575 x 25/250 Zellen/mm2) im Vergleich zu geteilten Hornhautknöpfen (-417 138/179 Zellen/mm2), die mit den ermittelten morphologischen Merkmalen in einem regelmäßigeren Sechseckzellmuster übereinstimmen, weniger Reformationsfiguren und Rosettenbildungen sowie weniger zerstörte Zellen (Alizarin-rote Bereiche) in geteilten Hornhautknöpfe6. Prozentuale Endothelzellverluste bestätigen diese Befunde, da der prozentuale Zellverlust innerhalb von 15 Tagen in nicht geteilten und geteilten Hornhautknöpfen 14,89 % bzw. 10,2 % (p = 0,032) bzw.6beträgt. Da diese Methode für einen Zeitraum von bis zu 15 Tagen validiert wurde, erlaubt sie längere Beobachtungszeiträume als bisher veröffentlichte Studien (72 bis 120 h)3,4,5.
Die Verbesserungen bei der Erhaltung der Endothelzellschicht, die häufige Kultivierungsprotokolle auch in Augenbänken anwenden, können ausschließlich auf die reduzierte Schwellung der Hornhautstroma zurückgeführt werden, da ein großer Teil (300 m) des Stroma vor Anbau6,13. Normalerweise neigt der Stroma dazu, während der Kultivierung aufgrund seiner hydrophilen Eigenschaften und Moleküle, die in das Stromalgewebe eingebettet sind, enorm anzuschwellen14,15. Die Schwellung, die Scher- und Prisenkräfte induziert, und Die Membranfaltung von Descemet, die auch eine mechanische Belastung des Hornhautendothels und des Endothelzellverlustes verursacht, werden nach teilweiser Entfernung der stroma6,10reduziert. Im Gegensatz zu Augenbänken, die oft osmotische Wirkstoffe wie Dextran verwenden, um menschliche Spenderhornhäuten vor der Transplantation zu entschärfen, erfordern gespaltene Hornhautknöpfe keine osmotische Entschärfung16,17. Als Kulturmedium mit Dextran ergänzt ist bekannt, von hornhauten Endothelzellen absorbiert werden und erhöhte Zellverlust7,8,9,18,19 induzieren ,20, eliminiert die Kultivierung von gespaltenen Hornhautknöpfen ohne Dextran (oder andere osmotische Mittel) so viele negative toxische Faktoren wie möglich6. Da das Kulturmedium in der vorgestellten Methode nicht durch Zusatzstoffe ergänzt wird, werden keine toxischen Einflüsse erwartet, die durch einen zugesetzten Stoff verursacht werden, was dieses Modell für Untersuchungen von Biokompatibilitätstests neuer Substanzen wertvoll macht.
Obwohl das Hornhautendothel eine sehr empfindliche Zellschicht ist und die Herstellung von gespaltenen Hornhautknöpfen moderate chirurgische Fähigkeiten und schonendes Handling erfordert, kann diese Technik eine standardisierte Methode sein, um mit Auswirkungen verschiedener Faktoren auf das Hornhautendothel innerhalb eines sehr angemessenen Zeitrahmens. Dennoch gibt es ein paar Schritte in diesem Protokoll, wo das Hornhautendothel gefährdet ist. Offensichtlich müssen beschädigte oder undurchsichtige Augen sorgfältig identifiziert und am Anfang verworfen werden, um mögliche Verzerrungen zu verhindern. Auch das Hornhautendothel muss während der Trephination, Dessektion, Extraktion und Handhabung (z. B. Übertragung von Auge zu Kulturplatte, von Kulturplatte zu Kulturplatte usw.) von gespaltenen Hornhautknöpfen immer unberührt bleiben, um mechanische Beschädigungen. Bei der oberflächlichen Platzierung der Naht in der Stroma kann das Endothel möglicherweise durchdrungen werden, wenn die Nadel versehentlich zu weit in die Tiefe eingeführt wird. Wenn ja, wird spürbare Flüssigkeit aus der vorderen Augenkammer durch den Nahtkanal geleitet und das entsprechende Auge muss entsorgt werden. Um dies zu verhindern, sollte die Nadel oberflächlich im Stroma aufbewahrt werden. Darüber hinaus ist darauf zu achten, dass der Hornhautknopf mit dem Skalpell horizontal geteilt wird. Ungleichmäßiges Schneiden führt zu ungleichmäßigen Schwellungen während der Kultivierung, möglicherweise verursacht erhöhte Endothelzellverlust.
Die Untersuchung von ungefärbten hornhauten Endothelzellen in hBSS wird häufig in menschlichen Spenderhornhäuten durchgeführt. Es gibt keine Hinweise auf signifikante Zellschäden, die durch osmotische Schwellung der Endothelzellen für die gewählte Untersuchungszeit von gespaltenen Hornhautknöpfen in hBSS3verursacht werden. Obwohl die Färbung die Sichtbarkeit von Zellrändern verbessert, führt ungefärbtes Zählen nicht zu signifikant unterschiedlichen Ergebnissen der Endothelzelldichte im Vergleich zur Geinnzählung21. Der klare Vorteil der ungefärbten Zählung besteht darin, dass sie im Laufe der Experimente mehrere Nachuntersuchungen ermöglicht, während Färbestoffe in der Regel zytotoxisch sind und die Beobachtungszeit beenden. Die gefärbte Zählung bleibt jedoch wichtig, um die morphologischen Eigenschaften des Endothels zu beurteilen. Trypan blue hebt die Kerne beschädigter Zellen hervor, die bei unbefleckter Zählung oft unbeschädigt erscheinen. Alizarin rot S verbessert deutlich die Sichtbarkeit der Zellränder und beschädigten Zellen, indem es die Membran des Descemet färbt, was die Beurteilung der Endothelzelldichte erleichtert und die Analyse morphologischer Merkmale des Hornhautendothels ermöglicht. , wie Reformationsfiguren, Rosettenformationen und Alizarin-Rot-Gefärbte Zellen (Abbildung 4).
Eine wesentliche Einschränkung der geteilten Hornhautknöpfe als Ex-vivo-Modell ist, dass sie, genau wie In-vitro-Modelle, nur für die Untersuchung externer Einflüsse auf hornehautendotheliale Zellen geeignet sind. Daher sind In-vivo-Modelle unersetzlich für die Forschung an systemischen Krankheiten und Erkrankungen mit Auswirkungen auf das Auge und das Hornhautendothel. Unabhängig davon kann diese Herstellungstechnik valide Daten generieren, um die Auswirkungen verschiedener externer Faktoren auf das Hornhautendothel (z.B. bei der Biokompatibilitätsprüfung neuer Substanzen) zu testen22. Nach dem 3R-Prinzip (Ersatz, Reduktion, Verfeinerung) zur Verringerung der Anzahl lebender Tierversuche bietet diese Methode ein angemessenes Forschungsmodell, um die Kluft zwischen In-vitro-Zellkulturen weiter zu schließen, wobei die Ergebnisse oft unpassend mit den vivo Situation beim Menschen und Tierforschung, die erhebliche Anstrengungen erfordert und zunehmend ethische Bedenken aufwirft23.
Aufgrund ihrer Eigenschaften und Verfügbarkeit scheinen Schweineaugen der einzige adäquate Ersatz für menschliche Augen für Forschungszwecke zu sein. Corneas von nicht-menschlichen Primaten sind aus ethischen Gründen und Verfügbarkeit keine gute Alternative, obwohl diese Tiere die am nächsten am Menschen am nächsten sind. Andererseits sind die Augen kleinerer Tiere einfach zu klein, um eine effiziente Hornhautentfernung zu ermöglichen. Schweineaugen sind mit menschlichen Augen in der Größe vergleichbar und zeigen ähnliche Eigenschaften der hornhauten Endothelzellen, was sich auch in der Forschung über mögliche zukünftige Xenotransplantationen genetisch veränderter Schweinehornhäutenwiderspiegelt 24, 25,26. Auch als Nebenprodukt von Schlachthöfen sind sie leicht zu erhalten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellte Methode mit Porenhorneas ein hochreproduzierbares organotypisch kultiviertes Forschungsmodell bietet, das eine kosteneffiziente Forschung an hornförmigen Endothelzellen ermöglicht. Zukünftige Forscher können geteilte Hornhautknöpfe verwenden, um die Auswirkungen verschiedener Faktoren wie neue Substanzen, chirurgische Techniken, Ausrüstung und andere mögliche äußere Einflüsse zu analysieren, bei denen das Hornhautendothel von großem Interesse ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Erstellung des vorgestellten Forschungsmodells wurde von KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) des Bundesministeriums für Bildung und Forschung Deutschland unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
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