Summary
Hier wordt een stap-voor-stap protocol voor de bereiding en de teelt van de corneale knoppen van het varkens gesplitst. Aangezien dit organo-typisch gecultiveerde orgel cultuur model de celsterfte binnen 15 dagen weergeeft, vergelijkbaar met de menselijke donor cornea's, vertegenwoordigt het het eerste model dat langdurige teelt van niet-humane cornea's toestaat zonder toxische dextran toe te voegen.
Abstract
Experimenteel onderzoek naar corneale endotheliale cellen wordt geassocieerd met verschillende moeilijkheden. Menselijke donor cornea's zijn schaars en zelden beschikbaar voor experimentele onderzoeken, omdat ze normaalgesproken nodig zijn voor transplantatie. Endotheliale celculturen vertalen vaak niet goed naar in vivo situaties. Vanwege de biostructurele kenmerken van niet-menselijke cornea's induceert stromale zwelling tijdens de teelt substantieel verlies van corneale endotheliale cellen, waardoor het moeilijk is om de teelt voor een langere periode uit te voeren. Dezwelling agenten zoals dextran worden gebruikt om deze reactie tegen te gaan. Echter, ze veroorzaken ook aanzienlijke endotheel celverlies. Daarom is een ex vivo-orgel cultuur model vastgesteld dat geen dezwelling middelen nodig heeft. Varkens ogen van een plaatselijk slachthuis werden gebruikt om gesplitste corneale knoppen voor te bereiden. Na gedeeltelijke corneale trephination werden de buitenste lagen van het hoornvlies (epitheel, Bowman-laag, delen van de stroma) verwijderd. Dit vermindert aanzienlijk het corneale endotheelcelverlies geïnduceerd door massale stromale zwelling en het membraan van Descemet in langere teelt periodes en verbetert het algemene behoud van de endotheliale cellaag. Daaropvolgende volledige corneale trephination werd gevolgd door het verwijderen van de gesplitste corneale knop van de resterende oogbol en de teelt. De endotheliale celdichtheid werd beoordeeld bij follow-uptijden van maximaal 15 dagen na de bereiding (d.w.z. dagen 1, 8, 15) met behulp van lichte microscopie. De bereidingstechniek zorgt voor een beter behoud van de endotheliale cellaag die wordt ingeschakeld door minder stromale weefsel zwelling, wat resulteert in langzame en lineaire afname percentages in gesplitste corneale knoppen vergelijkbaar met menselijke donor cornea's. Aangezien dit gestandaardiseerde organo-typisch gecultiveerde onderzoeksmodel voor de eerste keer een stabiele teelt mogelijk maakt gedurende ten minste twee weken, is het een waardevol alternatief voor menselijke donor cornea's voor toekomstig onderzoek naar verschillende externe factoren met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel.
Introduction
Corneale transplantatie procedures behoren tot de meest frequent uitgevoerde transplantaties wereldwijd1. Aangezien er een ernstig tekort is aan menselijke donor cornea's, is experimenteel onderzoek naar het aanpakken van corneale endotheel cellen in menselijke cornea's moeilijk uit te voeren1. De introductie van irrigatie oplossingen en andere stoffen die in het oog worden gebruikt, oftalmische viscoelastische apparaten, evenals chirurgische instrumenten en technieken (bijv. phacoemulficatie-instrumenten en-technieken, ultrasone energie) vereist geldige en uitgebreide onderzoeken met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel vóór klinisch gebruik.
Er zijn weinig alternatieven voor de menselijke donor cornea's voor onderzoek. Dieronderzoek modellen zijn zeer waardevol, maar tegelijkertijd zeer hulpbronnen consumeren en steeds meer ethisch worden ondervraagd. Een groot nadeel van in vitro celculturen is hun beperkte vertaling naar het menselijk oog. Resultaten verkregen uit celculturen kunnen in vivo voorwaarden zijn, omdat cellen endotheliale mesenchymale overgang (EMT) kunnen ondergaan, resulterend in fibroblast-achtige morfologie veroorzaakt door het verlies van celpolariteit en veranderingen in de celvorm en het gen expressie2.
Terwijl eerdere ex vivo-modellen teelt perioden van maximaal 120 uur meldden, werd onlangs een nieuwe voorbereidings techniek voor het opzetten van een varkens corneale endotheliale orgel cultuur model door het kweken van vers varken cornea's gedurende ten minste 15 dagen geïntroduceerd3 ,4,5,6. Als het corneale epitheel en delen van de stroma worden verwijderd (ongeveer 300 μm in totaal) van het hoornvlies vóór de teelt, zwelling van de stroma wordt verlaagd in gesplitste corneale knoppen resulterend in minder endotheel celverlies en een goed onderhouden endotheliale cellaag na maximaal 15 dagen, terwijl niet-gesplitste corneale knoppen significant endotheel celverlies vertonen als gevolg van ongelijke stromale zwelling en vorming van de plooien van Descemet. Oogbanken gebruiken meestal osmotische dezwelling agenten zoals dextran om zwelling van cornea's te verminderen voorafgaand aan transplantatie. Echter, deze agenten werden aangetoond voor het opwekken van verhoogde endotheel celverlies7,8,9.
Dit artikel is bedoeld om dit gestandaardiseerde ex vivo onderzoeksmodel in een gedetailleerd stap-voor-stap protocol te visualiseren om toekomstige onderzoekers in staat te stellen onderzoek te doen naar het corneale endotheel met behulp van gesplitste corneale knoppen. Dit model is een eenvoudige methode om stoffen en technieken te testen die in het oog worden gebruikt, zoals oftalmische viscoelastische apparaten, irrigatie oplossingen en ultrasone energie, of andere procedures waarbij het corneale endotheel van belang is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de ethische richtlijnen van onze instelling. In overeenstemming met de statuten van de Commissie voor ethische toetsing van onze instelling, moest voorafgaand aan de experimenten geen ethische goedkeuring worden verkregen, omdat alle varkens cornea's werden verkregen van het lokale slachthuis.
1. orgel cultuur
- Bereid varkens ogen.
- Van het plaatselijke slachthuis, het verkrijgen van varkens ogen die kort na het slachten zijn verwijderd maar vóór thermische behandeling. Transport van de ogen naar het lab en ze te verwerken binnen een paar uur. Houd tijdens het transport de ogen bij kamertemperatuur (ongeveer 21 °C) voor de verwerking.
- Verwijder alle orbitale adnexen (oogspieren, conjunctiva, vetweefsel) voorafgaand aan desinfectie met oogschaar en Colibri-Tang. Scheid en gooi alle ogen weg met een duidelijk trauma, externe schade (bijv. messen snede) of zichtbare corneale opaciteiten.
- Bereid een 5% jodium-PBS-oplossing (1:20) in een steriele beker door 3 mL 7,5% Povidon jodium toe te voegen aan 57 mL van een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Maak ook een aparte steriele beker met 60 mL zuivere PBS.
Opmerking: de totale hoeveelheid gebruikte jodium-PBS-oplossing en de grootte van de beker hangt af van het aantal cornea's dat moet worden ontleed. Vijf tot zes ogen vereisen ongeveer 60 mL van de 5%-jodium-PBS-oplossing om goed te worden gedesinfecteerd. - Breng vijf tot zes ogen in de 5%-jodium-PBS oplossing voor een totaal van 5 min om het oppervlak van de ogen goed te desinfecteren. Roer elke minuut voorzichtig om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de ogen volledig wordt ondergedompeld en volledig in de jodiumoplossing wordt gedesinfecteerd.
- Breng na 5 min de gedesinfecteerde ogen over naar de bereide beker gevuld met zuivere PBS. Nogmaals, roer voorzichtig om ervoor te zorgen dat de jodium-PBS-oplossing wordt weggewassen van het oppervlak van de ogen.
Opmerking: Voer deze stap op een schone Bank uit om verontreiniging van de gedesinfecteerde ogen te voorkomen.
- Bereid celcultuurplaten.
Opmerking: Voer de volgende stappen uit op een schone Bank met constante laminaire luchtstroom.- Ontdooien 2 mL foetaal kalf serum (FCS). Vul een spuit (5 mL) met de FCS met behulp van een stompe canule. Maak de spuit leeg via een spuit filter (0,22 μm) om mogelijke bacteriële verontreiniging van de FCS te voorkomen in 80 mL dextran-vrij kweekmedium I (minimaal essentieel medium [MEM] met zouten van Earle, penicillaire/streptomycine, L-glutamine [200 mM], Amfotericine B [250 μg/mL], Hepes-buffer [1 M] [50x], NaHCO3en gedistilleerd water). Agitate het mengsel om te zorgen voor een gelijkmatige substraat verdeling.
- Vul elke put van een 12 well Cell Culture Plate met 3 mL van het substraat mengsel.
- Voer een dissectie en incubatie uit.
Opmerking: Voer deze stap uit op een schone Bank. Raak het corneale endotheel niet aan met enige instrumenten.- Breng een oogbol van de beker met PBS in de oogbollen houder met het hoornvlies naar boven gericht en plaats deze onder een Oogheelkundige chirurgische Microscoop. Gebruik een spuit gevuld met 0,9% NaCl om wat zuigkracht aan te brengen op het oog over de oogbol houder om het oog in positie te fixeren voor dissectie.
- Gebruik een trefine (ø 7,5 mm) met een gestandaardiseerde inleg, die ervoor zorgt dat de getreesde diepte niet hoger is dan 300 μm, om oppervlakkig te snijden in het centrale hoornvlies (Figuur 1a).
- Gebruik Colibri pincet en een scalpel voor eenmalig gebruik met een driehoekig blad om het gedeeltelijk getreesde deel van het hoornvlies horizontaal door de stroma te knippen en te verwijderen. Gooi het afgescheiden corneale deel dat bestaat uit het hoornvliesepitheel, de Bowman-laag en een deel van de stroma weg.
Opmerking: Houd de horizontale snij richting strikt in stand om een gelijkmatige dikte van de resterende stroma te verkrijgen. - Plaats in de stroma oppervlakkig een 10-0 hecht (10-0 polyamide 6) om de endotheel van de stromale zijde te kunnen onderscheiden tijdens de experimenten (Figuur 1B). Voorkom penetratie van het corneale endotheel. Gooi de oogbol weg als het endotheel is gepenetreerd.
Opmerking: penetratie van het corneale endotheel met de naald zal zichtbaar zijn, zoals vloeistof uit de voorste oogkamer zal lekken door het hecht kanaal. - Gebruik de trefine zonder inleg om de doorboorde tot volle diepte te snijden totdat de voorste oogkamer is bereikt (Figuur 1C). Een duidelijke daling van de weerstand en vocht lekken uit de voorste oogkamer kan worden waargenomen na volledige penetratie van het hoornvlies.
Let op: gebruik een hockey mes als de gesplitste corneale knop aan één kant van de gesplitste corneale knop blijft bevestigd na het trepheren. - Breng de verkregen gesplitste corneale knop, die bestaat uit een deel van de stroma (Figuur 2), het membraan van de Descemet en het corneale endotheel, over in het kweekmedium (kweekmedium I + FCS, zie punt 1,2) in de 12 well Cell Culture Plate met de gelabelde zijde naar beneden gericht, zodat het corneale endotheel naar boven wordt gericht.
Opmerking: als de endotheliale zijde naar beneden is gericht, kan het endotheel beschadigd raken. - Wijs een individueel nummer toe aan elke gesplitste corneale knop voor identificatie tijdens de follow-ups en label de putjes op de celkweek plaat dienovereenkomstig.
- Incuberen de gevulde celculturen in een incubator onder standaardomstandigheden bij een temperatuur van 37 °C, 5% CO2 en een relatieve luchtvochtigheid van 95%. Verander het kweekmedium (cultuurmedium I + FCS) op dag 8 als een incubatieperiode van 7 dagen wordt overschreden.
Opmerking: de incubatie procedure met behulp van gesplitste corneale knoppen is gevalideerd voor maximaal 15 dagen.
Figuur 1: dissectie van het varkens hoornvlies om gesplitste corneale knoppen te verkrijgen. A) natrephatie van de cornea met behulp van een trefine met een inlay om te snijden in een diepte van 300 μm en verwijdering van het epitheel en delen van het stromale weefsel, (B) een hechtmiddel oppervlakkig in de stroma wordt geplaatst zonder penetratie van de corneale Endotheel voor latere identificatie van de stromale zijde. C) volledige trephatie van het overgebleven hoornvlies wordt gevolgd door (D) het verwijderen van de verkregen gesplitste corneale knop van de oogbol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. microscopie en onderzoek van het endotheel
- Voer onbevlekt onderzoek uit.
Opmerking: onbevlekt onderzoek kan meerdere keren worden uitgevoerd (bijvoorbeeld bij wekelijkse follow-ups op dag 1, 8 en 15). Echter, niet-bevlekt tellen maakt alleen de beoordeling van de endotheliale celdichtheid mogelijk, niet morfologische parameters.- Vul 3 mL hypotone gebalanceerde zoutoplossing (hBSS, zie compositie in de tabel van de materialen) in elke put van een 12 well Cell Culture Plate. Plaats voorzichtig een enkele gesplitste corneale knop in hBSS om zwelling van de corneale endotheliale cellen te induceren en de zichtbaarheid van de cellen voor de celtelling te verbeteren.
Opmerking: Zorg ervoor dat de endotheliale zijde naar de richting van de Microscoop wordt gericht. Als een omgekeerde fasecontrastmicroscoop wordt gebruikt, moet de endotheel zijde naar beneden worden gericht. Terwijl op zijn plaats, de cultuur plaat mag niet worden verplaatst om te voorkomen dat endotheel cel schade. - Laat de cellen 1-2 minuten opzwellen alvorens een foto van het endotheel te nemen met de camera die aan de Microscoop is bevestigd. Neem ten minste drie foto's van ten minste drie verschillende gebieden om een representatieve indruk te krijgen van de werkelijke toestand van het corneale endotheel. Voeg een schaalbalk toe met de ware schaal lengte van 100 μm voor een latere analyse van de dichtheid van de corneale endotheliale cel en de morfologische parameters.
- Om osmotische schade te voorkomen, verwijder de gesplitste corneale knop van de hBSS na maximaal 5 minuten en breng deze terug in het kweekmedium3.
- Vul 3 mL hypotone gebalanceerde zoutoplossing (hBSS, zie compositie in de tabel van de materialen) in elke put van een 12 well Cell Culture Plate. Plaats voorzichtig een enkele gesplitste corneale knop in hBSS om zwelling van de corneale endotheliale cellen te induceren en de zichtbaarheid van de cellen voor de celtelling te verbeteren.
- Voer gekleurd onderzoek uit.
Opmerking: kleuring beëindigt de experimenten, aangezien de gebruikte kleurings stoffen cytotoxisch zijn. Daarom kan vlekken alleen worden uitgevoerd aan het einde van de observatieperiode voor de beoordeling van morfologische parameters (Reformatie figuren, rozet formaties, Alizarine rood gekleurd cellen).- Bereid een 0,25% trypeen blauwe oplossing en 0,2% Alizarine rode S oplossing voor de kleurings procedure.
- Verdun voor de 0,25% trypaanse blauwe oplossing de 0,4% trypaanse blauwe oplossing met een 0,9% NaCl-oplossing.
Opmerking: om bijvoorbeeld 20 mL van een 0,25% trypeen blauwe oplossing te verkrijgen, Verdun 12,5 mL van de 0,4% trypeen blauwe oplossing met 7,5 mL van de 0,9% NaCl-oplossing. De trypaanse blauwe oplossing kan gedurende enkele weken of maanden bij kamertemperatuur worden bewaard. - Om een 0,2% Alizarine Red S-oplossing te verkrijgen, lost u 100 mg van het Alizarine rode S poeder op in 50 mL van een 0,9% NaCl-oplossing onder constant roeren en verwarmen tot 50 °C op een magneet roer plaat met verwarmingsfunctie. Om mogelijke precipitaten te verwijderen, filtert u de verkregen oplossing. Stel de pH van de Alizarine Red S-oplossing in op pH 4,2 door het toevoegen van natriumhydroxide of zoutzuur dienovereenkomstig.
Opmerking: voordat elke toepassing van de Alizarine Red S-oplossing ervoor zorgt dat de pH wordt gecorrigeerd naar 4,2 en dat er geen precipitaten in de oplossing zijn. De oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard. Bewaar de oplossing niet langer dan 4 weken.
- Verdun voor de 0,25% trypaanse blauwe oplossing de 0,4% trypaanse blauwe oplossing met een 0,9% NaCl-oplossing.
- Plaats de gesplitste corneale knoppen in Petri schaaltjes met de endotheliale zijde naar boven gericht om de endotheelcellen te vlekken. Gebruik een pipet om de 0,25% trypan Blue Solution druppel per druppel te druppelen op het corneale endotheel voor 90 s.
Opmerking: Trypan Blue maakt het mogelijk beschadigde corneale cellen te identificeren met een permeabel membraan omdat het hun kernen kleurt. - Spoel de gesplitste corneale knop 3 x in 0,9% NaCl voorzichtig af in een klein glazen bekerglas. Nogmaals, gebruik een pipet om langzaam de 0,2% Alizarine Red S-oplossing te druppelen door druppel op het corneale endotheel voor 90 S.
Opmerking: Alizarin Red S vlekken op het membraan van de Descemet, die helpt bij het markeren van celranden in onbeschadigde corneale endotheliale cellen en om vernietigde cellen te markeren wanneer het onderliggende membraan van de Descemet zichtbaar wordt. Ook maakt het gemakkelijk identificeren van grotere vernietigde gebieden. - Voor onderzoek van het bevlekte corneale endotheel volgt u de stappen uitgelegd voor onbevlekt tellen in paragraaf 2,1.
- Bereid een 0,25% trypeen blauwe oplossing en 0,2% Alizarine rode S oplossing voor de kleurings procedure.
3. analyse van de corneale endotheliale celdichtheid en morfologische parameters
- Project tellings pleinen op de Foto's met behulp van een grafische bewerkingssoftware (tabel met materialen).
- Open de software en open een beeld van het corneale endotheel door bestand te selecteren | Open | Selecteren.
- Projecteer een vierkant met een True-to-scale zijlengte van 100 μm op de afbeelding.
Opmerking: de volgende stappen van sectie 3.1.2 kunnen worden genegeerd als de weergavesoftware het projecteren van kwadraten op de foto mogelijk maakt. De zijlengte van het vierkant hangt af van de resolutie van de beelden genomen met de camera van de Microscoop en kan worden berekend met de schaalbalk.- De schaalbalk bijsnijden van de foto genomen met de Microscoop: Selecteer het gereedschap Rechthoekig selectiekader op de werkbalk of druk op M, rand de schaalbalk en selecteer vervolgens bewerken | Bijsnijden of druk op CTRL + X.
- Klik op bestand | Nieuw (of druk op CTRL + N). Selecteer in het komende venster Klembord in de vervolgkeuzelijst document type . Het aantal getoonde pixels is de zijlengte van het telplein. Noteer de corresponderende pixels voor de andere afbeeldingen en klik op OK.
- Selecteer bestand | Nieuw (of CTRL + N). Voeg de breedte en lengte (in pixels) van het telplein in het aanstaande venster toe op basis van de lengte van de schaalbalk. Selecteer achtergrondkleur witen druk vervolgens op OK.
- Klik op selecteren | Selecteer alles (of CTRL + A). Selecteer bewerken | Kopiëren (of CTRL + C).
- Selecteer de afbeelding van het corneale endotheel geopend in stap 3.1.1. Selecteer bewerken | Plak (of CTRL + V) om het vierkant op de foto van het corneale endotheel in te voegen.
- Selecteer de laag van het kwadraat en pas de transparantie aan. Laag selecteren | Laagstijl | Opties voor overvloeien | Dekking instellen op 30% | OK.
- Sla de afbeelding op met het geprojecteerde vierkant met een True-to-scale zijlengte van 100 μm. Herhaal dit met de andere afbeeldingen die nodig zijn voor analyse.
- Evalueer de endotheliale celdichtheid en morfologische parameters.
- Open de afbeeldingen met de geprojecteerde vierkantjes in ImageJ (versie 1.50 i) en gebruik de plug-in CellCounter om de cellen op het vierkant te tellen. Open ImageJ, selecteer bestand | Openen (of CTRL + O) | Selecteer afbeelding.
Opmerking: ImageJ en de CellCounter PlugIn zijn freeware beschikbaar om online te downloaden. - Selecteer plugins | Cell_Counter | Cel teller | Initialiseren. Tel de endotheliale cellen en noteer het resultaat. Tel op twee zijden van het vierkant de cellen die door de rand van het plein worden gesneden. Tel geen snij cellen aan de andere twee zijden.
- Analyseer ten minste zes vierkantjes per hoornvlies uit verschillende gebieden (bijv. drie Foto's, twee vierkantjes per foto) en bepaal de gemiddelde celdichtheid van de corneale endotheel per vierkant (100 μm2). Extrapoleren de endotheliale celdichtheid per 100 μm2 tot 1 mm2 door vermenigvuldiging met 100.
- Open de afbeeldingen met de geprojecteerde vierkantjes in ImageJ (versie 1.50 i) en gebruik de plug-in CellCounter om de cellen op het vierkant te tellen. Open ImageJ, selecteer bestand | Openen (of CTRL + O) | Selecteer afbeelding.
- Voor de beoordeling van morfologische veranderingen, aantal Reformatie cijfers (gezamenlijke vergadering van ≥ 4 cellen/celranden in plaats van drie), rozet formaties (karakteristieke rozet vormige verschijning, vijf of meer radiaal gerangschikte cellen rond een vernietigde cel ), of Alizarine rode gebieden (vernietigde cellen) in de geprojecteerde vierkantjes.
Opmerking: als alternatief kan het nuttig zijn om grotere kwadraten (bijvoorbeeld 200 x 200 μm2) te gebruiken voor morfologische analyse in goed bewaarde monsters om meer representatieve resultaten te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gepresenteerde dissectie techniek impliceert gedeeltelijke verwijdering van stromale weefsel, resulterend in een dunner cornea monster en dus minder stromale zwelling (Figuur 1 en Figuur 2). Minder stromale zwelling induceert minder afschuiving en knijp krachten die een negatieve invloed hebben op het corneale endotheel, waardoor lagere endotheliale celverlies percentages6. Splitsen corneale knoppen vertonen een significant beter bewaarde endotheliale cellaag na 15 dagen van de teelt in vergelijking met niet-gesplitste corneale knoppen en hele corneoscleral monsters, die minder endotheliale celverlies en een lager aantal Reformatie weerspiegelt cijfers (≥ 4 cellen/celranden samengevoegd in plaats van drie), rozet formaties (vijf of meer radiaal gerangschikte cellen bijeen in een enkele vlek), en Alizarine rode (vernietigde) cellen na 15 dagen6.
Over een periode van 15 dagen, splitsen corneale knoppen vertonen een gestage afname van de endotheliale celdichtheid met een gemiddelde wekelijkse percentale endotheliale celverlies van 4,90% (n = 40, Figuur 3). Beginnend op dag 1 met een endotheliale celdichtheid van 4.033 ± 146/163 cellen/mm2 (mediaan ± 25%/75% quartiles), daalde de celdichtheid tot 3.850 ± 167/233 cellen/mm2 op dag 8 en 3.650 ± 200/233 cellen/mm2 op dag 15. Bepaalde celverliezen waren voor de eerste en tweede week gelijk. Op dagen 1 − 8, 4,00 ± 2.17/1.93% (mediaan ± 25%/75% kwartiel); dagen 8 − 15, 4,88 ± 5.52/4.42%; dagen 1 − 15, 8,64 ± 4.32/2.71%). Zo is het gegeven afwijings percentage gelijk aan het percentage dat is gerapporteerd in menselijke donor cornea's tijdens de teelt in eerdere studies10,11,12.
Morfologische parameters werden beoordeeld na kleuring van de endotheliale cellaag op dag 15 (n = 28, Figuur 4). Reformatie cijfers zijn 7,18 ± 2,36/2.90% (mediaan ± 25%/75% kwartiel) van de samenvoegings celranden. Een mediaan van 1,11 ± 1.11/15.56 rozet formaties/mm2 (mediaan ± 25%/75% quartiles) waren aanwezig in de onderzochte monsters, terwijl 13,33 ± 4.44/11.67 Alizarine rood gekleurd cellen/mm2 (mediaan ± 25%/75% kwartiel) gemarkeerd punctuele celverliezen.
Figuur 5 geeft representatieve beelden van het corneale endotheel tijdens de microscopische evaluatie in hBSS (Figuur 5A) en na kleuring met trypan Blue en Alizarine Red S (Figuur 5B). De beoordeling van de endotheliale celdichtheid in hBSS kan meerdere malen worden uitgevoerd (bijvoorbeeld op dag 1, 8 en 15), terwijl bevlekte monsters kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van morfologische parameters (Reformatie figuren, rozet formaties, Alizarine rood gebeitst cellen) of de bepaling van de endotheliale celdichtheid aan het einde van de experimenten als gevolg van de cytotoxische eigenschappen van de meeste kleurings stoffen.
Als de gesplitste corneale knoppen worden geplaatst en gekweekt met de endotheliale zijde naar beneden gericht per ongeluk, uitgebreide endotheelcel schade is te verwachten (Figuur 6A). Niet-gesplitste corneale knoppen lijden significant verhoogd endotheel celverlies als gevolg van stromale zwelling, waardoor het membraan van Descemet meer dan 15 dagen na de teelt wordt gevouwen (Figuur 6B), terwijl gesplitste corneale knoppen een grotendeels bewaard gebleven corneale endotheel na 15 dagen van de teelt, aangegeven door verspreide punctuele Alizarine rood gekleurd gebieden die duiden op enkele vernietigde cellen (Figuur 6C).
Afbeelding 2: Schematische illustratie van niet-gesplitste corneale knoppen en gesplitste corneale knoppen. Na verwijdering van 300 μm van het varkens hoornvlies, inclusief epitheel en belangrijke delen van het stromale weefsel, wordt de dikte van gesplitste corneale knoppen verlaagd ten gunste van een betere instandhouding van het corneale endotheel als gevolg van een verminderde stromale zwelling gedurende teelt van maximaal 15 dagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: endotheliale celdichtheid (ECD) van gesplitste corneale knoppen over 15 dagen. Splitsen corneale knoppen (n = 40) toonde een gestage afname. ECD op dag 1, 4.033 ± 146/163 cellen/mm2 (mediaan ± 25%/75% quartiles); dag 8, 3.850 ± 167/233 cellen/mm2; dag 15, 3.650 ± 200/233 cellen/mm2. Gegevens worden afgebeeld als mediaan ± 25%/75% kwartiel, snorharen vertegenwoordigen ofwel minimum en maximum of 1,5 van het interkwartielbereik (IQR). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: morfologische parameters voor aanvullende evaluatie van celbeschadiging en herschikking van processen. Microscopische foto's van het corneale endotheel in 400x vergroting na 15 dagen van de teelt en kleuring met trypan blauw en Alizarine rood S tonen (a) Reformatie figuren (pijlen, gezamenlijke vergadering van vier of meer cellen/celranden in plaats van drie), (B) rozet formaties (gestippelde cirkel, centrale afnemende cel met karakteristieke rozet formaties van vijf of meer aangrenzende cellen) en (C) Alizarine rood gebeitst cellen (onderbroken cirkels, vernietigde cellen). Gegevens (n = 28) worden afgebeeld als mediaan ± 25%/75% kwartiel. Snorharen vertegenwoordigen minimaal en maximaal of 1,5 van het interkwartielbereik (IQR). Cirkels vertegenwoordigen uitschieters niet binnen de IQR. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: onbevlekt en gekleurd corneale endotheel. De endotheliale cellaag zoals gezien tijdens microscopische evaluatie (400x vergroting) in (a) hypotone gebalanceerde zoutoplossing (hBSS) waardoor endotheliale celzwelling en dus beter zicht op de cel en (B) na kleuring met trypan Blue en Alizarine Red S. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: overzichts foto's van het corneale endotheel van (a) een gesplitste corneale knop ondersteboven geteeld, (B) een niet-gesplitste corneale knop, en (C) een gesplitste corneale knop na kleuring. Foto's tonen het corneale endotheel na kleuring met trypan Blue en Alizarine Red S. (a) uitgebreide corneale endotheliale celbeschadiging (rood gebied) wordt waargenomen na gesplitste corneale knoppen worden gekweekt met de endotheliale zijde naar beneden gericht na een week van de teelt. B) de schade aan de endotheelcel significant verhoogd in niet-gesplitste corneale knoppen als gevolg van het opvouwen van het membraan van Descemet en stromale zwelling na 15 dagen van de teelt (rode strepen). C) de corneale knoppen splitsen vertonen een goed bewaarde endotheliale cellaag na 15 dagen van de teelt alleen tonen punctuele vernietigde cellen in Alizarine rood bevlekt gebieden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor de bereiding van de corneale knoop knoppen van varkens, die een gestandaardiseerd en voordelig ex vivo corneale endotheliaal orgel cultuur model voor onderzoeksdoeleinden6vertegenwoordigt. Porcine Split corneale knoppen toonden een afname van de endotheliale celdichtheid vergelijkbaar met endotheliale celverliezen waargenomen bij menselijke donor cornea's gekweekt in oogbanken over een periode van twee weken6,10,11, 12.
De superioriteit boven niet-gesplitste corneale knoppen en hele varkens corneoscleral monsters werd eerder weergegeven6. In die studie werden drie groepen vergeleken op de dagen 1, 8 en 15. Het corneale endotheel van alle groepen (corneoscleral knoppen, niet-gesplitste corneale knoppen, gesplitste corneale knoppen) was in goede staat op dag 1, vertegenwoordigd door een goed bewaarde endotheliale cellaag6. Echter, als gevolg van stromale zwelling, vouwen van het membraan van de Descemet vernietigde grote delen van het endotheel van hele corneoscleral monsters, zodat een representatieve beoordeling van de corneale endotheliale celdichtheid op de dagen 8 en 15 niet kon worden uitgevoerd. Hoewel het endotheel van de niet-gesplitste corneale knoppen tot dag 15 goed bewaard was gebleven, waren ook de membraan plooien van Descemet aanwezig. Hoewel in vergelijking met de corneoscleral monsters de endotheliale cellaag van niet-gesplitste corneale knoppen was in betere conditie, de endotheliale cellaag van de gesplitste corneale knoppen was in veel betere conditie. Dit kan worden gezien in kwantitatieve en kwalitatieve parameters, aangezien het verlies van endotheel cellen binnen 15 dagen na de teelt significant hoger was (p = 0,041) in niet-gesplitste corneale knoppen (-575 ± 25/250 cellen/mm2) vergeleken met gesplitste corneale knoppen (-417 ± 138/179 cellen/mm2), die congruent aan de vastgestelde morfologische kenmerken die zichtbaar zijn in een meer regulier zeshoekig celpatroon, minder Reformatie cijfers en rozet formaties, evenals minder vernietigde cellen (alizarin rode gebieden) in Split corneale knoppen6. Percentale endotheliale celverliezen bevestigen deze bevindingen, aangezien het percentale celverlies binnen 15 dagen in niet-gesplitste en gesplitste corneale knoppen 14,89% en 10,2% (p = 0,032) respectievelijk6. Aangezien deze methode is gevalideerd voor een periode van maximaal 15 dagen, kunnen langere observatie perioden dan gepubliceerde studies tot nu toe (72 tot 120 h)3,4,5.
De verbeteringen in het behoud van de endotheliale cellaag, het toepassen van gemeenschappelijke cultivatie protocollen die ook in oogbanken worden gebruikt, kunnen uitsluitend worden toegeschreven aan de verminderde zwelling van de corneale stroma, aangezien een groot deel (300 μm) van de stroma wordt verwijderd voordat teelt6,13. Normaalgesproken neigt de stroma enorm te zwellen tijdens de teelt vanwege de hydrofiele eigenschappen en moleculen ingebed in het stromale weefsel14,15. Zwelling, die shear en knijpen krachten induceert en Descemet membraan vouwen, die ook veroorzaakt mechanische belasting op het corneale endotheel en endotheliale celverlies, worden verlaagd na gedeeltelijke verwijdering van de stroma6,10. In tegenstelling tot oogbanken, die vaak osmotische agentia zoals dextran gebruiken voor de menselijke donor cornea's vóór de transplantatie, vereisen gesplitste corneale knoppen geen osmotische dezwelling16,17. Aangezien het bekend is dat het kweekmedium, aangevuld met dextran, wordt geabsorbeerd door corneale endotheelcellen en om een verhoogd celverlies te veroorzaken7,8,9,18,19 ,20, de teelt van gesplitste corneale knoppen zonder dextran (of andere osmotische agenten) elimineert zoveel negatieve toxische factoren als mogelijk6. Aangezien het kweekmedium niet wordt aangevuld met additieven in de gepresenteerde methode, worden er geen toxische invloeden verwacht die door een toegevoegde stof worden veroorzaakt, waardoor dit model waardevol is voor onderzoek naar biocompatibiliteitstesten van nieuwe stoffen.
Hoewel het corneale endotheel een zeer delicate cellaag is en de bereiding van gesplitste corneale knoppen matige chirurgische vaardigheden en voorzichtige behandeling vereist, kan deze techniek een gestandaardiseerde methode zijn om mee te werken en betrouwbare resultaten te verkrijgen met betrekking tot de effecten van verschillende factoren op het corneale endotheel binnen een zeer redelijke tijdsbestek. Niettemin, er zijn een paar stappen in dit protocol waar het corneale endotheel in gevaar is. Duidelijk beschadigde of ondoorzichtige ogen moeten in het begin zorgvuldig worden geïdentificeerd en weggegooid om mogelijke vooroordelen te voorkomen. Ook moet het corneale endotheel altijd onaangeroerd blijven tijdens trephination, dissectie, extractie en hantering (bijv. het overbrengen van het oog naar de kweek plaat, van de kweek plaat naar de kweek plaat, enz.) van de corneale knoppen splitsen om te voorkomen dat mechanische beschadiging. Bij het oppervlakkig plaatsen van de hechtdraad in de stroma, kan het endotheel mogelijk worden gepenetreerd als de naald per ongeluk te ver in de diepte wordt ingebracht. Als dat zo is, zal een merkbaar vocht uit de voorste oogkamer door het hecht kanaal passeren en het overeenkomstige oog moet worden weggegooid. Om dit te voorkomen, moet de naald oppervlakkig worden gehouden binnen de stroma. Bovendien moet men voorzichtig zijn om de corneale knop horizontaal te splitsen met behulp van de scalpel. Ongelijkmatig snijden zal resulteren in ongelijke zwelling tijdens de teelt, mogelijk veroorzaakt verhoogde endotheel celverlies.
Het onderzoek van niet-bevlekte corneale endotheliale cellen in hBSS wordt gewoonlijk uitgevoerd in humane donor cornea's. Er is geen bewijs voor significante celschade veroorzaakt door osmotische zwelling van de endotheelcellen voor de gekozen onderzoektijd van gesplitste corneale knoppen in hBSS3. Hoewel vlekken de zichtbaarheid van celranden vergroot, resulteert het niet-bevlekt tellen niet in significant verschillende resultaten van de endotheliale celdichtheid in vergelijking met gekleurd tellen21. Het duidelijke voordeel van het niet-bevlekt tellen is dat het meerdere follow-upexamens in de loop van de experimenten mogelijk maakt, terwijl kleurings stoffen gewoonlijk cytotoxisch zijn en de observatieperiode beëindigen. Gekleurd tellen blijft echter belangrijk om de morfologische kenmerken van het endotheel te beoordelen. Trypan Blue belicht de kernen van beschadigde cellen die vaak onbeschadigd lijken in niet-bevlekt tellen. Alizarin Red S verbetert duidelijk de zichtbaarheid van de celranden en beschadigde cellen door kleuring van het membraan van Descemet, dat de beoordeling van de endotheliale celdichtheid vergemakkelijkt en de analyse van morfologische kenmerken van het corneale endotheel mogelijk maakt , zoals Reformatie figuren, rozet formaties en rood gekleurde Alizarine-cellen (Figuur 4).
Een belangrijke beperking van gesplitste corneale knoppen als ex vivo model is dat ze, net als in vitro modellen, alleen geschikt zijn voor het onderzoeken van externe invloeden op corneale endotheelcellen. Daarom zijn in vivo modellen onvervangbaar voor onderzoek naar systemische ziekten en aandoeningen met een impact op het oog en het corneale endotheel. Ongeacht, deze voorbereidings techniek kan geldige gegevens genereren voor het testen van de effecten van verschillende externe factoren op het corneale endotheel (bijv. in biocompatibiliteitstesten van nieuwe stoffen)22. Naar aanleiding van het 3R-principe (vervanging, reductie, verfijning) om het aantal levende dier experimenten te verminderen, biedt deze methode een adequaat onderzoeksmodel om de kloof tussen in vitro celculturen verder te dichten, waar de resultaten vaak ongerijmend zijn voor de in vivo-situatie bij mensen, en dierlijk onderzoek, dat aanzienlijke inspanningen vergt en steeds meer ethische bezwaren oproept23.
Vanwege hun eigenschappen en beschikbaarheid, varkens ogen lijken te zijn de enige adequate substituut voor menselijke ogen voor onderzoeksdoeleinden. Cornea's van niet-menselijke primaten zijn niet een goed alternatief als gevolg van ethische redenen en beschikbaarheid, hoewel deze dieren de dichtstbijzijnde soort voor de mens zijn. Aan de andere kant zijn de ogen van kleinere dieren gewoon te klein om efficiënt hoornvlies te verwijderen. Varkens ogen zijn vergelijkbaar met menselijke ogen in grootte en vertonen vergelijkbare eigenschappen van de corneale endotheliale cellen, die ook tot uitdrukking komt in het onderzoek naar mogelijke toekomstige xenotransplantatie van genetisch gemodificeerde varkens cornea's24, 25,26. Als bijproduct van slachthuizen zijn ze ook gemakkelijk te verkrijgen.
Concluderend, de gepresenteerde methode met behulp van varkens cornea's biedt een zeer reproduceerbare organo-typisch gecultiveerde onderzoeksmodel waardoor kostenefficiënt onderzoek naar corneale endotheliale cellen. Toekomstige onderzoekers kunnen gebruikmaken van gesplitste corneale knoppen om de effecten van verschillende factoren te analyseren, zoals nieuwe stoffen, chirurgische technieken, apparatuur en andere mogelijke externe invloeden waar het corneale endotheel van groot belang is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De oprichting van het gepresenteerde onderzoeksmodel werd gesteund door KMU-Innovativ (FKZ: 13GW0037F) van het federale ministerie van onderwijs en onderzoek Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
