Summary
Ici, un protocole étape par étape pour la préparation et la culture des boutons cornéens fendus porcins est présenté. Comme ce modèle de culture d'organes organo-typiquement cultivé montre des taux de mortalité cellulaire dans les 15 jours, comparables aux cornées de donneurs humains, il représente le premier modèle permettant la culture à long terme de cornées non humaines sans ajouter de dextran toxique.
Abstract
La recherche expérimentale sur les cellules endothéliales cornéennes est associée à plusieurs difficultés. Les cornées de donneur humain sont rares et rarement disponibles pour des investigations expérimentales car elles sont normalement nécessaires pour la transplantation. Les cultures cellulaires endothéliales ne se traduisent souvent pas bien dans des situations in vivo. En raison des caractéristiques biostructurales des cornées non humaines, le gonflement stromal pendant la culture induit la perte substantielle de cellules endothéliales cornéennes, qui le rend difficile d'exécuter la culture pendant une période prolongée de temps. Des agents de dégonflement tels que le dextran sont utilisés pour contrecarrer cette réponse. Cependant, ils causent également la perte significative de cellules endothéliales. Par conséquent, un modèle ex vivo de culture d'organe n'exigeant pas des agents degonflement a été établi. Les yeux de porc d'un abattoir local ont été utilisés pour préparer des boutons cornésaux fendus. Après la tréphination cornéenne partielle, les couches extérieures de la cornée (épithélium, couche d'archer, parties du stroma) ont été enlevées. Ceci réduit de manière significative la perte endothéliale cornéenne induite par le gonflement stromal massif et le pliage de membrane de Descemet pendant de plus longues périodes de culture et améliore la conservation générale de la couche cellulaire endothéliale. La tréphination cornée complète suivante a été suivie par l'enlèvement du bouton cornéen fendu de l'ampoule et de la culture restantes d'oeil. La densité cellulaire endothéliale a été évaluée à des heures de suivi allant jusqu'à 15 jours après la préparation (c.-à-d., jours 1, 8, 15) utilisant la microscopie légère. La technique de préparation utilisée permet une meilleure préservation de la couche cellulaire endothéliale permise par moins de gonflement des tissus stromaux, ce qui entraîne des taux de déclin lents et linéaires dans les boutons cornésaux fendus comparables aux cornées des donneurs humains. Comme ce modèle de recherche organo-typiquement cultivé standardisé permet pour la première fois une culture stable pendant au moins deux semaines, il s'agit d'une alternative valable aux cornées des donneurs humains pour les études futures de divers facteurs externes en ce qui concerne leur effets sur l'endothélium cornéen.
Introduction
Les procédures de transplantation cornéenne sont parmi les transplantations les plus couramment effectuées dans le monde1. Comme il y a une grave pénurie de cornées de donneurs humains, il est difficile d'effectuer1. Cependant, l'introduction de solutions d'irrigation et d'autres substances utilisées dans l'œil, les dispositifs viscoélastiques ophtalmiques, ainsi que les instruments et techniques chirurgicaux (p. ex., instruments et techniques de phacoemulsification, énergie par ultrasons) nécessite des investigations valides et étendues concernant leurs effets sur l'endothélium cornéen avant utilisation clinique.
Il existe peu d'alternatives aux cornées de donneurs humains pour la recherche. Les modèles de recherche sur les animaux sont très précieux, mais en même temps très gourmands en ressources et de plus en plus remis en question sur le plan éthique. Un inconvénient majeur des cultures cellulaires in vitro est leur traduction limitée à l'œil humain. Les résultats obtenus à partir de cultures cellulaires peuvent être incongrus à des conditions in vivo, parce que les cellules peuvent subir une transition mésenchymale endothéliale (EMT), résultant en morphologie fibroblaste-like causée par la perte de polarité cellulaire et les changements dans la forme cellulaire et le gène expression2.
Alors que les modèles ex vivo précédents ont rapporté des périodes de culture allant jusqu'à seulement 120 h, une nouvelle technique de préparation pour établir un modèle de culture endothéliale endothéliale de porc porc porcin en creusant les cornées fraîches pendant au moins 15 jours a été récemment introduite3 ,4,5,6. Si l'épithélium cornéen et certaines parties du stroma sont retirés (environ 300 m au total) de la cornée avant la culture, l'enflure du stroma est réduite en boutons cornésaux fendus, ce qui entraîne une diminution de la perte de cellules endothéliales et une endothéliale bien entretenue. couche cellulaire après jusqu'à 15 jours, tandis que les boutons cornéens non divisés montrent une perte importante de cellules endothéliales due à un gonflement stromal inégal et la formation des plis de Descemet. Les banques oculaires utilisent habituellement des agents de dégonflement osmotiques tels que le dextran pour réduire l'enflure des cornées avant la transplantation. Cependant, ces agents ont été montrés pour induire la perte endothéliale accrue de cellules7,8,9.
Cet article vise à visualiser ce modèle de recherche ex vivo standardisé dans un protocole détaillé étape par étape afin de permettre aux futurs chercheurs d'effectuer des recherches sur l'endothélium cornéen à l'aide de boutons cornésiens fendus. Ce modèle représente une méthode simple pour tester les substances et les techniques utilisées dans l'œil, telles que les dispositifs viscoélastiques ophtalmiques, les solutions d'irrigation et l'énergie par ultrasons, ou d'autres procédures où l'endothélium cornéen est d'intérêt.
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Protocol
Ce protocole suit les lignes directrices éthiques de notre institution. Conformément aux statuts du comité d'examen éthique de notre institution, aucune approbation éthique n'a dû être obtenue avant les expériences, car toutes les cornées porcines ont été obtenues de l'abattoir local.
1. Culture d'orgue
- Préparer les yeux de porc.
- De l'abattoir local, obtenir des yeux de porc qui ont été enlevés peu de temps après l'autopsie, mais avant le traitement thermique. Transportez les yeux au laboratoire et traitez-les en quelques heures. Pendant le transport, gardez les yeux à température ambiante (environ 21 oC) avant le traitement.
- Enlever tous les adnexes orbitaux (muscles oculaires, conjonctive, tissu adipeux) avant la désinfection à l'aide de ciseaux pour les yeux et de forceps colibri. Séparez et jetez tous les yeux avec un traumatisme évident, des dommages externes (p. ex., une coupe au couteau) ou des opacités cornéennes visibles.
- Préparer une solution de 5 % d'iode-PBS (1:20) dans une tasse stérile en ajoutant 3 ml d'iode povidone de 7,5 % à 57 ml d'une solution saline saline tamponnée au phosphate (PBS). Préparez également une tasse stérile séparée contenant 60 ml de PBS pur.
REMARQUE : La quantité totale de solution iode-PBS utilisée et la taille de la tasse dépendent du nombre de cornées à disséquer. Cinq à six yeux nécessitent environ 60 ml de la solution 5%-iode-PBS pour être désinfecté correctement. - Mettez cinq à six yeux dans la solution 5%-iode-PBS pour un total de 5 min pour désinfecter correctement la surface des yeux. Remuer soigneusement chaque minute pour s'assurer que la surface des yeux est complètement immergée et désinfectée complètement dans la solution d'iode.
- Après 5 min, transférer les yeux désinfectés dans la tasse préparée remplie de PBS pur. Encore une fois, remuer soigneusement pour s'assurer que l'iode-PBS-solution est lavé de la surface des yeux.
REMARQUE : Effectuez cette étape sur un banc propre pour empêcher la contamination des yeux désinfectés.
- Préparer les plaques de culture cellulaire.
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes sur un banc propre avec un flux d'air laminaire constant.- Décongeler 2 ml de sérum fœtal de veau (FCS). Remplir une seringue (5 ml) avec le FCS à l'aide d'une canule émoussée. Videz la seringue à travers un filtre à seringues (0,22 m) pour prévenir une éventuelle contamination bactérienne du FCS en 80 ml de milieu de culture sans dextran I (milieu essentiel minimum [MEM] avec sels d'Earle, pénicilline/streptomycine, L-glutamine [200 mM], amphotericin B [250 g/mL], hémato-tampon Hepes [1 M][50x], NaHCO3, et eau distillée). Agiter le mélange pour assurer une distribution uniforme du substrat.
- Remplir chaque puits d'une plaque de culture de cellules de 12 puits avec 3 ml du mélange de substrat.
- Effectuer la dissection et l'incubation.
REMARQUE: Effectuer cette étape sur un banc propre. Ne touchez pas l'endothélium cornéen avec des instruments.- Transférer une ampoule oculaire de la tasse avec PBS dans le support de l'ampoule oculaire avec la cornée vers le haut et le placer sous un microscope chirurgical ophtalmique. Utilisez une seringue remplie de 0,9% NaCl pour appliquer légèrement une certaine aspiration à l'œil sur le support de l'ampoule pour fixer l'œil en position de dissection.
- Utiliser une trephine (7,5 mm) contenant une inlaye normalisée, ce qui garantit que la profondeur trephined ne dépassera pas 300 m, pour couper superficiellement dans la cornée centrale (figure 1A).
- Utilisez des forceps colibri et un scalpel à usage unique avec une lame triangulaire pour couper et enlever la partie partiellement trephined de la cornée horizontalement à travers le stroma. Jetez la partie cornéenne séparée composée de l'épithélium cornéen, de la couche d'archer et d'une partie du stroma.
REMARQUE : Maintenez strictement la direction horizontale de coupe pour obtenir une épaisseur égale du stroma restant. - Placer superficiellement une suture 10-0 (10-0 polyamide 6) dans le stroma pour être en mesure de différencier l'endothéliale du côté stromal au cours des expériences (Figure 1B). Empêcher la pénétration de l'endothélium cornéen. Jetez l'ampoule oculaire si l'endothélium est pénétré.
REMARQUE : La pénétration de l'endothélium cornéen avec l'aiguille suturing sera visible, car le fluide de la chambre antérieure d'oeil coulera par le canal de suture. - Utilisez la trephine sans l'inlay pour faire avancer la coupe trephined à pleine profondeur jusqu'à ce que la chambre oculaire antérieure soit atteinte (Figure 1C). Une baisse distincte de la résistance et de la fuite de liquide de la chambre oculaire antérieure peut être perçue après une pénétration complète de la cornée.
REMARQUE : Utilisez un couteau de hockey si le bouton cornée fendu reste fixé d'un côté du bouton cornéen fendu après la tréphination. - Transférer le bouton cornée fendu obtenu, maintenant composé d'une partie du stroma (figure 2), la membrane du Descemet, et l'endothélium cornéen, dans le milieu de culture (culture moyenne I - FCS, voir section 1.2) dans la plaque de culture de 12 puits de cellules avec le côté étiqueté vers le bas, de sorte que l'endothélium cornéen est tourné vers le haut.
REMARQUE : Si le côté endothélial est tourné vers le bas, l'endothélium peut être endommagé. - Attribuez un numéro individuel à chaque bouton cornéen fendu pour identification pendant les suivis et étiquetez les puits sur la plaque de culture cellulaire en conséquence.
- Incuber les plaques de culture cellulaire remplies dans un incubateur dans des conditions standard à une température de 37 oC, 5 % de CO2 et une humidité relative de l'air de 95 %. Changer le milieu de culture (culture moyenne I et FCS) le jour 8 si une période d'incubation de 7 jours est dépassée.
REMARQUE : La procédure d'incubation à l'aide de boutons cornésaux fendus a été validée jusqu'à 15 jours.
Figure 1 : Dissection de la cornée porcine pour obtenir des boutons cornésiaux fendus. (A) Après le tréphination de la cornée à l'aide d'une trephine avec une inlaye à couper en profondeur de 300 m et l'enlèvement de l'épithélium et des parties du tissu stromal, (B) une suture est placée superficiellement dans le stroma sans pénétration de la cornée endothélium pour l'identification ultérieure du côté stromal. (C) Le tréphination complet de la cornée restante est suivi par (D) l'enlèvement du bouton cornéen fendu obtenu de l'ampoule d'oeil. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Microscopie et examen de l'endothélium
- Effectuer un examen non taché.
REMARQUE : L'examen non taché peut être effectué plusieurs fois (p. ex., lors d'un suivi hebdomadaire les jours 1, 8 et 15). Cependant, le comptage non taché ne permet que l'évaluation de la densité cellulaire endothéliale, et non des paramètres morphologiques.- Remplir 3 ml de solution de sel hypotonique équilibrée (hBSS, voir composition dans table des matériaux) dans chaque puits d'une plaque de culture de cellules de 12 puits. Placez soigneusement un seul bouton cornéen fendu dans hBSS pour induire le gonflement des cellules endothéliales cornéennes et améliorer la visibilité des cellules pour le comptage cellulaire.
REMARQUE : Assurez-vous que le côté endothélial fait face à la direction du microscope. Si un microscope de contraste de phase inversée est utilisé, le côté endothélial doit être orienté vers le bas. Pendant qu'elle est en place, la plaque de culture ne doit pas être déplacée pour prévenir les dommages aux cellules endothéliales. - Laissez les cellules gonfler pendant 1-2 min avant de prendre une photo de l'endothélium avec la caméra attachée au microscope. Prenez au moins trois photographies d'au moins trois zones différentes afin d'obtenir une impression représentative de l'état réel de l'endothélium cornéen. Ajoutez une barre d'échelle avec la longueur vraie à l'échelle de 100 m pour l'analyse ultérieure de la densité des cellules endothéliales cornéennes et des paramètres morphologiques.
- Pour éviter les dommages osmotiques, retirez le bouton cornéen fendu du hBSS après un maximum de 5 min et transférez-le de nouveau dans le milieu de culture3.
- Remplir 3 ml de solution de sel hypotonique équilibrée (hBSS, voir composition dans table des matériaux) dans chaque puits d'une plaque de culture de cellules de 12 puits. Placez soigneusement un seul bouton cornéen fendu dans hBSS pour induire le gonflement des cellules endothéliales cornéennes et améliorer la visibilité des cellules pour le comptage cellulaire.
- Effectuer un examen taché.
REMARQUE : La coloration met fin aux expériences, car les substances de coloration utilisées sont cytotoxiques. Par conséquent, la coloration ne peut être effectuée qu'à la fin de la période d'observation pour l'évaluation des paramètres morphologiques (figures de réforme, formations de rosettes, cellules tachées rouges alizarines).- Préparer une solution de 0,25% trypan bleu et 0,2% alizarin rouge S solution pour la procédure de coloration.
- Pour la solution trypan blue de 0,25 %, diluez la solution bleu trypan de 0,4 % avec une solution NaCl de 0,9 %.
REMARQUE : Par exemple, pour obtenir 20 ml d'une solution bleu trypan de 0,25 %, diluer 12,5 ml de la solution bleu trypan de 0,4 % avec 7,5 ml de la solution NaCl de 0,9 %. La solution bleu trypan peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs semaines ou mois. - Pour obtenir une solution S rouge alizarin e de 0,2 %, dissoudre 100 mg de la poudre Rouge Alizarin S en 50 ml d'une solution NaCl de 0,9 % sous un mouvement constant et un chauffage à 50 oC sur une plaque d'agitation aimante avec fonction chauffante. Pour éliminer les précipités possibles, filtrez la solution obtenue. Ajuster le pH de la solution Rouge Alizarin S au pH 4.2 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium ou de l'acide chlorhydrique en conséquence.
REMARQUE : Avant chaque application de la solution Rouge S alizarin, assurez-vous que le pH est corrigé à 4,2 et qu'il n'y a pas de précipités dans la solution. La solution peut être stockée à température ambiante. Ne pas stocker la solution pendant plus de 4 semaines.
- Pour la solution trypan blue de 0,25 %, diluez la solution bleu trypan de 0,4 % avec une solution NaCl de 0,9 %.
- Placez les boutons cornés fendus dans les plats Petri avec le côté endothélial tourné vers le haut afin de tacher les cellules endothéliales. Utilisez une pipette pour égoutter lentement la solution trypan bleue de 0,25 % goutte à goutte sur l'endothélium cornéen pendant 90 s.
REMARQUE: Trypan bleu permet d'identifier les cellules cornées endommagées avec une membrane perméable, car il tache leurs noyaux. - Rincer soigneusement le bouton cornée fendu 3x dans 0.9% NaCl dans un petit bécher en verre. Encore une fois, utilisez une pipette pour égoutter lentement la solution S rouge alizarin de 0,2 % goutte à goutte sur l'endothélium cornéen pendant 90 s.
REMARQUE : Alizarin rouge S tache la membrane du Descemet, qui aide à mettre en évidence les bordures cellulaires dans les cellules endothéliales cornéennes intactes et à mettre en évidence les cellules détruites lorsque la membrane sous-jacente de Descemet devient visible. En outre, il permet d'identifier facilement les grandes zones détruites. - Pour l'examen de l'endothélium cornéen taché, suivez les étapes expliquées pour le comptage non taché à la section 2.1.
- Préparer une solution de 0,25% trypan bleu et 0,2% alizarin rouge S solution pour la procédure de coloration.
3. Analyse de la densité des cellules endothéliales cornéennes et des paramètres morphologiques
- Projet de comptage des carrés sur les images à l'aide d'un logiciel d'édition graphique (Table of Materials).
- Ouvrez le logiciel et ouvrez une image de l'endothélium cornéen en sélectionnant le fichier. Ouvert à l'ouvert Sélectionnez.
- Projetez un carré avec une longueur latérale réelle à l'échelle de 100 m sur l'image.
REMARQUE : Les étapes suivantes de la section 3.1.2 peuvent être ignorées si le logiciel de visualisation permet de projeter des carrés de comptage sur l'image. La longueur latérale du carré dépend de la résolution des images prises avec la caméra du microscope et peut être calculée avec la barre d'échelle.- Recadrez la barre d'échelle à partir de la photographie prise avec le microscope : sélectionnez l'outil Rectangulaire Demarquee sur la barre d'outils ou appuyez sur M, puis borduredez la barre d'échelle, puis sélectionnez Edit . Crop ou appuyez sur Ctrl x.
- Cliquer sur Le Fichier Nouveau (ou appuyez sur Ctrl n. Sur la fenêtre à venir, sélectionnez Clipboard dans la liste de déclassement du type de document. Le nombre de pixels indiqués est la longueur latérale du carré de comptage. Notez les pixels correspondants pour les autres images et cliquez sur OK.
- Sélectionner le fichier Nouveau (ou Ctrl n). Insérer la largeur et la longueur (en pixels) du carré de comptage dans la fenêtre à venir en fonction de la longueur de la barre d'échelle. Sélectionnez couleur d'arrière-plan blanc, puis appuyez sur OK.
- Cliquez sur Sélectionner Sélectionnez tous (ou Ctrl et A). Sélectionnez Modifier Copie (ou Ctrl et C).
- Sélectionnez l'image de l'endothélium cornéen ouvert à l'étape 3.1.1. Sélectionnez Modifier Pâte (ou Ctrl et V) pour insérer le carré sur la photo de l'endothélium cornéen.
- Sélectionnez la couche du carré et ajustez la transparence. Sélectionner La couche Style de la couche Options de mélange (en anglais seulement) Définir opacité à 30% OK.
- Enregistrer l'image avec le carré projeté avec une longueur latérale réelle à l'échelle de 100 m. Répétez avec les autres images nécessaires à l'analyse.
- Évaluer la densité cellulaire endothéliale et les paramètres morphologiques.
- Ouvrez les images avec les carrés projetés dans ImageJ (Version 1.50i) et utilisez le CellCounter PlugIn pour compter les cellules dans le carré. Ouvrez ImageJ, sélectionnez Fichier Ouvrez (ou Ctrl et O) Sélectionnez Image.
REMARQUE: ImageJ et le CellCounter PlugIn sont freeware disponibles en téléchargement en ligne. - Sélectionnez Plugins Cell-Counter - France Compteur de cellules (en anglais) Initialize. Comptez les cellules endothéliales et enregistrez le résultat. Sur les deux côtés du carré, compter les cellules qui sont coupées par le bord de la place. Ne comptez pas les cellules coupées des deux autres côtés.
- Analyser au moins six carrés par cornée à partir de différentes zones (p. ex., trois photos, deux carrés par image) et déterminer la densité moyenne des cellules endothéliales cornéennes par carré (100 m2). Extrapoler la densité cellulaire endothéliale par 100 m2 à 1 mm2 en multipliant par 100.
- Ouvrez les images avec les carrés projetés dans ImageJ (Version 1.50i) et utilisez le CellCounter PlugIn pour compter les cellules dans le carré. Ouvrez ImageJ, sélectionnez Fichier Ouvrez (ou Ctrl et O) Sélectionnez Image.
- Pour l'évaluation des changements morphologiques, compter les chiffres de la réforme (réunion conjointe de 4 cellules/frontières cellulaires au lieu de trois), les formations de rosette (aspect caractéristique en forme de rosette, cinq cellules ou plus disposées radialement autour d'une cellule détruite ), ou zones rouges alizarines (cellules détruites) dans les carrés projetés.
REMARQUE : Il peut également être utile d'utiliser des carrés plus grands (p. ex., 200 x 200 m2) pour l'analyse morphologique dans des échantillons bien conservés afin d'obtenir des résultats plus représentatifs.
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Representative Results
La technique de dissection présentée implique l'ablation partielle du tissu stromal, ce qui entraîne un échantillon de cornée plus mince et donc moins de gonflement stromal(figure 1 et figure 2). Moins de gonflement stromal induit moins de cisaillement et de pincement forces qui ont un impact négatif sur l'endothélium cornéen, causant ainsi des taux inférieurs de perte cellulaire endothéliale6. Les boutons cornésaux fendus montrent une couche cellulaire endothéliale nettement mieux préservée après 15 jours de culture par rapport aux boutons cornéens non fendus et aux échantillons cornéoséens entiers, qui reflètent moins de perte de cellules endothéliales et un nombre inférieur de réforme (4 cellules/frontières cellulaires confondues au lieu de trois), formations de rosettes (cinq cellules ou plus disposées radialement se rencontrant en un seul endroit) et cellules rouges alizarines (détruites) après 15 jours6.
Sur une période de 15 jours, les boutons cornésiaux fendus montrent une baisse constante de la densité cellulaire endothéliale avec une perte hebdomadaire moyenne de cellules centhéliales de 4,90 % (n - 40, figure 3). Commençant le premier jour avec une densité cellulaire endothéliale de 4 033 à 146/163 cellules/mm2 (médiane s'il y a 25 %/75 % de quartiles), la densité cellulaire a diminué à 3 850 , 167/233 cellules/mm2 le jour 8, et 3 650 à 200/233 cellules/mm2 le jour 15. Les pertes cellulaires déterminées étaient similaires pour la première et la deuxième semaine. Les jours 1 à 8, 4,00 à 2,17/1,93 % (médianes de 25 %/75 % de quartiles); jours 8-15, 4,88 à 5,52/4,42%; jours 1-15, 8,64 à 4,32/2,71 %. Ainsi, le taux de déclin donné est similaire au taux rapporté chez les cornées des donneurs humains pendant la culture dans les études précédentes10,11,12.
Les paramètres morphologiques ont été évalués après la coloration de la couche cellulaire endothéliale le jour 15 (n ' 28, figure 4). Les chiffres de la réforme représentaient 7,18 à 2,36/2,90 % (médianes de 25 %/75 % de quartiles) des frontières cellulaires fusionnées. Une médiane de 1,11 à 1,11/15,56 formations de rosette/mm 2 (médiane s'il y a25 %/75 % de quartiles) était présente dans les échantillons étudiés, tandis que 13,33 à 4,44/11,67 alizarin cellules tachées rouges/mm2 (médianes de 25 %/75 % de quartiles) ont marqué des pertes de cellules ponctuelles.
La figure 5 fournit des images représentatives de l'endothélium cornéen lors de l'évaluation microscopique dans hBSS (Figure 5A) et après coloration avec le bleu trypan et le rouge alizarin S (Figure 5B). L'évaluation de la densité cellulaire endothéliale dans le SSH peut être effectuée plusieurs fois (p. ex., les jours 1, 8 et 15), tandis que des échantillons tachés peuvent être utilisés pour l'évaluation des paramètres morphologiques (chiffres de réforme, formations de rosettes, alizarin rouge taché cellules) ou la détermination de la densité cellulaire endothéliale à la fin des expériences en raison des propriétés cytotoxiques de la plupart des substances de coloration.
Si les boutons cornésiaux fendus sont placés et cultivés avec le côté endothélial face vers le bas par accident, des dommages importants aux cellules endothéliales sont à prévoir (figure 6A). Les boutons cornéens non fendus subissent une augmentation significative de la perte de cellules endothéliales due à un gonflement stromal, ce qui provoque le pliage de la membrane de Descemet sur 15 jours de culture (Figure 6B), tandis que les boutons cornésaux fendus montrent une endothélium cornéen après 15 jours de culture, indiqué par des zones d'alizarin effilées teintées d'alizarine indicatifs indiquant des cellules détruites simples (figure 6C).
Figure 2 : Illustration schématique de boutons cornéens non fendus et de boutons cornésales fendus. Après l'enlèvement de 300 m de la cornée porcine, y compris l'épithélium et les principales parties du tissu stromal, l'épaisseur des boutons cornésaux fendus est réduite en faveur d'une meilleure conservation de l'endothélium cornéen en raison de la diminution de l'enflure stromal tout au long jusqu'à 15 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Densité cellulaire endothéliale (DCE) des boutons cornésaux fendus sur une quinzaine de jours. Les boutons cornéséaux fendus (n ' 40) ont montré une baisse constante. DMC le jour 1, 4 033 à 146/163 cellules/mm2 (médiane s'il s'agit de quartsiles médians de 25 %/75 %) ; jour 8, 3 850 à 167/233 cellules/mm2; jour 15, 3 650 à 200/233 cellules/mm2. Les données sont représentées comme des quartiles médians de 25 %/75 %, les moustaches représentent soit un minimum et un maximum ou 1,5 de la plage interquartile (IQR). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Paramètres morphologiques pour l'évaluation supplémentaire des dommages cellulaires et des processus de réarrangement. Photographies microscopiques de l'endothélium cornéen dans le grossissement 400x après 15 jours de culture et de coloration avec le bleu trypan et alizarin rouge S montrant (A) figures de réforme (flèches, réunion conjointe de quatre cellules ou plus / frontières cellulaires au lieu de trois), (B) formations de rosette (cercle pointillé, cellule décroissante centrale avec des formations caractéristiques de rosette de cinq cellules adjacentes ou plus) et (C) cellules teintées d'alizarin (cercles pointillés, cellules détruites). Les données (n '28) sont représentées comme des quartiles médians de 25 %/75 %. Les moustaches représentent soit un minimum et un maximum ou 1,5 de la plage interquartile (IQR). Les cercles représentent des valeurs aberrantes qui ne se trouvent pas dans l'IQR. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Endothélium cornéen non taché et taché. La couche cellulaire endothéliale vue lors de l'évaluation microscopique (grossissement 400x) dans (A) solution de sel hypotonique équilibrée (hBSS) causant un gonflement des cellules endothéliales et donc une meilleure visibilité cellulaire et (B) après coloration avec le bleu trypan et alizarin rouge S. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Aperçu des photographies de l'endothélium cornéen d'un bouton cornéen fendu cultivé à l'envers, (B) d'un bouton non cornée, et (C) d'un bouton cornéen fendu après coloration. Les photographies montrent l'endothélium cornéen après coloration avec le bleu trypan et le rouge alizarin S. (A) Les dommages endothéliaux cornésales étendus (secteur rouge) sont observés après que les boutons cornésaux fendus soient cultivés avec le côté endothélial faisant face vers le bas après un semaine de culture. (B) Augmentation significative des dommages aux cellules endothéliales dans les boutons cornéens non fendus en raison du pliage de la membrane de Descemet et de l'enflure stromale après 15 jours de culture (stries rouges). (C) Les boutons cornéséaux fendus montrent une couche cellulaire endothéliale bien préservée après 15 jours de culture montrant seulement les cellules détruites ponctuelles vues dans les zones teintées rouges alizarin. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole fournit une méthode pour la préparation des boutons cornésales fendus porcins, qui représente un modèle standardisé et à faible coût ex vivo de culture d'organe cornélial à des fins de recherche6. Les boutons cornéséaux fendus de Porc porcont ont montré une diminution de la densité endothéliale de cellules comparable aux pertes endothéliales de cellules observées dans les cornées de donneur humain cultivées dans les banques d'oeil sur une période de deux semaines6,10,11, 12.
La supériorité sur les boutons cornéens non fendus ainsi que les échantillons cornésoscléral porcins entiers a été montré précédemment6. Dans cette étude, trois groupes ont été comparés les jours 1, 8 et 15. L'endothélium cornéen de tous les groupes (boutons cornéoréoïaux, boutons cornéens non fendus, boutons cornésaux fendus) était en bon état le jour 1, représenté par une couche cellulaire endothéliale bien conservée6. Cependant, en raison de l'enflure stromale, le pliage de la membrane du Descemet a détruit de grandes zones de l'endothélium des échantillons cornéoclés entiers, de sorte qu'une évaluation représentative de la densité endothéliale cornéenne des cellules les jours 8 et 15 n'a pas pu être effectuée. Bien que l'endothélium des boutons cornéens non fendus ait été bien conservé jusqu'au jour 15, quelques plis de membrane de Descemet étaient également présents. Bien que comparée aux échantillons cornéosératal la couche endothéliale de cellules des boutons cornéens non-split était dans un meilleur état, la couche de cellules endothéliales des boutons cornéens fendus était dans un bien meilleur état. Cela peut être vu dans les paramètres quantitatifs et qualitatifs, comme la perte de cellules endothéliales dans les 15 jours de la culture a été significativement plus élevé (p - 0,041) dans les boutons cornéens non divisés (-575 - 25/250 cellules/mm2) par rapport aux boutons cornésaux fendus (-417 138/179 cellules/mm2), ce qui est conforme aux caractéristiques morphologiques déterminées évidentes dans un modèle cellulaire hexagonal plus régulier, moins de figures de réforme et de formations de rosette, ainsi que moins de cellules détruites (zones rouges d'alizarin) en split boutons cornéens6. Les pertes endothéliales de cellules endothéliales de pourcentage confirment ces résultats, car la perte de cellules de cental dans un délai de 15 jours dans les boutons cornéens non divisés et fendus est 14.89% et 10.2% (p - 0.032) respectivement6. Comme cette méthode a été validée pour une période allant jusqu'à 15 jours, elle permet des périodes d'observation plus longues que les études publiées jusqu'à présent (72 à 120 h)3,4,5.
Les améliorations dans la préservation de la couche cellulaire endothéliale, en appliquant des protocoles de culture communs également utilisés dans les banques oculaires, peuvent être attribuées uniquement à la diminution de l'enflure du stroma cornéen, puisqu'une grande partie (300 m) du stroma est enlevée avant culture6,13. Normalement, le stroma a tendance à gonfler énormément pendant la culture en raison de ses propriétés hydrophiles et des molécules incorporées dans le tissu stromal14,15. L'enflure, qui induit des forces de cisaillement et de pincement et le pliage de la membrane de Descemet, qui provoque également une pression mécanique sur l'endothélium cornéen et la perte de cellules endothéliales, sont réduits après l'ablation partielle du stroma6,10. Contrairement aux banques d'oeil, qui emploient souvent des agents osmotiques tels que dextran pour deswell cornées de donneur humain avant la transplantation, les boutons cornésaux fendus ne nécessitent pas de gonflement osmotique16,17. Comme milieu de culture complété avec dextran est connu pour être absorbé par les cellules endothéliales cornéennes et d'induire la perte cellulaire accrue7,8,9,18,19 ,20, la culture de boutons cornésiaux fendus sans dextran (ou d'autres agents osmotiques) élimine autant de facteurs toxiques négatifs que possible6. Comme le milieu de culture n'est pas complété par des additifs dans la méthode présentée, aucune influence toxique causée par une substance ajoutée n'est attendue, ce qui rend ce modèle précieux pour les études des tests de biocompatibilité de nouvelles substances.
Bien que l'endothélium cornéen soit une couche cellulaire très délicate et que la préparation de boutons cornésales fendus exige des compétences chirurgicales modérées et une manipulation douce, cette technique peut être une méthode normalisée pour travailler avec et obtenir des résultats fiables en ce qui concerne le effets de divers facteurs sur l'endothélium cornéen dans un délai très raisonnable. Néanmoins, il y a quelques étapes dans ce protocole où l'endothélium cornéen est en danger. De toute évidence, les yeux abîmés ou opaques doivent être soigneusement identifiés et jetés au début afin d'éviter d'éventuels biais. En outre, l'endothélium cornéen doit toujours être laissé intact pendant la tréphination, la dissection, l'extraction et la manipulation (p. ex., transfert de l'œil à la plaque de culture, de la plaque de culture à la plaque de culture, etc.) de boutons cornésreaux fendus afin d'éviter tout dommages mécaniques. En plaçant la suture superficiellement dans le stroma, l'endothélium peut potentiellement être pénétré si l'aiguille est accidentellement insérée trop loin dans la profondeur. Si c'est le cas, le liquide notable de la chambre oculaire antérieure passera par le canal de suture et l'œil correspondant doit être jeté. Pour éviter cela, l'aiguille doit être maintenue superficiellement dans le stroma. En outre, il faut prendre soin de diviser strictement le bouton cornéen horizontalement à l'aide du scalpel. La coupe inégale entraînera un gonflement inégal pendant la culture, causant probablement une perte accrue de cellules endothéliales.
L'examen des cellules endothéliales cornéennes non souillées dans hBSS est généralement exécuté dans les cornées de distributeur humain. Il n'y a aucune évidence des dommages significatifs de cellules provoqués par le gonflement osmotique des cellules endothéliales pour le temps choisi d'examen des boutons cornéens fendus dans hBSS3. Bien que la coloration améliore la visibilité des frontières cellulaires, le comptage non taché n'entraîne pas de résultats significativement différents de la densité cellulaire endothéliale par rapport au comptage taché21. L'avantage évident du comptage non taché est qu'il permet de multiples examens de suivi tout au long des expériences, alors que les substances de coloration sont généralement cytotoxiques et mettent fin à la période d'observation. Le comptage des souillées, cependant, reste important pour évaluer les caractéristiques morphologiques de l'endothélium. Trypan bleu met en évidence les noyaux de cellules endommagées qui semblent souvent intacts dans le comptage non taché. Alizarin rouge S améliore clairement la visibilité des bordures cellulaires et des cellules endommagées en taclant la membrane du Descemet, ce qui facilite l'évaluation de la densité cellulaire endothéliale et permet l'analyse des caractéristiques morphologiques de l'endothélium cornéen , tels que les figures de réforme, les formations de rosettes et les globules rouges alizarin (figure 4).
Une limitation majeure des boutons cornésiens fendus comme modèle ex vivo est que, tout comme les modèles in vitro, ils ne sont appropriés pour étudier les influences externes sur les cellules endothéliales cornéennes. Par conséquent, les modèles in vivo sont irremplaçables pour la recherche sur les maladies et les conditions systémiques avec un impact sur l'œil et l'endothélium cornéen. Quoi qu'il en soit, cette technique de préparation peut générer des données valides pour tester les effets de divers facteurs externes sur l'endothélium cornéen (p. ex., dans les tests de biocompatibilité de nouvelles substances)22. Suivant le principe 3R (remplacement, réduction, raffinement) pour réduire le nombre d'expériences sur les animaux vivants, cette méthode fournit un modèle de recherche adéquat pour combler davantage l'écart entre les cultures cellulaires in vitro, où les résultats sont souvent incongrus situation vivo chez l'homme, et la recherche animale, qui nécessite des efforts substantiels et soulève de plus en plus de préoccupations éthiques23.
En raison de leurs propriétés et de leur disponibilité, les yeux de porc semblent être le seul substitut adéquat pour les yeux humains à des fins de recherche. Les cornées des primates non humains ne sont pas une bonne alternative pour des raisons éthiques et la disponibilité, bien que ces animaux soient les espèces les plus proches des humains. D'autre part, les yeux des petits animaux sont tout simplement trop petits pour permettre l'enlèvement efficace de la cornée. Les yeux de porc sont comparables aux yeux humains dans la taille et montrent des propriétés semblables des cellules endothéliales cornéennes, qui est également reflétée dans la recherche traitant de la xénotransplantation future possible des cornées porcines génétiquement modifiées24, 25,26. En outre, étant un sous-produit des abattoirs, ils sont faciles à obtenir.
En conclusion, la méthode présentée à l'aide de cornées porcines offre un modèle de recherche organotypiquement hautement reproductible permettant une recherche rentable sur les cellules endothéliales cornéennes. Les futurs chercheurs peuvent utiliser des boutons cornésaux fendus pour analyser les effets de divers facteurs tels que de nouvelles substances, des techniques chirurgicales, de l'équipement et d'autres influences externes possibles où l'endothélium cornéen est d'un grand intérêt.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
La mise en place du modèle de recherche présenté a été soutenue par KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) du Ministère fédéral de l'éducation et de la recherche en Allemagne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
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